李冬琪，程江華，萬(wàn)婭瓊，尤逢惠，徐雅芫*

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省食品微生物發(fā)酵與功能應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031）

豆制品富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分[1]，蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量較大，不利于人體的消化吸收[2]，蛋白質(zhì)水解生成的小肽與游離氨基酸的溶解性、營(yíng)養(yǎng)特性都明顯優(yōu)于蛋白質(zhì)本身[3]，容易被人體腸道細(xì)胞吸收并進(jìn)入循環(huán)[4]。蛋白質(zhì)的水解液對(duì)滋味的貢獻(xiàn)可分為鮮味、甜味、苦味和無(wú)味[5]，而其中大多數(shù)呈現(xiàn)苦味，究其原因是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)大分子酶解時(shí)，肽鏈中含有的疏水性氨基酸暴露出來(lái)，接觸味蕾，產(chǎn)生苦味[6]。苦味的產(chǎn)生限制了蛋白質(zhì)水解物的應(yīng)用，因此減少、阻止和去除蛋白質(zhì)水解物的苦味，就顯得尤為重要。氨肽酶（Aminopeptidase）是一種肽鏈外切蛋白酶，能夠從多肽鏈的氨基末端由外向內(nèi)依次切斷肽鍵，使氨基酸逐個(gè)游離出來(lái)形成小肽和游離氨基酸，更利于人體吸收，增加了發(fā)酵食品的風(fēng)味[7]，且其可切除苦味肽氨端的疏水氨基酸從而去除苦味[8]。因此氨肽酶可以廣泛用于肉制品、豆制品等高蛋白食品加工工業(yè)等，減少苦味的同時(shí)也可以增加游離氨基酸，提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；并且氨肽酶還可用于蛋白序列測(cè)序的分子工具以及重組蛋白或融合產(chǎn)物的固化劑[9-11]。因此，氨肽酶在食品工業(yè)上可以與蛋白酶協(xié)同作用，增加發(fā)酵食品游離氨基酸含量，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善食品風(fēng)味。

氨肽酶廣泛存在于不同物種的生物體中，包括哺乳動(dòng)物、植物、微生物等。由于動(dòng)植物體內(nèi)成分復(fù)雜、氨肽酶含量較低，導(dǎo)致提取成本較高[12]。微生物作為氨肽酶的重要來(lái)源，其種類多、繁殖快、易于培養(yǎng)管理等優(yōu)點(diǎn)適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[13]，同時(shí)還可以應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對(duì)產(chǎn)氨肽酶微生物進(jìn)行改造，提高酶產(chǎn)量，改變酶學(xué)特性[14]。因此篩選到高產(chǎn)氨肽酶的菌種，特別是我國(guó)食品安全管理規(guī)定中可用于食品領(lǐng)域的微生物菌種尤為重要[15]。本研究以傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品為分離源，以高產(chǎn)氨肽酶為目標(biāo)分離篩選產(chǎn)酶菌株，研究固態(tài)發(fā)酵的適宜條件，通過(guò)檢測(cè)小肽及總游離氨基酸的含量評(píng)判其發(fā)酵效果，為該菌株在食品發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬：采自皖北民間作坊，放置于無(wú)菌取樣盒中于4 ℃保存；黃豆粉：由安徽合肥中黃901品種的大豆經(jīng)過(guò)研磨過(guò)100目篩所得，置于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

KH2PO4、Na2HPO4、L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺、水合茚三酮、乙二醇、三氯乙酸等（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；上海麥克林生化科技股份有限公司。

富集培養(yǎng)基：可溶性淀粉8 g/L，酵母膏2 g/L，干酪素10 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 7.0。

篩選培養(yǎng)基：乳糖10 g/L，酪蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂18 g/L，調(diào)節(jié)pH 7.0。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：牛肉膏10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10 g/L，K2HPO42 g/L，醋酸鈉5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.5 g/L，吐溫80 1 g/L，檸檬酸三鈉2 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基均在115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BCC-2000生化培養(yǎng)箱：福建九圃生物科技有限公司；ZQZY-CS8振蕩培養(yǎng)箱：北京經(jīng)日今典科技有限公司；UV-752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：東菀市譜標(biāo)試驗(yàn)器材科技有限公司；HH-WO-20L電熱恒溫水浴鍋：上海壹茗實(shí)業(yè)有限公司；LC-LX-H165A臺(tái)式高速離心機(jī)：深圳市益百順科技有限公司；BF-1000-2C電子分析天平：北京賽歐華創(chuàng)科技有限公司；BPH-9140AS高溫烘干箱：武漢森蘇科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)氨肽酶菌株的篩選

稱取1 g傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品于10 mL無(wú)菌水中，振蕩混合均勻后取2.0 mL接入富集培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)48 h，取富集培養(yǎng)菌液倍比稀釋后均勻涂布到篩選培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)。觀察菌落形態(tài)，挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落平板劃線形成單菌落，測(cè)量水解透明圈（D）與菌落直徑（d）比值（D/d），選擇比值較大的菌落，傳代純化，并分別適量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)48 h，采用LNA法測(cè)定氨肽酶活力[16]，選取氨肽酶活力最高的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 高產(chǎn)氨肽酶菌的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：通過(guò)裸眼觀察單菌落形態(tài)特征（顏色、形狀、質(zhì)地等）。用革蘭氏染色[17]，掃描電鏡觀測(cè)菌體[18-19]。

生理生化檢測(cè)：將菌株接種于固體斜面培養(yǎng)基上，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h送上海復(fù)達(dá)檢測(cè)技術(shù)集團(tuán)有限公司采用API Plus自動(dòng)判讀系統(tǒng)、CHL微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌株生理生化特性分析[20]。

分子生物學(xué)鑒定：菌株MRS平板送至上海生工生物有限公司測(cè)試，并在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源關(guān)系序列比對(duì)，最后使用程序MEGA 6構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行菌種鑒定[21-22]。

1.3.3 高產(chǎn)氨肽酶菌固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

以篩選菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液為種子液接種于裝有100 g黃豆粉的分裝袋中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，通過(guò)單因素試驗(yàn)，對(duì)固態(tài)發(fā)酵原料的初始含水量（50%、55%、60%、65%、70%），發(fā)酵時(shí)間（3 d、6 d、9 d、12 d、15 d），發(fā)酵溫度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃），接種量（2%、4%、6%、8%、10%），起始pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，分析發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與總游離氨基酸含量，以確定固態(tài)發(fā)酵顯著影響因子及水平范圍，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

（2）正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)小肽含量與總游離氨基酸有顯著影響的3個(gè)因素：含水量（A）、培養(yǎng)時(shí)間（B）、接種量（C），設(shè)計(jì)3因子3水平L9（33）正交試驗(yàn)[23-25]，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 菌株IFJ1固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for solid-state fermentation conditions optimization of strain IFJ1

1.3.4 總游離氨基酸和小肽含量的測(cè)定

總游離氨基酸的測(cè)定：茚三酮法[26]，以精氨酸作為對(duì)照品，在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定總游離氨基酸的吸光度值，根據(jù)下面公式計(jì)算總游離氨基酸含量：

1.3.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

單因素方差（analysis of variance，ANOVA）分析和差異顯著性分析均由WPS office 2018、IBM SPSS Statistics 25和GraphPad Prism 8.0.2完成，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用正交設(shè)計(jì)助手；繪圖由GraphPad Prism 8.0.2完成。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)氨肽酶菌株的篩選

從初篩平板上挑取10個(gè)周邊有透明圈的菌落，其D/d值如表2所示。

表2 初篩菌株的D/d值Table 2 D/d value of primary screened strain

由表2可知，D/d值較大的5株菌為IFJ1、IFJ7、IFJ9、IFJ18、IFJ20，對(duì)其氨肽酶活力進(jìn)行測(cè)定，產(chǎn)酶情況見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株IFJ1發(fā)酵液酶活力最高，發(fā)酵24 h的氨肽酶活力達(dá)到（1 853.98±11.37）U/mL，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的德氏乳桿菌、蠟樣芽孢桿菌、乳酸乳球菌等菌株相比[30-31]，屬于產(chǎn)氨肽酶能力較強(qiáng)的菌，故優(yōu)選菌株IFJ1進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 復(fù)篩菌株的氨肽酶活力Fig.1 Aminopeptidase activity of re-screened strains

2.2 高產(chǎn)氨肽酶菌株的鑒定

菌株IFJ1的菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色結(jié)果、掃描電鏡圖見(jiàn)圖2。

圖2 菌株IFJ1的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain IFJ1

由圖2可知，菌株IFJ1在MRS固體培養(yǎng)基上的菌落特征為圓形、微白色、濕潤(rùn)、表面凸起，邊緣光滑整齊；經(jīng)革蘭氏染色與顯微鏡觀察，菌種IFJ1的菌體形態(tài)呈球形，為革蘭氏陽(yáng)性菌。在掃描電鏡下觀察，菌體的呈現(xiàn)形式主要是單個(gè)卵圓形，長(zhǎng)度約為1.0～1.4 μm，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛。

菌株IFJ1的生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，菌株IFJ1可發(fā)酵核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉籽糖、D-阿拉伯糖醇、苦杏仁苷等，不發(fā)酵多糖，過(guò)氧化氫酶陰性。

表3 菌株IFJ1生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical identification results of strain IFJ1

對(duì)菌株IFJ1的16S rDNA基因進(jìn)行測(cè)序，在GenBank中獲得序列登錄號(hào)為OK310791。菌株IFJ1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株IFJ1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain IFJ1 based on 16S rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株IFJ1與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）LMG 17680、Pediococcus acidilacticiDSM20284、Pediococcus loliigenes等菌株聚類在同一分枝上，因此鑒定該菌株為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），菌株IFJ1專利保存編號(hào)為M2022828。研究表明，乳酸菌可產(chǎn)生包括氨肽酶、二肽酶、三肽酶和脯氨酸特異性肽酶等特異性肽酶[32-33]，這與菌株IFJ1具有氨肽酶產(chǎn)生能力的性質(zhì)一致。

2.3 菌株IFJ1固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

由圖4A可知，隨含水量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量和總游離氨基酸含量均呈先升高后降低的趨勢(shì)；含水量為55%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量最高，為（11.87±0.45）%；含水量為60%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中總游離氨基酸含量最高，為（13.13±0.12）%，但含水量為65%時(shí)，總游離氨基酸的含量為（11.84±0.11）%，較含水量為55%時(shí)（10.80%）高。推測(cè)初始含水量較低時(shí)，后期發(fā)酵底物會(huì)較干燥，不利于微生物的生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)酶；而隨著含水量達(dá)到最適值，此時(shí)菌株生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，發(fā)酵效果達(dá)到最佳；發(fā)酵底物水分含量過(guò)高容易產(chǎn)生粘黏現(xiàn)象，無(wú)法充分散熱，不利于菌體的生長(zhǎng)及酶產(chǎn)生，同時(shí)過(guò)于粘黏物料也不利微生物所產(chǎn)酶的分散，從而影響發(fā)酵效果[34-35]。因此，菌株IFJ1發(fā)酵的適宜含水量為55%～65%。

圖4 不同發(fā)酵條件對(duì)小肽含量與總游離氨基酸含量的影響Fig.4 Effect of different fermentation conditions on small peptide and total free amino acid contents

由圖4B可知，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量和總游離氨基酸含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為12 d時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與總游離氨基酸含量最高，分別為（11.38±0.08）%與（13.34±0.22）%；發(fā)酵前期發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與總游離氨基酸含量逐漸上升，推測(cè)其可能原因隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生更多的氨肽酶，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)酶解程度[36]；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞12 d后，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量開(kāi)始降低，推測(cè)可能是由于氮源逐漸被消耗，在發(fā)酵后期小肽進(jìn)入代謝循環(huán)，導(dǎo)致肽得率降低。發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌株進(jìn)入衰亡期，產(chǎn)酶量逐漸減少，且部分酶開(kāi)始失活，酶活力下降，發(fā)酵效率降低[37]。因此菌株IFJ1的適宜發(fā)酵時(shí)間范圍為9～15 d。

由圖4C可知，隨著隨接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量和總游離氨基酸含量均呈先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)接種量為6%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量達(dá)到最大為（10.21±0.06）%，總游離氨基酸含量升至最大為（12.83±0.12）%，較接種量4%和8%時(shí)分別提高了223.87%和317.69%（P＜0.05）；接種量為2%～6%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與總游離氨基酸含量逐漸上升，隨著接種量增大，可縮短菌株延滯期的時(shí)間，促使氨肽酶的形成分泌提早出現(xiàn)[38]；當(dāng)接種量在6%～10%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與總游離氨基酸含量開(kāi)始降低，可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)大，菌體初期生長(zhǎng)迅速，過(guò)早達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，不利于氨肽酶形成和積累，除此之外還會(huì)產(chǎn)生大量代謝廢物[39]。因此菌株IFJ1發(fā)酵的適宜接種量范圍為4%～8%。

由圖4D和4E可知，起始pH與發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量和總游離氨基酸含量的影響不顯著（P＞0.05）。

2.4 菌株IFJ1固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表4，試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表5。

表4 菌株IFJ1固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of L9(33)orthogonal experiments for solidstate fermentation conditions optimization of strain IFJ1

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal tests results

根據(jù)表4中的R值能夠發(fā)現(xiàn)，影響小肽含量的主要因素次序?yàn)锳＞B＞C，對(duì)總游離氨基酸含量影響的主要因素次序?yàn)镃＞A＞B。考慮到各因素的極差R值，分別確定影響兩個(gè)指標(biāo)因素的主次順序，同時(shí)結(jié)合水平結(jié)果k值確定兩個(gè)指標(biāo)下的最適因素組合[19]。發(fā)酵產(chǎn)小肽的最適組合為A3B3C3，在此條件下發(fā)酵產(chǎn)物小肽含量為10.58%，總氨基酸含量達(dá)10.24%；而發(fā)酵產(chǎn)總游離氨基酸的最適組合為A3B3C2，在此條件下發(fā)酵產(chǎn)物總氨基酸含量高達(dá)13.88%，小肽含量也達(dá)到10.30%。故綜合平衡試驗(yàn)?zāi)康呐c實(shí)際情況，選擇發(fā)酵的最佳組合為A3B3C2，即含水量為65%、發(fā)酵時(shí)間為15 d、接種量為6%。在最佳試驗(yàn)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵產(chǎn)物成品小肽含量平均值為10.57%；總游離氨基酸含量平均值為14.05%。

根據(jù)表5中的F值能夠發(fā)現(xiàn)，A、B、C三個(gè)因素對(duì)小肽及總游離氨基酸含量的影響都具有顯著性，其中含水量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)小肽含量有著極顯著影響，接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)總游離氨基酸含量有著極顯著影響。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從皖北豆醬中分離得到一株產(chǎn)氨肽酶能力強(qiáng)的菌株IFJ1，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)試驗(yàn)鑒定該菌株為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化確定IFJ1菌株固態(tài)發(fā)酵條件：發(fā)酵時(shí)間為15 d、接種量為6%、含水量為65%，在此優(yōu)化條件下，菌株IFJ1發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量達(dá)到10.57%、總游離氨基酸含量可達(dá)14.05%。利用乳酸片球菌IFJ1的高產(chǎn)氨肽酶特性進(jìn)行發(fā)酵，不僅為氨肽酶的生產(chǎn)提供了菌種來(lái)源，也可以作為優(yōu)良的氨肽酶產(chǎn)生菌應(yīng)用于發(fā)酵豆制品，以期得到風(fēng)味品質(zhì)更好的發(fā)酵食品。