牟飛燕，夏博宇，張 維，董孝元，陳 暉，常 煦，陳茂彬，方尚玲*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068；2.黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北 武漢 430068；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

白酒以“多菌共酵”體系為基礎(chǔ)，在世界各種蒸餾酒之中無出其右，白酒早已成為中國人民生活和文化的重要組成部分[1]。近期，專家提出應(yīng)促進(jìn)我國白酒國際標(biāo)準(zhǔn)的形成，讓我國白酒得到合理分類及身份界定，鼓勵(lì)中國白酒申請加入世界非物質(zhì)文化遺產(chǎn)行列以此提升中國白酒文化在國際上的地位和認(rèn)可度，我國白酒走向世界指日可待。

固態(tài)白酒釀造過程中各種微生物相互影響共同代謝發(fā)酵，在白酒的不同發(fā)酵階段中都有不同的優(yōu)勢釀造微生物菌群和菌群結(jié)構(gòu)組成，這些核心微生物不僅使發(fā)酵食品在其風(fēng)味上具有標(biāo)志性和豐富性，而且對穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量提供了重要保障[2]。清香型大曲白酒具有清雅純正的香氣特點(diǎn)，其釀造工藝的特點(diǎn)是清蒸清燒、地缸發(fā)酵、清蒸二次清[3]，大曲作為釀造過程中的糖化生香劑，其質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響著成品酒的產(chǎn)量和品質(zhì)，大曲中的微生物種類和豐度對白酒釀造至關(guān)重要，在大曲酒發(fā)酵過程中起主要作用的是酵母菌、細(xì)菌和霉菌[4]。

功能菌研究多以改善白酒風(fēng)味和質(zhì)量為目標(biāo)，由于傳統(tǒng)制曲方法容易受環(huán)境因素影響而造成曲質(zhì)量層次不齊且波動(dòng)大。因此通過篩選并利用功能菌來增進(jìn)曲的利用效果、豐富大曲的微生態(tài)環(huán)境，使得白酒特征香氣成分得到改善。近年來隨著對大曲中功能菌的不斷深入研究，已經(jīng)從大曲中分離篩選出上千種微生物菌種，許多廠家開始將有益功能菌投入傳統(tǒng)白酒的生產(chǎn)中，以提高酒醅和大曲中功能菌的種類和數(shù)量，提升白酒的質(zhì)量，并取得了階段性的成果[5-6]。

酵母菌對產(chǎn)酒、生香等方面都有重要影響，與白酒的出品率和特征香氣成分息息相關(guān)，在清香型大曲中，酵母菌的作用早已經(jīng)跨越了純粹的發(fā)酵[7]。因此，對大曲中功能性酵母菌的研究勢在必行，從清香型白酒酒曲中篩選新的優(yōu)良功能性酵母是使白酒出酒率和酒質(zhì)持續(xù)提升的重要方法[8]。酵母菌主要分為釀酒酵母和非釀酒酵母兩大類。其中起作用多的主要有釀酒酵母屬（Saccharomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、假絲酵母屬（Candida）、漢遜酵母屬（Hansenula）等[9]。

由于在實(shí)際生產(chǎn)中，酵母菌會受到高溫環(huán)境、強(qiáng)酸環(huán)境、高乙醇環(huán)境、高糖環(huán)境等脅迫條件的影響，因此生產(chǎn)中對菌株在窖池環(huán)境中的適應(yīng)性有一定的要求，高耐受性的酵母菌更有助于發(fā)酵生產(chǎn)，是進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)[8]，目前國內(nèi)外對于高耐受的酵母菌的研究著重于酒樣、醬香型白酒大曲與濃香型白酒大曲，對清香型大曲研究較少。本研究以清香型大曲中酵母菌為研究對象，采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyte-trazoliumchloride，TTC）顯色法初篩，通過發(fā)酵力、產(chǎn)酒及產(chǎn)香能力進(jìn)行復(fù)篩，并對篩選菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，旨在獲得高產(chǎn)菌株并開展對生存環(huán)境的耐受性，以獲取耐受性優(yōu)良的功能性酵母菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

清香型白酒大曲：湖北省某酒廠。

1.1.2 化學(xué)試劑

酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）、無水乙醇、葡萄糖、KH2PO4、NaOH、HCl、MgSO4、NaCl（均為分析純）、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬丁培養(yǎng)基：KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖10 g/L、瓊脂20 g/L、孟加拉紅溶液3 mL/L、蒸餾水1 000 mL。121 ℃條件下滅菌15 min。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、蒸餾水1 000 mL。121 ℃條件下滅菌15 min。

2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）培養(yǎng)基：TTC 0.5 g/L、葡萄糖5 g/L、瓊脂15 g/L、蒸餾水1 000 mL（pH調(diào)至中性）[10]。121 ℃條件下滅菌15 min。

半固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：取高粱粉700 g，加入420 mL開水，潤糧20 h后取出，在121 ℃下蒸糧30 min、加入100 mL開水復(fù)水20 min、再次于121 ℃下蒸糧20 min，再加入120%的開水。待溫度降至90 ℃時(shí)加入2%淀粉酶（2 000 U/g），88～90 ℃保溫水解1 h。待溫度降至55 ℃時(shí)加入2%糖化酶（50 000 U/g）保溫糖化1 h，糖化結(jié)束后取1滴與碘液反應(yīng)，碘液不顯藍(lán)色即為反應(yīng)徹底。過濾得濾液，調(diào)糖度為12°Bx。115 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器有限公司；WFJ 2000紫外分光光度計(jì)：江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；5977B-7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲菌懸液的制備

稱取10 g粉碎過篩后的大曲，加入90 mL的0.9%生理鹽水中，于30 ℃、120 r/min搖床振蕩20～30 min，用紗布過濾，并按10倍梯度逐級稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6。

1.3.2 酵母菌的分離及純化

分別吸取稀釋度為10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液150 μL涂布于馬丁培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。挑取生長較好的、菌落形態(tài)不一的單菌落，接種于YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)，多次劃線分離，直至得到純種單菌落。

1.3.3 酵母菌的初篩

將分離獲得的酵母菌接種于YPD固體培養(yǎng)基，在30 ℃條件下培養(yǎng)24 h后在其上覆蓋一層TTC顯色劑[11]，于30 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，取出，觀察其顏色，初篩出顯色較深、生長良好的菌株。

1.3.4 酵母菌的復(fù)篩

（1）酵母菌發(fā)酵力測定

將經(jīng)兩次劃線活化的酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)72 h獲得種子液。按1%（V/V）接種量將種子液接種于半固態(tài)高粱發(fā)酵培養(yǎng)基（模擬窖池環(huán)境），裝液量為100 mL/250 mL，28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)72 h，采用發(fā)酵栓法[12]測定發(fā)酵力。

（2）酵母菌產(chǎn)乙醇能力測定

將種子液按10%的接種量接種于半固態(tài)高粱發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃條件下培養(yǎng)7 d，采用蒸餾法[13]測定酒精度，取100 g發(fā)酵產(chǎn)物和200 mL的水于1 000 mL蒸餾瓶中，緩慢蒸餾，收集100 mL餾出液，冷卻至室溫，用酒精計(jì)法測得酒精體積分?jǐn)?shù)示值和溫度，換算成20 ℃下的酒精體積分?jǐn)?shù)。

（3）酵母菌產(chǎn)香能力的檢測

將種子液按10%（V/V）的接種量接種于半固態(tài)高粱發(fā)酵培養(yǎng)基， 裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃條件下培養(yǎng)72 h。 利用頂空固相微萃取 （headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法[14]對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析。

1.3.5 篩選酵母菌的鑒定

對具有優(yōu)良產(chǎn)酒生香的酵母菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，引物設(shè)計(jì)為通用引物：ITS1/ITS4， 引物序列分別為5'-TCC- GTAGGTGAACCTGCGG-3' 和5'-TCCTCCGCTTATTGA- TATGC-3'，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，將最終測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，并對近似序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[15]。

1.3.6 酵母菌的耐受特性分析[16-19]

將篩選菌株的種子液按5%（V/V）的接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)2 d， 用紫外分光光度計(jì)在波長600 nm處測定發(fā)酵液OD600nm值， 考察菌株在溫度（27℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃、42 ℃）、pH值（2、3、4、5、6、7）、葡萄糖質(zhì)量濃度（50 g/L、100 g/L、200 g/L、400 g/L、600 g/L）及乙醇體積分?jǐn)?shù)（3%、6%、9%、12%、15%）條件下的生長情況。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019、SPSS Statistics 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，柱狀圖與折線圖由GrapHPad Prism 9.0繪制而成、揮發(fā)性化合物的熱圖及Venn圖利用Chiplot和Hiplot軟件繪制，酵母菌基于18S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹在Mega-X軟件中制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 清香型大曲中酵母菌的分離純化

對培養(yǎng)48 h的稀釋涂布的平板進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，根據(jù)菌株在馬丁培養(yǎng)基上的不同菌落特征，共分離獲得22株酵母菌，從細(xì)胞形態(tài)上分為橢圓形、卵圓形和有假絲的卵圓形三大類，其繁殖方式均為出芽生殖，具體菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)見表1。

表1 大曲中篩選酵母菌的菌落和細(xì)胞形態(tài)Table 1 Colony and cell morphology of screened yeasts from Daqu

2.2 酵母菌TTC顯色初篩

根據(jù)菌株產(chǎn)酒能力越強(qiáng)，TTC顯色越明顯的原理，22株分離菌株顯色反應(yīng)結(jié)果見表2。

表2 分離酵母菌的TTC初篩結(jié)果Table 2 TTC preliminary screening results of 22 isolated yeast strains

由表2可知，根據(jù)TTC初篩結(jié)果，從22株酵母菌中篩選得到7株菌株（A-2、B-6、C-2、C-3、D-10、D-11、YC-3）菌落呈紅色或深紅色。 因此，選擇這7株菌株進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵力、產(chǎn)酒力、產(chǎn)香能力研究。

2.3 酵母菌的復(fù)篩

2.3.1 酵母菌的發(fā)酵力與產(chǎn)酒力

分離出的酵母菌的發(fā)酵力與產(chǎn)酒力測定結(jié)果見圖1。

圖1 7株酵母菌的發(fā)酵力（A）與產(chǎn)酒力（B）測定結(jié)果Fig.1 Determination results of fermentation power (A) and alcohol production capacity (B) of 7 yeast strains

由圖1A可知，7株酵母菌的發(fā)酵力在52～106 g（CO2）/（10 mL·72 h）之間，其中菌株B-6的發(fā)酵力最高，達(dá)到了106 g（CO2）/（10 mL·72 h），菌株C-3和YC-3次之，菌株A-2、C-2、D-10、D-11的發(fā)酵力較低，菌株B-6、C-3與YC-3

由圖1B可知，將TTC初篩選擇出的7株酵母菌培養(yǎng)7 d，采用蒸餾法測其產(chǎn)酒力，其中菌株C-3的產(chǎn)酒能力顯著高于其他酵母菌（P＜0.05），單菌發(fā)酵產(chǎn)物的酒精度為5.15%vol，屬于目前較高水平[20-21]。菌株B-6酒精度為3.02%vol，其余5株菌產(chǎn)酒能力均不高。

2.3.2 酵母菌的產(chǎn)香能力

白酒中含有1 500多種微量成分，如酯類、醇類、酸類、醛酮類、吡嗪類等，這些微量成分雖然含量低，但是其種類與比例對白酒最終的風(fēng)味及口感的影響非常大。不同品種的酒曲，不同發(fā)酵條件，產(chǎn)生的香氣成分的種類和含量都不同，以此造就各種酒的不同風(fēng)味[22]。

通過HS-SPME-GC-MS法對7株酵母菌的半固態(tài)高粱發(fā)酵產(chǎn)物的香氣成分進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，7株酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物共檢測出54種香氣成分，包括24種酯類、10種醇類、9種酸類、6種醛酮類、5種其他類。

圖2 7株酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物香氣成分分析Fig.2 Analysis of aroma components in 7 yeast strains fermentation products

由圖2A可知，菌株B-6產(chǎn)酯類物質(zhì)相對含量占比最高，達(dá)到86.7%，酯是具有芳香性氣味的揮發(fā)性化合物，是白酒中的主要香味成分，對形成各種酒的典型風(fēng)格起著關(guān)鍵性作用[23]，另外菌株D-10、D-11、C-3產(chǎn)香氣種類較多，分別有32種、27種、20種。由圖2B可知，7株酵母菌共有香氣成分為苯乙醇和乙酸苯乙酯兩種，其中苯乙醇為玫瑰花香、月季花香、花粉香味，能提高酒體的風(fēng)味與品質(zhì)，是十分重要的天然香味物質(zhì)[24]，菌株D-10、D-11擁有獨(dú)特的香氣成分種類較多。由圖2C可知，菌株B-6的乙酸苯乙酯和乙酸異戊酯相對占比顯著高于其他菌種，乙酸苯乙酯有甜味，帶有玫瑰花香和粉香的蜂蜜樣香氣，類似蘋果樣的果香，并帶有可可和威士忌樣的香韻[25]。乙酸異戊酯具有香蕉和梨的氣味，菌株B-6的發(fā)酵產(chǎn)物的確具有強(qiáng)烈的熟香蕉果味。菌株B-6、D10、D11產(chǎn)乙酸乙酯相對占比均在10%左右，這與清香型白酒以乙酸乙酯為主體香味相符合。菌株C-3主要產(chǎn)醇類物質(zhì)，相對含量占比達(dá)60%，菌株C-3還產(chǎn)法尼醇，是清香型白酒的關(guān)鍵萜烯類化合物，主要由釀酒酵母產(chǎn)生[26]。

對初篩得到的7株酵母菌的發(fā)酵力、產(chǎn)酒力以及產(chǎn)香能力進(jìn)行檢測，其中菌株B-6與C-3的發(fā)酵力和產(chǎn)酒力水平在7株酵母菌中均較高，菌株C-3、D10與D11產(chǎn)香種類多，菌株B-6產(chǎn)酯種類多且有特殊香氣。綜上，選擇菌株B-6、C-3、D10與D11進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.4 酵母菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對高發(fā)酵力和產(chǎn)酒能力強(qiáng)的菌株B-6與C-3、產(chǎn)香能力強(qiáng)的菌株D-10和D-11進(jìn)行菌種鑒定，四株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 篩選酵母菌基于18S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of screened yeasts based on 18S rRNA gene sequence

由圖3可知，菌株B-6與費(fèi)比恩塞伯林德納氏酵母（Cyberlindnera fabianii）、菌株C-3與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、菌株D-10與扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、菌株D-11與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）聚于一枝，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)特征，菌株B-6被鑒定為費(fèi)比恩塞伯林德納氏酵母（Cyberlindnera fabianii）、菌株C-3被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、菌株D-10被鑒定為扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、菌株D-11被鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

2.5 功能酵母菌耐受性

在制曲和釀酒過程中，其溫度是在波動(dòng)的，選育優(yōu)良的耐高溫菌株是實(shí)現(xiàn)某些工藝的前提[27]。由圖4A可知，4株酵母菌均在30 ℃或者33 ℃時(shí)生長狀況更好，其中菌株B-6的高溫耐受性最好，在33 ℃的生長狀況比30 ℃更好；后續(xù)隨著溫度的升高，生長狀況逐漸降低；在39 ℃高溫時(shí)，生長狀況明顯高于其他3株酵母菌。耐高溫能力最差的是菌株D-10，在39 ℃以上高溫時(shí)，基本不生長。

圖4 4株功能酵母的耐受性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Tolerance tests results of 4 functional yeast strains

通常情況下，高酸環(huán)境不利于酵母菌的生長繁殖[28]。由圖4B可知，菌株B-6和C-3在pH值為3時(shí)生長狀況依然良好，在pH值為2時(shí)亦可以生長，而菌株D-10和D-11在pH值為6之后生長狀況隨著酸度升高急速下降，相對而言，菌株B-6和C-3的耐酸性更好。

在固態(tài)白酒的發(fā)酵過程中，隨著酒精度的升高，酵母的生長繁殖會受到抑制，酵母會產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)來保證正常的生長代謝，而酵母的應(yīng)對機(jī)制也稱作酵母的酒精耐受性，酵母菌是固態(tài)白酒釀造時(shí)產(chǎn)酒精最主要的菌種，所以具有一定的乙醇耐受性十分必要[29]。由圖4C可知，4株酵母菌均耐體積分?jǐn)?shù)為9%乙醇，其中菌株C-3的耐酒精能力最好，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為9%～15%之間的生長狀況降低較少，OD600nm值只降低了52.5%，而另外三株酵母菌OD600nm值降低了80%左右，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，菌株C-3與其余幾株酵母比較，生長狀況較好。

糖是發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的主要基質(zhì)和酵母賴以生存的能源物質(zhì)，但是高濃糖環(huán)境對酵母生長繁殖有抑制作用，高滲透壓會導(dǎo)致酵母細(xì)胞水分流失[30]。由圖4D可知，4株酵母在葡萄糖質(zhì)量濃度為50～600 g/L時(shí)，隨著環(huán)境中糖度的升高，生長狀況變差，其中菌株C-3在高糖環(huán)境下的生長狀況略好于其他三株酵母菌，菌株B-6的耐高糖能力相對較弱，葡萄糖質(zhì)量濃度在600 g/L時(shí)，生長狀況差，葡萄糖質(zhì)量濃度在400～600 g/L時(shí)，其OD600nm值降低了83.9%。

綜上，功能性酵母菌B-6對高溫（39 ℃）和強(qiáng)酸環(huán)境（pH值為3）具有高耐受性、在12%vol高乙醇環(huán)境下可以生存，具有較好的耐乙醇能力；菌株C-3在高溫39 ℃、酒精度12%vol、pH值為3、葡萄糖質(zhì)量濃度400 g/L的環(huán)境下均可以生存。因此，菌株B-6和C-3耐受性比其他兩株菌更強(qiáng)。

3 結(jié)論

本研究從清香型大曲中篩選得到4株菌，通過形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定，菌株B-6為費(fèi)比恩塞伯林德納氏酵母（Cyberlindnera fabianii）、菌株C-3為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、菌株D-10為扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、菌株D-11為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。通過耐受性實(shí)驗(yàn)，獲得了耐受性良好菌株B-6和C-3。高耐受性的酵母菌可以在不同發(fā)酵環(huán)境下作用，不但可以有效解決釀酒糖化過程前的酸堿調(diào)節(jié)等問題，減少釀酒過程中不必要的環(huán)節(jié)，降低釀酒生產(chǎn)成本，還可以有效提高工業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)酒率、增強(qiáng)其香氣和品質(zhì)；而菌株D-10、D-11作為生香酵母，雖然耐受性一般，但產(chǎn)獨(dú)特香氣成分種類較多，后續(xù)可從此方向?qū)ζ溥M(jìn)行研究。