石穎慧，王鐵山，王煊，盧濤

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院；3 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院呼吸科

WHO 國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）的GLOBOCAN項(xiàng)目分析報(bào)告［1］表明，2020 年全球新增肺癌患者約220 萬(wàn)例，占全部新發(fā)惡性腫瘤的11.4%。肺癌也是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一［2］。肺癌的治療方法分為外科治療、放射治療和藥物治療，藥物治療包括化學(xué)療法、分子靶向治療和免疫治療等［3］。尋找高效安全的肺癌治療藥物是世界范圍內(nèi)的研究熱點(diǎn)。多肽類藥物可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮直接抗腫瘤作用，也可通過(guò)增強(qiáng)和激發(fā)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答、抑制腫瘤血管生成等發(fā)揮間接抗腫瘤作用［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn)，線蟲中分離的Mere15 可能通過(guò)提高人肺腺癌細(xì)胞活性氧簇（ROS）、抑制癌細(xì)胞的線粒體膜電位，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。脾氨肽口服液是一種免疫調(diào)節(jié)劑，主要是從健康牛脾臟中提取的多肽氨基酸和多肽核苷酸混合物，目前主要用于慢性肝炎和過(guò)敏性鼻炎的治療中［6］。研究［7-8］發(fā)現(xiàn)，脾氨肽口服液中的四肽活力成分塔夫素可以通過(guò)提高巨噬細(xì)胞吞噬作用，發(fā)揮抗感染、抗腫瘤作用。脾氨肽口服液對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡遷移的影響及其可能作用機(jī)制，目前相關(guān)研究較少。2023年1—5月，我們觀察了脾氨肽口服液對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖凋亡遷移的影響，并進(jìn)一步探討脾氨肽口服液的可能作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 A549 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。脾氨肽口服液（北京第一生物化學(xué)藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H10950310，規(guī)格為10 mL：10 mg 多肽；0.1 mg 核苷酸），磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素（P/S）溶液和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco，細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒Cell counting Kit-8CCK-8、JC-1 線粒體膜電位熒光探針及DCFH-DA ROS 熒光探針購(gòu)自北京蘭博利德，Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)NUAIRE，高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo，冷凍干燥機(jī)購(gòu)自德國(guó)CHRIST，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek，InCucyte S3 長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像及功能分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Essen Bioscience，流式細(xì)胞分析儀LSRFortessa SORP購(gòu)自美國(guó)BD。

1.2 A549 細(xì)胞分組及脾氨肽口服液給予方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，在含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液的DEME 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 天換液一次，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，胰蛋白酶消化后傳代備用。脾氨肽口服液指導(dǎo)用量10 mL/天，即多肽濃度1.0 mg/mL，本研究將其設(shè)為中劑量濃度，0.5 倍濃度為低劑量濃度（0.5 mg/mL），2 倍為高劑量濃度（2 mg/mL）。將細(xì)胞分為四組，1、2、3 組分別在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中加入0.5、1.0 及2.0 mg/mL 脾氨肽口服液，4組不做任何處理。

1.3 各組細(xì)胞細(xì)胞增殖情況觀察 培養(yǎng)24 h 時(shí)采用CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。取各組細(xì)胞，加入CCK-8 試劑后培養(yǎng)1 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)量各組細(xì)胞波長(zhǎng)450 nm處的光密度OD值，根據(jù)OD值計(jì)算各組細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=［A（加藥孔OD 值）-A（空白孔OD 值）］/［A（對(duì)照孔OD 值）-A（空白孔OD 值）］。干預(yù)后即刻（培養(yǎng)0 h）將各組細(xì)胞置于IncuCyte S3活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像與分析儀器（可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)程動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）中觀察各組細(xì)胞的增殖情況。每3 h拍照記錄1 次，連續(xù)監(jiān)測(cè)36 h，由InCucyte 內(nèi)置算法利用拍攝圖片測(cè)算細(xì)胞匯合度（衡量細(xì)胞數(shù)量的變化，代表細(xì)胞增殖情況）。以培養(yǎng)0 h時(shí)細(xì)胞匯合度為基準(zhǔn)進(jìn)行歸一化，測(cè)算各組培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 時(shí)的細(xì)胞匯合度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3 次，取平均值。

1.4 各組細(xì)胞遷移情況觀察 培養(yǎng)0 h時(shí)取各組細(xì)胞，立刻放入InCucyte S3 長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像及功能分析系統(tǒng)，每2 h 拍照記錄1 次，連續(xù)拍照36 h。由InCucyte 內(nèi)置算法利用拍攝圖片計(jì)算相對(duì)劃痕區(qū)域密度（某一個(gè)時(shí)間點(diǎn)劃痕面積占初始劃痕面積百分比，代表細(xì)胞遷移能力）。以培養(yǎng)0 h 時(shí)細(xì)胞相對(duì)劃痕區(qū)域密度為基準(zhǔn)進(jìn)行歸一化，測(cè)算各組培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h時(shí)各組細(xì)胞相對(duì)劃痕區(qū)域密度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3 次，取平均值。

1.5 各組細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。培養(yǎng)48 h 時(shí)取各組細(xì)胞，用不含EDTA 的0.25%胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，400 g 離心5 min，棄去上清液，加入300 μL Binding Buffer 重懸細(xì)胞并收集培養(yǎng)上清中的細(xì)胞。加入5 μL 的Annexin V-FITC，避光室溫孵育15 min，在上機(jī)前5 min 再加入5 μL 的PI進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀測(cè)算各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.6 各組細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè) 培養(yǎng)24 h 時(shí)取各組細(xì)胞，600 g離心5 min后棄上清，加入0.25%的胰蛋白酶消化下孔板上的細(xì)胞，400 g 離心5 min 后棄上清。使用JC-1 線粒體膜電位熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位，0.5 mL 的JC-1 工作液重懸細(xì)胞，37 ℃孵育15 min，400 g 離心5 min 后棄上清，PBS 洗滌2次，加入500 μL 的PBS 重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，選擇525 nm 激發(fā)，PE 通道檢測(cè)以及490 nm 激發(fā)，F(xiàn)ITC 通道檢測(cè)分析測(cè)算線粒體膜電位。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.7 各組細(xì)胞ROS 檢測(cè) 培養(yǎng)24 h 時(shí)取各組細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化，400 g 離心5 min，用無(wú)血清培養(yǎng)液將DCFH-DA 稀釋至終濃度為10 μmol/L，每個(gè)細(xì)胞樣品加入1 mL 稀釋好的DCFH-DA 工作液重懸細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。待孵育完成后用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，使用流式細(xì)胞儀測(cè)算DCFH-DA 的熒光值（代表細(xì)胞ROS相對(duì)表達(dá)量）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以-x± s 表示，組間比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)或方差分析（ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較 培養(yǎng)24 h 時(shí)1、2、3、4 組細(xì)胞的細(xì)胞活力分別為80.62% ± 5.30%、49.10% ± 10.03%、39.03% ± 6.37%、100.00% ±6.17%。與4組比較，培養(yǎng)24 h時(shí)1、2、3組細(xì)胞的細(xì)胞活力低（P均＜0.05），隨脾氨肽口服液濃度上升，細(xì)胞的細(xì)胞活力逐漸下降，且呈劑量依賴性（F=91.659，P＜0.05）。

培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 時(shí)1 組細(xì)胞匯合度分別為1.01 ± 0.02、1.11 ± 0.02、1.22 ±0.02、1.32 ± 0.03、1.42 ± 0.02、1.53 ± 0.04、1.64 ± 0.04、1.73 ± 0.04、1.84 ± 0.06、1.94 ±0.06，培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 時(shí)2 組細(xì)胞匯合度分別為1.01 ± 0.03、1.11 ± 0.03、1.22 ± 0.05、1.31 ± 0.04、1.39 ± 0.04、1.46 ±0.04、1.53 ± 0.07、1.59 ± 0.08、1.64 ± 0.08、1.67 ± 0.11，培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h時(shí)3組細(xì)胞匯合度分別為1.01 ± 0.01、1.05 ± 0.01、1.08 ± 0.02、1.1 ± 0.02、1.1 ± 0.02、1.1 ± 0.02、1.05 ± 0.05、0.95 ± 0.15、0.89 ± 0.17、0.87 ±0.13，培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 時(shí)4 組細(xì)胞匯合度分別為1.09 ± 0.00、1.19 ± 0.01、1.30 ± 0.02、1.41 ± 0.02、1.52 ± 0.03、1.63 ±0.04、1.73 ± 0.03、1.84 ± 0.05、1.91 ± 0.07、1.98 ± 0.12。與4 組比較，各時(shí)間點(diǎn)2、3 組細(xì)胞的細(xì)胞匯合度低（P均＜0.05）。隨脾氨肽口服液濃度上升，培養(yǎng)24 h時(shí)細(xì)胞的細(xì)胞匯合度逐漸降低，呈劑量依賴性（F= 76.110，P＜0.05）。

2.2 各組細(xì)胞遷移情況比較 培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 時(shí)1 組細(xì)胞相對(duì)劃痕區(qū)域密度分別為8.51 ± 4.54、9.36 ± 4.51、10.32 ± 4.15、11.6 ± 3.76、12.14 ± 3.40、13.03 ±3.57、13.85 ± 3.65、14.65 ± 3.55、15.22 ± 3.46、15.81 ± 3.26、16.72 ± 3.03、17.53 ± 2.93、18.84 ±3.08、19.92 ± 3.23、27.23 ± 4.60，培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 時(shí)2 組細(xì)胞相對(duì)劃痕區(qū)域密度分別為9.71 ± 4.05、11.22 ±4.07、12.25 ± 3.78、13.47 ± 3.84、15.04 ± 4.11、17.05 ± 4.06、19.19 ± 4.37、21.74 ± 4.70、23.82 ±5.00、26.22 ± 5.42、28.78 ± 5.67、31.49 ± 5.79、34.1 ± 6.08、36.6 ± 6.70、40.81 ± 7.71，培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 時(shí)3 組細(xì)胞相對(duì)劃痕區(qū)域密度分別為14.54 ± 4.65、15.84 ± 4.60、16.88 ± 4.25、18.2 ± 3.94、19.98 ±4.13、20.99 ± 3.56、23.07 ± 3.60、25.36 ± 3.30、27.76 ± 2.84、30.18 ± 3.13、32.69 ± 3.09、35.64 ±3.03、38.52 ± 3.35、41.22 ± 3.51、46.15 ± 4.83，培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h時(shí)4組細(xì)胞相對(duì)劃痕區(qū)域密度分別為18.91 ± 2.74、20.39 ± 2.42、21.66 ± 2.41、23.05 ± 1.74、25.01 ±1.89、27.44 ± 1.11、29.95 ± 1.65、33.03 ± 1.94、35.71 ± 2.40、38.74 ± 2.92、41.97 ± 2.60、44.70 ±2.78、47.59 ± 3.10、51.18 ± 3.34、56.28 ± 2.64。

與4組比較，各培養(yǎng)時(shí)間1、2、3組細(xì)胞相對(duì)劃痕區(qū)域密度?。≒均＜0.05），隨脾氨肽口服液濃度上升，培養(yǎng)36 h 時(shí)細(xì)胞相對(duì)劃痕區(qū)域密度逐漸降低（F=76.110，P＜0.05）。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 培養(yǎng)48 h 時(shí)1、2、3、4組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率分別為12.08% ± 1.56%、50.07% ± 1.64%、71.03% ± 2.75%、3.82% ±0.49%，與4 組比較，培養(yǎng)48 h 時(shí)1、2、3 組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率高（P均＜0.05）。隨脾氨肽口服液濃度上升，培養(yǎng)48 h時(shí)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率逐漸升高，呈劑量依賴性（P均＜0.05）。

2.4 各組細(xì)胞線粒體膜電位比較 培養(yǎng)24 h 時(shí)1、2、3、4 組細(xì)胞的線粒體膜電位分別為0.79 ±0.18、0.70 ± 0.24、0.65 ± 0.11、1.11 ± 0.06，與4組比較，培養(yǎng)24 h 時(shí)1、2、3 組細(xì)胞的線粒體膜電位低（P均＜0.05）。隨脾氨肽口服液濃度上升，培養(yǎng)24 h時(shí)細(xì)胞的線粒體膜電位逐漸下降，呈劑量依賴性（P均＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞ROS 相對(duì)表達(dá)量比較 培養(yǎng)24 h時(shí)1、2、3、4 組細(xì)胞的ROS 相對(duì)表達(dá)量分別為5 541.67 ± 390.69、6 758.50 ± 235.87、13 534.00 ±710.99、5 458.33 ± 605.87，與4 組比較，培養(yǎng)24 h時(shí)2、3 組細(xì)胞的ROS 相對(duì)表達(dá)量高（P均＜0.05）。與2 組比較，培養(yǎng)24 h 時(shí)3 組細(xì)胞ROS 相對(duì)表達(dá)量高（P＜0.05）。

3 討論

肺癌的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程［9］，目前肺癌療法的總體治療效果均不佳［3］。抗癌肽是目前在發(fā)展中的抗癌藥物的一種類型，很多抗癌肽已經(jīng)進(jìn)入臨床階段甚至已經(jīng)獲批上市［10］。提取自牛脾臟的多肽具有多種免疫活力，不僅可以緩解化療引起的免疫抑制［11］、改善小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的造血功能損傷［12］還可以可以通過(guò)ROS 促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡［13］。同樣主要成分是提取自牛脾臟的多肽類藥物，脾氨肽口服液也因其抗癌活力受到了關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)而脾氨肽口服液不僅可以改善乳腺癌患者的預(yù)后還可以和含鉑藥物聯(lián)合治療結(jié)直腸癌［14］。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)脾氨肽口服液抑制肺癌的研究甚少，結(jié)合多肽類藥物多通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式，本研究通過(guò)檢測(cè)A549細(xì)胞的活力、凋亡以及遷移能力探究脾氨肽口服液抗肺癌的活力，并通過(guò)檢測(cè)JC-1 以及細(xì)胞內(nèi)ROS 的變化，評(píng)價(jià)脾氨肽口服液對(duì)肺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響，進(jìn)一步解釋其抗癌作用的機(jī)制。

CCK-8 試劑常被用來(lái)測(cè)定細(xì)胞的活力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性等，在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定的吸光度越高，則細(xì)胞活力越強(qiáng)。從CCK-8 實(shí)驗(yàn)可發(fā)現(xiàn)脾氨肽口服液可以抑制人肺癌上皮細(xì)胞A549的活力，并且隨著脾氨肽口服液給藥濃度的升高，細(xì)胞的活力下降的更加明顯，這也初步說(shuō)明了脾氨肽口服液具有一定的抗肺癌作用。

為進(jìn)一步證實(shí)脾氨肽口服液對(duì)肺癌的抑制作用，使用InCucyte S3對(duì)給藥后A549細(xì)胞增殖情況進(jìn)行了實(shí)時(shí)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在給予脾氨肽口服液處理后的30 h內(nèi)A549細(xì)胞的細(xì)胞匯合度明顯下降，這代表著A549細(xì)胞的增殖受到了抑制，并且隨著劑量的增加，抑制的趨勢(shì)更加明顯，說(shuō)明脾氨肽口服液可以抑制人肺癌上皮細(xì)胞A549 細(xì)胞的增殖。此結(jié)果說(shuō)明脾氨肽口服液可以抑制人肺癌上皮細(xì)胞A549 細(xì)胞的增殖，也進(jìn)一步證實(shí)脾氨肽口服液確實(shí)有抗癌活力。

惡性的腫瘤細(xì)胞具有經(jīng)淋巴道、血管或者體腔從原發(fā)部位到達(dá)機(jī)體的其他部位繼續(xù)生長(zhǎng)的特點(diǎn)，因此在評(píng)價(jià)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用時(shí)還會(huì)評(píng)價(jià)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移能力的一種方式，通過(guò)InCucyte S3 對(duì)脾氨肽口服液處理的A549 細(xì)胞相對(duì)劃痕區(qū)域密度進(jìn)行監(jiān)測(cè)與分析，發(fā)現(xiàn)脾氨肽口服液處理組A549細(xì)胞的相對(duì)劃痕區(qū)域密度明顯低于正常培養(yǎng)組，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。這表明發(fā)現(xiàn)脾氨肽口服液可以抑制A549細(xì)胞的遷移，進(jìn)一步說(shuō)明脾氨肽口服液不僅抑制了肺癌細(xì)胞的活力，還可以抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，在治療肺癌中可以起到一定的作用。

綜合以上的活力實(shí)驗(yàn)、增殖實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以得出結(jié)論：脾氨肽口服液可以抑制人肺癌細(xì)胞A549 細(xì)胞的活力、增殖并降低其遷移能力，表明脾氨肽口服液有抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)展的能力，能夠在肺癌治療中起到一定的作用。但其作用機(jī)制尚不明確，因此，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步對(duì)其抑癌作用的原理和機(jī)制進(jìn)行探究。

抗腫瘤藥物的作用方式主要有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞壞死、抑制癌細(xì)胞DNA 合成等方式。大多數(shù)抗癌藥物是通過(guò)凋亡途徑抑制癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)，結(jié)合多肽類藥物多通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式抑制癌癥，推測(cè)脾氨肽口服液可能通過(guò)凋亡途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制。隨著細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)部小葉上的磷脂酰絲酸會(huì)外翻到外部小葉，暴露在細(xì)胞外部，使用膜連蛋白（Annexin V）的熒光耦連物和活細(xì)胞非滲透染料PI 雙染對(duì)外翻的磷脂酰絲酸檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)脾氨肽口服液處理24 h后磷脂酰絲酸外翻的A549 細(xì)胞數(shù)量增多，且呈現(xiàn)濃度依賴，這說(shuō)明脾氨肽口服液可以促進(jìn)A549 細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞的凋亡是一個(gè)高度受控的復(fù)雜過(guò)程，是多個(gè)信號(hào)通路共同參與的結(jié)果，無(wú)法僅通過(guò)一種實(shí)驗(yàn)方式對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行全面的檢測(cè)，需要對(duì)脾氨肽口服液促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的途徑進(jìn)行進(jìn)一步探索。

細(xì)胞凋亡的途徑分為內(nèi)在途徑和外在途徑，其內(nèi)在途徑主要與線粒體相關(guān)，也被稱為線粒體途徑。另一個(gè)細(xì)胞凋亡的典型特征就是線粒體活力受損。相較于磷脂酰絲酸的外翻，線粒體膜電位的改變是細(xì)胞凋亡的早期事件。進(jìn)一步使用陽(yáng)離子染料JC-1 對(duì)線粒體膜電位的變化進(jìn)行了檢測(cè)，在線粒體中JC-1 會(huì)表現(xiàn)出電位依賴性的積累，當(dāng)JC-1 染色后檢測(cè)到的紅色/綠色熒光強(qiáng)度比降低時(shí)，提示細(xì)胞內(nèi)線粒體功能下降，線粒體功能與細(xì)胞氧化應(yīng)激密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)脾氨肽口服液處理24 h 后的A549 細(xì)胞線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)脾氨肽口服液可以促進(jìn)A549細(xì)胞線粒體膜電位的去極化，一方面證實(shí)脾氨肽口服液促進(jìn)了人肺癌上皮細(xì)胞A549的凋亡，另一方面也說(shuō)明其促腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與氧化應(yīng)激相關(guān)。

ROS 的過(guò)量積累會(huì)引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷、凋亡甚至壞死。ROS 主要來(lái)源于線粒體，其在線粒體中的產(chǎn)生主要是通過(guò)細(xì)胞呼吸鏈產(chǎn)生的，它是細(xì)胞凋亡的一個(gè)早期事件。細(xì)胞內(nèi)的ROS 和線粒體之間的關(guān)系是一個(gè)正反饋，當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞內(nèi)的線粒體會(huì)釋放ROS，而環(huán)境中過(guò)高的ROS又會(huì)促使細(xì)胞凋亡［15］。有研究［16］發(fā)現(xiàn)從線蟲中分離出的多肽可以升高細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平，破壞線粒體膜電位，誘導(dǎo)人紅白血病K526細(xì)胞凋亡。假設(shè)脾氨肽口服液可能也是通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平促進(jìn)線粒體膜電位去極化，進(jìn)一步導(dǎo)致肺癌細(xì)胞凋亡，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。DCFH-DA的熒光值與細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平呈正比，脾氨肽口服液培養(yǎng)24 h后A549 細(xì)胞DCFH-DA 的熒光值升高了，說(shuō)明其促進(jìn)了A549 細(xì)胞內(nèi)ROS 的釋放，并且隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞內(nèi)ROS 升高的水平也隨之升高。證實(shí)了脾氨肽口服液是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的升高進(jìn)一步破壞線粒體膜電位并實(shí)現(xiàn)使肺癌細(xì)胞凋亡的。

綜上所述，通過(guò)觀察脾氨肽口服液對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖、凋亡、遷移的影響，證實(shí)脾氨肽口服液可以抑制A549細(xì)胞的活力，進(jìn)一步研究表明脾氨肽口服液是通過(guò)ROS 相關(guān)的線粒體途徑來(lái)誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的凋亡，抑制A549細(xì)胞的活力、增殖及遷移，發(fā)揮抗肺癌作用。