李 鑫，崔佳林，趙 丹, 章廣玲，李彩霞，崔立華，蘆美華，張淑坤，蘭 濤

原發(fā)性肝癌起病隱匿，早期臨床癥狀大多無特異性，故確診時多屬晚期，失去手術(shù)時機。盡管其治療手段不斷增多，但療效不理想，其五年生存率仍低于18%[1]。探索安全有效的治療方法仍是目前臨床的迫切需求。腫瘤細胞的免疫逃逸在肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，CD8+T 淋巴細胞被誘導(dǎo)凋亡是腫瘤細胞免疫逃逸的主要機制[2]。程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）通過與其配體（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）結(jié)合，是誘導(dǎo)CD8+T 淋巴細胞凋亡、調(diào)節(jié)T 細胞免疫功能的重要信號分子[3]。PD-L1 除了在免疫細胞廣泛表達，還在肝癌細胞表達。研究證實，PD-1 的陽性表達在肝癌的不同病理分級中無差異，但PD-L1的陽性表達率在中、低分化肝癌中，較在高分化肝癌升高，肝癌細胞的PD-L1 陽性表達與肝癌患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)，提示PD-L1 的表達可以作為判斷肝癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)[4]。因此，靶向調(diào)節(jié)PDL1 的研究有望為腫瘤治療提供新策略。

鱉甲煎丸出自《金匱要略》。臨床研究表明，鱉甲煎丸對治療肝癌有一定療效，它能減緩肝纖維向肝癌發(fā)展[5-6]，但其作用機制有待深入研究。本研究使用高脂肪、高果糖和高膽固醇飲食，結(jié)合每周腹腔注射低劑量四氯化碳（CCl4），復(fù)制小鼠肝癌模型，考察鱉甲煎丸對肝癌的防治作用，并檢測肝組織PD-L1 表達，以期為闡明鱉甲煎丸治療肝癌的作用機理提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 高脂飼料由北京博泰宏達生物技術(shù)有限公司提供，CCl4購自南京化學(xué)試劑股份有限公司，鱉甲煎丸為國藥集團中聯(lián)藥業(yè)有限公司商品，PD-L1 抗體為美國Abcam 公司產(chǎn)品。高效RIPA裂解液（試劑盒內(nèi)含PMSF）購自北京索萊寶科技有限公司，BCA 蛋白定量試劑盒為美國Thermo Scientific 公司產(chǎn)品，免疫檢測化學(xué)發(fā)光底物為美國Millipore 公司產(chǎn)品。Trizol 和SYBRGreen RT-qPCR Kit 分別為美國Promega 和Thermo 公司產(chǎn)品。

1.2 高脂飲食配方 每千克高脂飼料含酪蛋白195 g，DL-蛋氨酸3.0 g，蔗糖405.36 g，無水乳脂肪210 g，膽固醇12.5 g，纖維素50 g，礦物質(zhì)4 g，維生素10 g，乙氧喹啉0.04 g，食用色素（綠）0.1 g。

1.3 模型制備、分組及給藥 健康雄性SPF 級C57BL/6 小鼠24 只，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司（SCXK 京2019-0010）。按隨機數(shù)字表分為對照組和模型組，對照組8 只，模型組16 只；適應(yīng)性喂養(yǎng)后，模型組參照Tsuchida 等[7]的方法給予高脂飲食，飲用水含有23.1 g/L 果糖和18.9 g/L 葡萄糖，并每周（飲食造模開始時即進行首次注射） 按每克體質(zhì)量5.0 μL 的劑量，腹腔注射CCl4（按體積1∶9 溶于玉米油中）；對照組小鼠食用普通飼料和飲用水，同時腹腔注射等體積的玉米油。6 周后，將模型組小鼠隨機分為模型組和鱉甲煎丸組，每組8 只，鱉甲煎丸組開始給予鱉甲煎丸（1.365 g/kg）灌胃，1 次/d，模型組以相同方式予以飲用水。各組均連續(xù)灌胃至第24 周實驗結(jié)束。

1. 4 肝臟大體觀察 觀察小鼠肝臟形態(tài)、顏色、質(zhì)地，記錄每只小鼠肝臟表面直徑≥1 mm 的結(jié)節(jié)數(shù)量，并測量最大結(jié)節(jié)的直徑。

1.5 體質(zhì)量和肝臟相對質(zhì)量 各組小鼠于造模第24周灌胃2 h 后，用電子天平測量大鼠體質(zhì)量；麻醉后開腹，分離整個肝臟稱重，按下式計算肝臟相對質(zhì)量：肝臟相對質(zhì)量= [肝臟質(zhì)量（g）] / [體質(zhì)量（g）] ×100%。

1.6 組織病理學(xué)觀察 取各組小鼠肝左葉組織，4%多聚甲醛固定，乙醇脫水后石蠟包埋、3 μm 連續(xù)切片制成石蠟切片，脫蠟至水，常規(guī)HE 染色，中性樹膠封片后，在顯微鏡下觀察。

1.7 PD-L1 mRNA 表達 采用實時熒光定量PCR 法檢測。肝組織100 μg 按Trizol 說明提取總RNA，經(jīng)純度鑒定和濃度測定后，取1.0 μg 行逆轉(zhuǎn)錄。1.0 μL 的cDNA 行實時熒光定量PCR。PD-L1：上游引物5’-GCTGAACGCCCCATACAACAAAATC-3’，下游引物5’-CTCAGGACTTGATGGTCACTGCTTG-3’；GAPDH：上游引物5’-CACGAT GGAGGGGCCGGACTCATC-3’，下游引物5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’。目的基因相對表達量=2-[Ct(目的)-Ct(內(nèi)參)]。

1.8 PD-L1 蛋白表達 稱取40 mg 肝組織，加入含PMSF 的RIPA 裂解液，冰上勻漿后4℃，14000 ×g離心30 min，吸取上清。采用BCA 法蛋白定量，按60 μg/孔進行SDS-PAGE 電泳，結(jié)束后電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉2 h，加一抗（1∶1000 PD-L1，1∶1500 GAPDH）低溫孵育過夜，TBST 洗膜后加二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜后發(fā)光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)對目的條帶進行掃描和密度分析，以相應(yīng)蛋白條帶的平均光密度值來表示PD-L1 的相對蛋白表達量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析。計量數(shù)據(jù)以±s 表示，比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟大體解剖 對照組小鼠肝臟呈暗紅色，質(zhì)地光滑、細膩，表面無肉眼可見結(jié)節(jié)；模型組肝臟顏色變淡，質(zhì)地粗糙，有顆粒感，表面有直徑介于1～7 mm 結(jié)節(jié)，部分結(jié)節(jié)可見迂曲血管，與周圍組織分切不清；鱉甲煎丸組除1 只大鼠肝臟表面未見≥1 mm 的結(jié)節(jié)外，其余7 只均有1～4 mm 結(jié)節(jié)，如圖1。與對照組比較，模型組小鼠肝臟表面結(jié)節(jié)數(shù)量增多，結(jié)節(jié)最大直徑均增加（P＜0.05）；與模型組比較，鱉甲煎丸組表面結(jié)節(jié)數(shù)量減少，結(jié)節(jié)最大直徑減小（P＜0.05），如表1。

圖1 三組小鼠肝臟大體觀察

表1 三組小鼠肝臟表面直徑≥1 mm 結(jié)節(jié)數(shù)和最大結(jié)節(jié)直徑比較

2.2 體質(zhì)量和肝臟相對質(zhì)量 與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量減少，肝臟相對質(zhì)量增加（P ＜0.05）；與模型組比較，鱉甲煎丸組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），肝臟相對質(zhì)量降低（P ＜0.05），如表2。

表2 三組小鼠體質(zhì)量和肝臟相對質(zhì)量比較

2.3 肝臟組織病理學(xué) 對照組小鼠肝細胞呈多邊形，胞質(zhì)豐富，核位于中央，以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，小葉結(jié)構(gòu)清晰；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、消失，肝細胞脂肪變性、部分氣球樣變，可見增生性結(jié)節(jié)及癌結(jié)節(jié)，有細胞核深染、核分裂象，伴炎癥細胞浸潤及點、片狀壞死灶；鱉甲煎丸肝組織病理學(xué)改變較模型組減輕，如圖2。

圖2 三組小鼠肝組織病理改變（HE 染色）

2.4 PD-L1 mRNA 和蛋白表達 模型組小鼠肝組織PD-L1 mRNA 和蛋白表達較對照組升高（P＜0.05）；與模型組比較，鱉甲煎丸組PD-L1 mRNA 和蛋白表達均降低（P＜0.05），如圖3。

圖3 三組小鼠肝組織PD-L1 mRNA 和蛋白表達水平比較

3 討論

肝癌是消化系統(tǒng)常見的腫瘤，在我國腫瘤相關(guān)死亡病例中位居第二位[8]。從肝炎到肝硬化再到肝癌，一般需經(jīng)歷10 到30 年，早期干預(yù)是防治肝癌的關(guān)鍵。腫瘤免疫微環(huán)境在肝癌發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。研究證實，癌旁間質(zhì)存在大量免疫細胞浸潤，形成的炎性微環(huán)境可轉(zhuǎn)化并維持“惡性炎癥”，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫耐受，并促進血管生成和組織重塑，有助于肝癌進展[9]。

PD-L1 主要表達于腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞和腫瘤細胞，當(dāng)PD-1 與激活態(tài)免疫細胞表面表達的PD-L1 相結(jié)合，能抑制免疫細胞增殖，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生細胞凋亡，從而防治過度免疫反應(yīng)的發(fā)生；而腫瘤細胞則利用這一機制，表達PD-L1 或PD-1，誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫細胞凋亡，進而逃逸免疫監(jiān)視和攻擊[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1 過度表達的肝癌病例，有相對較差的分化程度、較高的術(shù)前甲胎蛋白（AFP）濃度和較短的生存期[4]；臨床應(yīng)用PD-1/PDL1 抑制劑能阻斷此信號通路，提高腫瘤細胞的免疫原性和對效應(yīng)細胞殺傷的敏感性，增強機體抗腫瘤免疫應(yīng)答，進而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[11-12]。有研究觀察到，阿替佐利單抗（抗PD-L1）和貝伐單抗（抗血管內(nèi)皮生長因子）聯(lián)合治療不可切除肝癌患者的中位無進展生存期為6.8 個月，在329 例至少接受一劑聯(lián)合治療的患者中，有56.5%的患者發(fā)生3 級或4 級不良事件[13-14]。這些數(shù)據(jù)表明，目前的西醫(yī)治療遠遠不能滿足臨床肝癌患者的需求。

鱉甲煎丸是治療肝病的經(jīng)典名方，全方由鱉甲膠、阿膠、蜂房、鼠婦蟲、土鱉蟲、蜣螂、硝石、柴胡、黃芩、半夏、黨參、干姜、桂枝、白芍、桃仁、牡丹皮、大黃、厚樸等23 味藥物組成，攻補兼施、寒熱并用、氣血共治、痰濕同調(diào)，有活血化瘀、軟堅散結(jié)、減緩脅下癥塊生長的功效，臨床常用于肝纖維化和肝癌的治療[5-6,15]。有研究利用二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝癌前病變模型，發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可抑制肝組織IL-6/STAT3 通路的激活，降低炎癥因子表達，從而抑制肝癌前病變的發(fā)生[16]。還有研究表明，鱉甲煎丸能通過調(diào)節(jié)Snail 表達，抑制肝細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并通過抑制腫瘤相關(guān)成纖維細胞PDGF-BB/PDGFRα 信號通路活化，進而減少肝癌的發(fā)生、遷移和侵襲[17-18]。本研究利用高脂肪、高果糖、高膽固醇飲食聯(lián)合四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝癌，證實鱉甲煎丸有延緩肝癌發(fā)生和發(fā)展的作用，能降低肝臟相對質(zhì)量，減少肝臟表面結(jié)節(jié)數(shù)量，減小結(jié)節(jié)最大直徑，并減輕組織病理學(xué)改變。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸能減輕腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的浸潤程度，表明其抑制肝癌發(fā)生的作用至少包括抑制肝細胞癌變和改善腫瘤微環(huán)境兩方面。進一步研究發(fā)現(xiàn)，肝癌小鼠PD-L1 mRNA 和蛋白表達水平升高，鱉甲煎丸能下調(diào)肝癌小鼠PD-L1 表達，提示其抑制肝細胞癌變和改善腫瘤微環(huán)境的作用與抑制PD-L1 表達、降低肝癌細胞的免疫逃逸有關(guān)。

綜上，本研究初步探討了PD-L1 在小鼠肝癌發(fā)生中的作用，以及鱉甲煎丸可能通過下調(diào)PD-L1 表達抑制肝組織癌變、改善腫瘤免疫微環(huán)境的作用機制，為闡明鱉甲煎丸防治肝癌發(fā)生及臨床推廣應(yīng)用提供新型的理論依據(jù)。