程 欣，郭羅琴，劉 哲，楊沁彤，徐 磊，方豫東

創(chuàng)面的形成原因主要包括外傷性、糖尿病性、壓力性及血管病變[1]等因素，由于其遷延不愈給患者及其家庭乃至帶來了極大的生理、心理和經(jīng)濟負擔。美國疾控中心數(shù)據(jù)表明，60%以上的創(chuàng)面存在著細菌感染[2]，感染是導致創(chuàng)面延遲愈合的主要原因[3]。近年來，抗生素骨水泥作為一種以聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）為主要成分的化合物，局部運用于糖尿病足潰瘍、燒傷創(chuàng)面等伴有感染的創(chuàng)面中療效顯著[4-5]。但隨著抗生素耐藥率日益升高，挖掘可與之媲美的藥物用于局部治療顯得尤為重要。中藥外治法歷史悠久，許多研究表明清熱解毒類的中藥外治感染性創(chuàng)面療效顯著[6-8]。本課題組前期研究亦表明，將軍散（君藥為大黃）創(chuàng)周箍圍以感染為主的創(chuàng)面，可減輕創(chuàng)周水腫，減輕創(chuàng)面局部炎癥反應， 降低創(chuàng)面白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、 腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量，改善微循環(huán)從而促進創(chuàng)面愈合，對全身的炎癥反應亦有抑制作用[9-11]。大黃素（emodin，E）作為大黃主要有效成分之一，具有較強的抑菌[12]和抗炎作用[13]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB） 作為炎癥反應的主要調(diào)節(jié)劑[14]，可被Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）激活[15]，介導IL-6、TNF-α 等表達，在炎癥反應中起到關鍵作用[16]。因此，本研究擬通過觀察大黃素骨水泥干預后創(chuàng)面愈合情況、菌落數(shù)變化、HE 染色病理切片、血清及組織中IL-6、TNF-α 的水平變化以及TLR4/NF-κB 蛋白表達變化來探討大黃載藥骨水泥對感染性創(chuàng)面修復的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 5 周齡雄性SPF 級Wistar 大鼠60只，體質(zhì)量約為（180±200）g，購自上海雷根生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010，普通飼料和清潔飲用水喂養(yǎng)，適應性飼養(yǎng)7 d 后開始實驗。倫理編號為：PTSHUTCM220913007。

1.2 主要藥物、試劑 賀利氏骨水泥（北京雷德睦華醫(yī)藥科技公司）， 萬古霉素（國藥準字號：H20140174，希臘VIANEX 公司），大黃素（純度98%，上海士峰生物科技有限公司），金黃色葡萄球菌（ATCC-25923，上海士峰生物科技有限公司），異氟烷（獸藥字153717015，青島歐博方醫(yī)藥科技有限公司），蘇木精-伊紅染色液（珠海貝索生物技術有限公司），ELISA 試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司），RT-qPCR 試劑盒及其引物（日本TAKARA公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0009，上海碧云天生物技術有限公司），兔抗TLR4 單克隆抗體（AF7017）、兔抗NF-κB p65 單克隆抗體（AF5006），HPR 標記抗兔二抗（WB0177），β-actin 內(nèi)參（WB0196，上海碧云天生物技術有限公司）。

1.3 主要儀器 全溫大容量恒溫搖床（上海知楚儀器有限公司），霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司），冷凍研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司），多功能酶標儀（美谷分子儀器上海有限公司），Supcre菌落計數(shù)儀（杭州迅數(shù)科技有限公司），實時熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems），全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.4 菌液制備 根據(jù)文獻[17-18]的方法制備金黃色葡萄球菌（以下簡稱“金葡菌”）混懸液，通過酶標儀，于600 nm 波長處檢測其光密度（optical density，OD）值[19]，篩選出所需濃度為1×107CFU/mL 的金葡菌混懸液。

1.5 分組、造模及給藥干預

1.5.1 分組 60 只大鼠編號后隨機分為空白組（正常飼養(yǎng)，無創(chuàng)面無干預）、模型組、大黃素骨水泥組（PMMA+E）和萬古霉素骨水泥組（PMMA+V），每組15 只。

1.5.2 造模 根據(jù)李文華等[20]的方法制備大鼠背部皮膚全層切除的感染性模型，48 h 后出現(xiàn)創(chuàng)周紅腫、創(chuàng)面大量滲出伴有黃腐為造模成功，造模前后均保持正常喂養(yǎng)。

1.5.3 給藥干預 造模成功后根據(jù)藥物∶骨水泥=1∶20 的比例[21]，將大黃素粉劑（2 g）、萬古霉素粉劑（2 g）分別加入到骨水泥（40 g）中混勻，覆蓋于創(chuàng)面，不超出創(chuàng)周邊緣，用醫(yī)用彈力繃帶固定。

1.6 大鼠創(chuàng)面愈合面積測定 干預后第1、7、14天，從模型組、大黃素骨水泥組和萬古霉素骨水泥組中隨機選取5 只大鼠，拍攝創(chuàng)面照片，用Image J分析創(chuàng)面面積。

1.7 大鼠創(chuàng)面菌落數(shù)測定 干預后第7、14 天，取模型組、大黃素骨水泥組和萬古霉素骨水泥組的0.1 g 創(chuàng)面組織進行勻漿（研磨儀120 s，65 Hz，24℃），取100 μL 的組織勻漿液，按照10 倍連續(xù)稀釋法進行稀釋，取不同濃度的稀釋液100 μL 于胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA） 平皿中搖勻培養(yǎng)24 h（37 ℃，濕度30 %）；通過菌落計數(shù)儀計算菌落數(shù)。

1.8 創(chuàng)面組織HE 染色 干預后第7、14 天，將取下的創(chuàng)面組織泡入4%多聚甲醛中固定，進行常規(guī)包埋、冷凍、切片、脫蠟、染色、脫色、脫水等步驟進行HE 染色，在鏡下（200 倍）觀察新生血管及炎癥細胞浸潤情況。

1.9 ELISA 法檢測大鼠血清中IL-6、TNF-α 含量干預后第7、14 天，先將大鼠腹主動脈血離心，取上清，設置標準孔和樣本孔，每孔設3 個復孔，根據(jù)試劑盒說明書操作，在450 nm 波長處測各孔OD 值。

1.10 RT-qPCR 法檢測大鼠創(chuàng)面及誘導膜中IL-6、TNF-α 含量 干預后第7、14 天，先將創(chuàng)面組織勻漿離心后進行RNA 抽提，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進行RT-qPCR，反應體系：10 μL 雙鏈DNA 染料、1 μL上游引物、1 μL 下游引物、2 μL cDNA，加水至總體系20 μL，反應條件為95 ℃30 s，95 ℃3 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)，以β-actin 為內(nèi)參，基因序列見表1。計算樣本的相對表達量=2-ΔΔCT。

表1 IL-6、TNF-α、β-actin 的引物序列

1.11 Western-Blot 檢測創(chuàng)面TLR4/NF-κB 蛋白表達 干預后第7、14 天，將大鼠創(chuàng)面組織剪碎裂解離心，取上清，用BCA 試劑盒測樣本蛋白濃度，灌膠，上樣40 μg 電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束放入5 %BSA 室溫封閉2 h，加入TLR4 抗體（1∶1 000）、NF-κB p65 抗體（1∶1 000）、β-actin 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜5 min×3 次，加入HRP 標記抗兔二抗，室溫孵育2 h；TBST 洗膜15 min×5 次，加顯影劑，上機顯色，以β-actin 為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值代表目的蛋白表達量。

1.12 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，參數(shù)檢驗中符合正態(tài)性、方差齊性采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t 檢驗；不符合正態(tài)性、方差齊性的采用非參數(shù)檢驗中的Kruskal-Wallis 檢驗；P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PMMA+E 對創(chuàng)面面積的影響 干預后第1天，三組間創(chuàng)面面積比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）；干預后第7 天和14 天，與模型組比較，PMMA+E 組和PMMA+V 組面積明顯縮?。≒ ＜0.01），與PMMA+V 組比較，PMMA+E 組創(chuàng)面面積明顯縮?。≒ ＜0.05）。見表2、圖1。

2.2 PMMA+E 對創(chuàng)面菌落數(shù)的影響 干預后第7天和第14 天，PMMA+E 組和PMMA+V 組的菌落數(shù)均低于模型組（P ＜0.01）；但PMMA+E 組與PMMA+V 組比較無明顯差異（P ＞0.05）。見表3、圖2。

圖2 各組間創(chuàng)面菌落數(shù)對比

表3 各組間創(chuàng)面菌落數(shù)比較

2.3 PMMA+E 對創(chuàng)面病理的影響 HE 染色結(jié)果顯示，與正常大鼠皮膚組織比較，第7 天的模型組創(chuàng)面可見表皮大片壞死，大量炎細胞浸潤，深部肉芽組織增生；PMMA+V 組創(chuàng)面可見表皮大片壞死，中量炎細胞浸潤，大量肉芽組織增生，新生血管中等；PMMA+E 組創(chuàng)面可見表皮大片壞死，中量炎細胞浸潤，大量肉芽組織增生，新生血管豐富。第14天的模型組創(chuàng)面仍可見表皮大片壞死，大量炎細胞浸潤，大量肉芽組織增生；PMMA+V 組創(chuàng)面可見表皮大片壞死，少量炎細胞浸潤，大量肉芽組織增生，新生血管中等；PMMA+E 組創(chuàng)面可見表皮大片壞死，少量炎細胞浸潤，大量肉芽組織增生，新生血管豐富。見圖3。

2.4 PMMA+E 對血清IL-6、TNF-α 的影響 與空白組比較，干預后第7 天和14 天，模型組的血清IL-6、TNF-α 均升高（P ＜0.05）；干預后第7 天，PMMA+E 組和PMMA+V 組的IL-6、TNF-α 比模型組明顯下降（P ＜0.05）。干預后第14 天，PMMA+E 組IL-6、TNF-α 比模型組明顯下降（P ＜0.05），PMMA+V 組IL-6 比模型組明顯下降，而TNF-α 無明顯差異（P ＞0.05）。見表4。

2.5 PMMA+E 對創(chuàng)面IL-6、TNF-α mRNA 含量的影響 與空白組比較，干預后第7 天和14 天，模型組的IL-6、TNF-α mRNA 含量均升高（P ＜0.05）；干預后第7 天，PMMA +E 組與模型組比較IL-6、TNF-α 明顯下降（P ＜0.05），與PMMA+V 組比較TNF-α 明顯下降（P ＜0.05）。干預后第14 天，PMMA+E 組與模型組比較IL-6、TNF-α 明顯下降（P ＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠創(chuàng)面IL-6、TNF-α mRNA 含量比較

2.6 PMMA+E 對創(chuàng)面TLR4/NF-κB 的影響 與空白組比較，干預后第7 天和14 天，模型組的TLR4、NF-κB 蛋白含量均升高（P ＜0.05）；干預第7 天和14 天，PMMA+E 組與模型組比較TLR4、NF-κB p65蛋白含量均下降（P ＜0.05）。見圖4、表6。

圖4 各組創(chuàng)面組織TLR4/NF-κB 蛋白表達條帶

表6 各組大鼠創(chuàng)面TLR4、NF-κB 蛋白含量比較

3 討論

感染性創(chuàng)面臨床常表現(xiàn)為局部紅腫熱痛，創(chuàng)面膿性分泌物多，腐臭氣味明顯，伴有全身發(fā)熱，白細胞升高，嚴重者可出現(xiàn)膿毒血癥甚至感染性休克[22]，如未及時治療，可能導致患者截趾或截肢風險增加。在治療過程中，控制創(chuàng)面局部感染是促進創(chuàng)面愈合的關鍵[23-24]，研究表明，大黃素可有效降低IL-6、TNF-α 等炎癥因子水平[24]，有效促進創(chuàng)面愈合[25]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中和創(chuàng)面中IL-6及TNF-α 水平較空白組明顯升高，提示感染性創(chuàng)面可引起機體炎癥因子水平紊亂。大黃素骨水泥干預后的大鼠血清中和創(chuàng)面中IL-6 及TNF-α 水平明顯降低，且創(chuàng)面面積較模型組及萬古霉素骨水泥組的明顯縮小，提示大黃素可改善感染性創(chuàng)面引起的炎癥因子水平紊亂，進而抑制大鼠體內(nèi)炎癥反應，促進創(chuàng)面愈合。

大黃素是存在大黃中的一種天然蒽醌衍生物，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌等作用[26]。金黃色葡萄球菌作為創(chuàng)面分泌物培養(yǎng)最常見的菌種[27]，常定植于創(chuàng)面難以消除。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠通過破壞細菌生物膜從而達到對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑制作用[12]。本研究結(jié)果表明，大黃素骨水泥組的創(chuàng)面菌落數(shù)相較于模型組明顯減少，與萬古霉素骨水泥比較無明顯差異，提示大黃素能有效抑制創(chuàng)面中金黃色葡萄球菌的生長，從而達到促進創(chuàng)面愈合的可能。

TLR 是保護性免疫哨兵，能特異性地識別病原相關分子模式[28]，通過跨膜結(jié)構(gòu)將病原相關分子刺激信號轉(zhuǎn)導入細胞內(nèi)，介導IL-1、IL-6、TNF-α 等炎癥因子的表達，引起相應炎性介質(zhì)的合成和釋放，激活中性粒細胞、淋巴細胞等。NF-κB 作為炎癥反應的主要調(diào)節(jié)劑，可被TLR4 激活[29]，通過調(diào)節(jié)編碼促炎性細胞因子基因的基因轉(zhuǎn)錄，參與免疫反應、細胞增殖與分化，在炎癥反應中起到關鍵作用[30]。研究發(fā)現(xiàn)[31]，TLRs/NF-κB 信號通路與創(chuàng)面愈合有關。本實驗結(jié)果表明，與空白組比較，模型組TLR4、NFκB 水平均明顯升高，與IL-6、TNF-α 水平升高一致，表明在感染中TLR4、NF-κB 可能被炎癥因子激活。給予大黃素骨水泥干預后，大鼠TLR4 及NFκB 水平明顯降低，提示大黃素可降低TLR4、NF-κB水平，從而促進創(chuàng)面愈合。

綜上，外用大黃素能有效抑制金黃色葡萄球菌生長，抑制感染性創(chuàng)面大鼠血清炎癥因子水平以及創(chuàng)面炎癥因子水平，從而促進創(chuàng)面愈合，其作用機制可能與TLR4/NF-κB 信號通路有關。