1 貼壁培養(yǎng)

貼壁培養(yǎng)是在某一固相表面貼附細胞并對其培養(yǎng)的一種動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)，動物細胞必須貼附于攜帶有部分電荷的固體表面或者半固體表面，只有這樣動物細胞才能生長。目前，大部分動物細胞培養(yǎng)均為這一類型。

1.1 生長特性

在培養(yǎng)貼壁依賴型細胞時，必須保證其緊密附著于培養(yǎng)器皿壁上或培養(yǎng)瓶瓶壁上，細胞原本形狀為圓形，在其貼壁后將會立即鋪展開來，并進行有絲分裂，在很短時間內(nèi)細胞便會開始對數(shù)生長。通常僅需數(shù)日細胞就會將培養(yǎng)壁表面鋪滿，同時構(gòu)建一個密集性較高的細胞單層。需注意的是，貼壁表面必須具備高度表面活性并攜帶有凈陽電荷，同時要求微載體具備一定電荷密度，如果貼壁表面為有機物表面，還需保證其具備明顯的親水性特點，同時攜帶有陽性電荷。

1.2 貼壁培養(yǎng)優(yōu)點

第一，細胞會在固相表面緊密附著，在培養(yǎng)過程中可將舊培養(yǎng)液直接倒掉，清洗干凈后直接裝入新的培養(yǎng)液，更換培養(yǎng)液較為便利。第二，由于細胞在載體表面固定，此方式無需配備過濾系統(tǒng)，可通過灌注方式以提升細胞密度。第三，在細胞附著于生長基質(zhì)表面時，細胞對某一產(chǎn)品的表達效果將更加理想。第四，可利用統(tǒng)一設(shè)備對多種細胞進行培養(yǎng)，同時可以結(jié)合實際需求調(diào)整細胞液及細胞間的比例。

1.3 貼壁培養(yǎng)缺點

在細胞貼壁后，其消化難度較大，最終會增加擴大培養(yǎng)的難度。培養(yǎng)過程中培養(yǎng)設(shè)施需要較大的占地面積，同時相關(guān)設(shè)備需要較多的資金。在細胞反應(yīng)器培養(yǎng)過程中，無法通過顯微鏡觀察細胞，無法實時監(jiān)測細胞的生長狀態(tài)。在控制細胞環(huán)境的過程中，很難實現(xiàn)完全的均勻化。

1.4 貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)

1.4.1 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)

在貼壁依賴型細胞培養(yǎng)過程中，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)是最早采用的一種系統(tǒng)。在小型培養(yǎng)過渡至大規(guī)模培養(yǎng)時，一般采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)瓶（旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器）中接種細胞后，在轉(zhuǎn)瓶的持續(xù)旋轉(zhuǎn)作用下培養(yǎng)細胞，這樣細胞能夠交替接觸空氣及培養(yǎng)液，獲取良好的傳熱條件，傳質(zhì)條件轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的主要特點是結(jié)構(gòu)簡單、無需投入過量資金及設(shè)備、技術(shù)較為成熟，同時這一系統(tǒng)具備良好的重復性，僅僅需要對轉(zhuǎn)瓶數(shù)量增加以實現(xiàn)放大。但是轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)也存在一定的缺點：即需要占據(jù)較大的空間，勞動強度較大，單位體積僅可提供較小的細胞生長表面積，同時其細胞生長密度并不高，在培養(yǎng)過程中無法實現(xiàn)對環(huán)境條件的有效監(jiān)測及控制。目前，常見的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)可以分為二氧化碳培養(yǎng)箱及轉(zhuǎn)瓶機。

1.4.2 反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)

在應(yīng)用反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)時，細胞主要在固定表面貼附并生長，在攪拌作用下細胞不會隨著培養(yǎng)液共同流動，基于此，培養(yǎng)液更換較為便利，無需特定的細胞分離及培養(yǎng)液設(shè)備，通過灌流培養(yǎng)即可獲取較高的細胞密度，在此基礎(chǔ)之上獲取相關(guān)產(chǎn)品；但是在具體應(yīng)用過程中很難擴大規(guī)模，無法對細胞的生長情況直接監(jiān)控，因而這一系統(tǒng)常用于價值較高、用量少的生物藥品制備。常見細胞貼壁載體主要包括中空纖維、微載體系統(tǒng)及玻璃珠等。能夠培養(yǎng)雜交瘤系統(tǒng)、CHO 細胞等多種系統(tǒng)。另外，利用反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細胞時，在接種細胞后貼壁速度極快。

2 懸浮培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)是在反應(yīng)器內(nèi)接入細胞，使其自由懸浮生長，或在轉(zhuǎn)動裝置、震蕩裝置的作用下保證細胞分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的細胞培養(yǎng)方法。懸浮培養(yǎng)技術(shù)主要基于微生物發(fā)酵技術(shù)，一般用于培養(yǎng)非貼壁依賴型細胞。

2.1 生長特性

懸浮培養(yǎng)技術(shù)就是分散活體動物組織，對其離心、純化及漂洗后選擇適宜的培養(yǎng)液接種，使細胞在特定條件下懸浮生長。無血清懸浮培養(yǎng)采用已知來源的激素或蛋白質(zhì)培養(yǎng)細胞，無需后期純化，可簡化操作流程，提升產(chǎn)品質(zhì)量，近年來已經(jīng)逐漸成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的重要研究方向。

2.2 懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點

第一，懸浮培養(yǎng)技術(shù)操作簡便，方便定量研究；第二，懸浮培養(yǎng)技術(shù)具備良好的傳質(zhì)及傳氧特性，可幫助細胞充分接觸培養(yǎng)基內(nèi)氣體及營養(yǎng)物質(zhì)，便于控制培養(yǎng)條件；第三，懸浮培養(yǎng)技術(shù)使用過程中無需附著物；第四，利用懸浮培養(yǎng)法細胞可快速繁殖，可提高產(chǎn)量，同時其各項設(shè)備結(jié)構(gòu)相對簡便；第五，在細胞培養(yǎng)過程中無需對其再分散，僅需嚴格按照相關(guān)比例做好稀釋工作，便可繼續(xù)培養(yǎng)，同時其培養(yǎng)規(guī)模方便擴大，可連續(xù)提高生產(chǎn)量。即使在連續(xù)密閉系統(tǒng)內(nèi)也可以培養(yǎng)細胞，簡化操作步驟，減少污染。

2.3 懸浮培養(yǎng)的缺點

第一，懸浮培養(yǎng)細胞密度不高，很難進行灌流培養(yǎng)；第二，培養(yǎng)過程中可能存在潛在的致癌風險，在病毒培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)喪失病毒標記的現(xiàn)象，最終導致免疫能力降低；第三，適宜懸浮培養(yǎng)的細胞種類并不多，多數(shù)動物細胞適宜采取貼壁培養(yǎng)方式。

3 固定化培養(yǎng)

固定化培養(yǎng)技術(shù)就是結(jié)合動物細胞及水不溶性載體，在此基礎(chǔ)上培養(yǎng)細胞的方式。固定化培養(yǎng)所培養(yǎng)細胞生長密度高，具備較強的抗污染及抗剪切能力，產(chǎn)物及細胞易分開，方便分離并純化產(chǎn)物。常見的固定化培養(yǎng)方式包括以下幾種：

3.1 吸附法

吸附法就是將細胞吸附于固體吸附劑表面，從而固定細胞的方式。吸附法在應(yīng)用過程中條件溫和、操作簡便，是研究歷史最為悠久的一種動物細胞固定化培養(yǎng)方法。吸附法也存在一定缺陷，即其載體缺乏足夠的負荷能力，導致細胞極容易脫落。吸附法最為常見的是中空纖維培養(yǎng)及微載體培養(yǎng)。

3.2 包埋法

包埋法就是采用多孔載體，在其中包埋細胞以實現(xiàn)細胞的固定化。包埋法操作條件溫和、負荷量較大、很少出現(xiàn)細胞泄露、操作簡便，具備抗機械剪切的效果。但是其缺點為限制擴散，無法保證全部細胞均處于最佳基質(zhì)濃度，分子量較大的基質(zhì)很難向高聚物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部滲透。包埋法一般用于固定非貼壁依賴型細胞，通常采取多孔凝膠載體。

3.3 共價貼附法

共價貼附法就是在共價鍵的作用下將動物細胞固定于固相載體上。共價吸附法能夠降低細胞泄露量，但是在具體應(yīng)用過程中必須利用化學試劑，而化學試劑可能會影響細胞活性，無法有效保護細胞。

3.4 微囊法

微囊法就是利用親水半透膜包裹細胞，使之處于珠狀微囊中，這樣能夠有效阻止細胞溢出，對營養(yǎng)物質(zhì)及小分子物質(zhì)在半透膜上的自由出入不會造成任何影響；在囊內(nèi)可營造一個與液體培養(yǎng)相似的培養(yǎng)環(huán)境，避免細胞受損。采用微囊法所培養(yǎng)細胞可良好生長，同時其培養(yǎng)密度也較高。

3.5 離子/共價交聯(lián)法

離子/共價交聯(lián)法就是對細胞懸浮液采用雙功能試劑處理，可連接細胞并產(chǎn)生交聯(lián)作用，從而實現(xiàn)細胞的固定化培養(yǎng)。但是這種培養(yǎng)方式在具體應(yīng)用過程中，可能會導致部分細胞死亡，也會造成擴散限制。