三亞地區(qū)2019-2020年急性腸胃炎患者A群雙?？刹《镜姆肿犹卣?/h1>
2023-12-12 10:42:54黃麗菊李泳枝何歡石挺麗陳彩云鄭麗婷梁敏儀陳佳琪陳清
實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2023年22期
黃麗菊 李泳枝 何歡 石挺麗 陳彩云 鄭麗婷 梁敏儀 陳佳琪 陳清
1三亞中心醫(yī)院（海南省第三人民醫(yī)院）（海南三亞 572000）；2肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校（廣東肇慶 526020）；3南方醫(yī)科大學(xué)（廣州 510515）
急性胃腸炎是常見的感染性疾病，通常由病毒和細(xì)菌引起，目前病毒感染已成為急性胃腸炎發(fā)生的主要原因［1］。A 群雙埃可病毒（Parechovirus-A，PeV-A）過去稱為人雙埃可病毒，是單鏈、正股RNA病毒，屬于小RNA病毒科雙?？刹《緦伲?-4］。目前共發(fā)現(xiàn)了19種PeV-A的基因型（HPeV-1至HPeV-19），急性胃腸炎與多種基因型均有關(guān)［5］。國內(nèi)外已經(jīng)有一些PeV-A 相關(guān)的急性腸胃炎的流行病學(xué)研究［6-9］，熱帶地區(qū)是感染性腹瀉的高發(fā)地區(qū)，但是目前尚未見我國熱帶地區(qū)PeV-A 感染的研究報(bào)道。因此，我們?cè)?019-2020 年間，在三亞市某哨點(diǎn)醫(yī)院開展了急性腸胃炎患者的PeV-A 監(jiān)測(cè)和分子流行病學(xué)分析。
1 資料與方法
1.1 研究對(duì)象和樣本以門診和住院診斷為急性腸胃炎的患者為研究對(duì)象。研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：2019 年1 月至2020 年8 月，連續(xù)納入符合急性胃腸炎、自愿接受問卷調(diào)查的病例。急性胃腸炎患者定義：表現(xiàn)為腹瀉（過去24 h 內(nèi)大便次數(shù)超過3 次），并合并腹痛、惡心和嘔吐，同時(shí)排除已證實(shí)患有炎癥性腸病、腹瀉性乳糜瀉、囊性纖維化和食物不耐受的患者。調(diào)查信息包括一般人口學(xué)信息、臨床癥狀、流行病學(xué)史和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：基本人口信息不全或者沒有糞便標(biāo)本的病例。采集臨床上確診為急性胃腸炎患者的糞便樣本。遵循“先采集，后治療”的原則。所有糞便樣本在實(shí)驗(yàn)操作前均進(jìn)行-80℃低溫保存。本研究獲得三亞中心醫(yī)院（海南省第三人民醫(yī)院）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：LLKY2311118）。
1.2 病毒核酸提取糞便樣本使用TaKaRa Mini-BEST 病毒RNA/DNA 提取試劑盒（No. 9766）進(jìn)行病毒核酸提取。檢測(cè)前，使用羅氏一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（No. 4379012001）將病毒RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 備用。
1.3 PeV-A 及其他腹瀉病毒檢測(cè)采用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Nest Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，Nest RT-PCR）擴(kuò)增高度保守的5′端非翻譯區(qū)的片段（5′-UTR，243 bp）進(jìn)行糞便樣本中的PeV-A初篩［10］。初篩陽性樣本，根據(jù)PeV-A 的VP3/VP1 連接區(qū)片段（304 bp）進(jìn)行基因分型。VP1 區(qū)則使用改良引物進(jìn)行擴(kuò)增（758 bp）。本研究同時(shí)檢測(cè)與致腹瀉相關(guān)的腸道病毒，包括：A 群輪狀病毒、諾如病毒［11］、扎如病毒［12］、腺病毒［13］、人博卡病毒［14］、星狀病毒［15］和Salivirus［16］。PCR 產(chǎn)物條帶經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后在紫外光下觀察。
1.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析使用BLAST+2.14.0（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將所有5′-UTR 區(qū)及VP1 區(qū)核苷酸序列片段與NCBI 網(wǎng)站上的參考序列進(jìn)行比較。系統(tǒng)進(jìn)化分析使用MEGA-X（Mega Limited， Auckland， New Zealand）軟件進(jìn)行。使用基于p-距離模型的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。通過1 000個(gè)重復(fù)的bootstrap值來評(píng)估分支的統(tǒng)計(jì)支持度。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分類變量的描述性統(tǒng)計(jì)以頻率和比例或比率表示，連續(xù)變量的描述性統(tǒng)計(jì)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。使用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)法進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，以比較不同組間連續(xù)變量的差異。χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率檢驗(yàn)用于比較分類變量的差異。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 26.0 版（IBM Corp.， Armonk， NY， USA）軟件進(jìn)行。
2 結(jié)果
2.1 研究對(duì)象的人口學(xué)特征及臨床特征共收集了267 例臨床診斷為急性腸胃炎的門診患者（表1）及其糞便樣本。急性胃腸炎患者的中位年齡為3.9歲，5歲以下患者的比例為53.2%（142/267），男女性別比為1.36∶1?；颊咧饕獮樯⒕觾和?、幼托兒童和學(xué)生（66.6%）。
表1 2019-2020 年三亞市某醫(yī)院急性胃腸炎患者的人口學(xué)及臨床特征Tab.1 Demographic and Clinical characteristics of Sanya acute gastroenteritis patients between 2019 and 2020例（%）
在臨床特征方面，除了腹瀉（100%）癥狀，還有部分患者有惡心（14.6%）、腹痛（27.0%）、腹脹（24.0%）、發(fā)熱（17.2%）、嘔吐（14.2%）和乏力（10.1%）等癥狀（表1）。糞便特征分析顯示，32.6%病例糞便中發(fā)現(xiàn)其隱血陽性（表1），3.0%的病例觀察到黏液便。
2.2 PeV-A 腹瀉患病率及與其他腹瀉病毒共感染情況通過巢式RT-PCR 方法，三亞患者糞便標(biāo)本中PeV-A 核酸的檢出率為3.37%（9/267）。絕大多數(shù)PeV-A陽性者年齡在2歲以下，尤其是5 ～ 6個(gè)月的兒童。男女比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)急性胃腸炎全年流行，高峰在12 月至2 月，但與PeV-A 感染相關(guān)的季節(jié)性分布在夏季和冬季較多（圖1）。
圖1 2019-2020 年三亞市某醫(yī)院PeV-A 感染病例的季節(jié)分布圖Fig.1 Seasonal distribution of PeV-A infections in Sanya，China， 2019-2020
PeV-A 陽性者會(huì)出現(xiàn)腹瀉、呼吸道感染、惡心、腹痛、嘔吐和發(fā)燒癥狀。PeV-A 陽性者的腹瀉持續(xù)的中位天數(shù)為3.0 d，明顯高于PeV-A陰性者（P＜0.05）。但PeV-A陽性患者的最高腹瀉頻率與PeV-A陰性患者相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。
PeV-A 與A 群輪狀病毒（RoV-A）和諾如病毒（NoV）的共感染率分別為11.1%（1/9）和22.2%（2/9）。在嘔吐的占比方面，PeV-A陽性組高于陰性組（44.4%vs. 13.2%，P= 0.008）（表2）。
表2 PeV-A 病毒陽性患者與其他不同分組的急性胃腸炎患者的臨床癥狀比較Tab.2 Comparison of clinical symptoms of PeV-A infection between different groups of subjects with acute gastroenteritis例（%）
2.3 PeV-A 基因型的系統(tǒng)發(fā)育特征本研究糞便樣本中發(fā)現(xiàn)了HPeV-1、HPeV-3 和HPeV-5 的VP3/VP1 部分基因序列（圖2）。三亞患者的PeV-A基因型大多數(shù)為HPeV-1，與國內(nèi)外的參考株系緊密聚類；其中SY-1943 和SY-1944 與廣州的參考株（MK532597、MK532589）相似性達(dá)到100%。而SY-1952 株和SY-2195 株分別與蘭州的HPeV-3 參考株（JQ715773.1）以及鎮(zhèn)江的HPeV-5 參考株（KY067444.1）形成進(jìn)化分支，相似性分別為98%與93%（圖2）。此外，我們進(jìn)一步對(duì)上述序列進(jìn)行VP1 長(zhǎng)片段基因區(qū)的擴(kuò)增與系統(tǒng)進(jìn)化分析，也得到了類似的結(jié)果，即三亞急性胃腸炎患者的PeV-A基因片段可分為3 個(gè)不同型別的進(jìn)化分支；其VP1區(qū)的3 個(gè)不同基因型片段與來自北京或香港參考株的親緣關(guān)系最為接近，相似性為89% ～ 100%（圖3）。
圖2 三亞市PeV-A 病毒的VP1/VP3 片段基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed from VP1/VP3 partial gene of Sanya PeV-A
圖3 三亞市PeV-A 病毒的VP1 基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed from VP1 gene of Sanya PeV-A
3 討論
PeV-A 在急性胃腸炎患者中的檢出率不同地區(qū)報(bào)告的結(jié)果有所不同［17-19］。本研究中三亞的PeV-A 檢出率為3.37%，高于在泰國的報(bào)道（1.8%或2.4%）［20-21］，但低于CHEN 等［22］在廣州地區(qū)的研究報(bào)道。本研究幾乎所有的PeV-A 感染都發(fā)生在出生后的第1 ～ 2 年，5 ～ 6 個(gè)月齡的嬰幼兒感染比例較高，這與之前的研究結(jié)果一致［22-25］。在季節(jié)分布方面，PeV-A 的流行貫穿全年，雖然大多數(shù)研究都觀察到PeV-A感染的季節(jié)性模式，但高峰季節(jié)的差異性很大［26］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)了PeV-A在三亞地區(qū)相對(duì)明顯的季節(jié)性分布，即在夏季和冬季流行，并在7 月份達(dá)到高峰，這與泰國和日本的季節(jié)分布相似，與陳雪姣等在廣州地區(qū)的報(bào)道也相似［22，25］。
本研究中在三亞地區(qū)檢測(cè)到的PeV-A 基因型主要為HPeV-1、HPeV-3 以及HPeV-5，HPeV-1 檢出最多，其次為HPeV-3，與國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表的報(bào)告相似［22，25，27］。本研究還表明，與PeV-A 陰性腹瀉患者相比，大部分PeV-A 陽性腹瀉患者有更高比例的臨床特征：為腹瀉、呼吸道感染、惡心、腹痛、嘔吐和發(fā)燒，提示PeV-A 急性胃腸炎的癥狀比較明顯。但是，由于本研究只有9 例陽性病例，掌握其有關(guān)臨床特征還需要更大樣本量的研究。
綜上所述，本研究提供了2019-2020 年間三亞地區(qū)急性胃腸炎患者中存在PeV-A 感染的初步流行病學(xué)信息，以HPeV-1 基因型為主，其次是HPeV-3 和HPeV-5，病毒陽性者的臨床癥狀也比陰性者重，要引起重視。
【Author contributions】HUANG Liju designed the experiments and wrote the article. LI Yongzhi and HE Huan performed the experiments.SHI Tingli and CHEN Caiyun collected and analyzed data. ZHENG Liting， LIANG Minyi and CHEN Jiaqi revised the article. CHEN Qing designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.
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黃麗菊 李泳枝 何歡 石挺麗 陳彩云 鄭麗婷 梁敏儀 陳佳琪 陳清
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急性胃腸炎是常見的感染性疾病，通常由病毒和細(xì)菌引起，目前病毒感染已成為急性胃腸炎發(fā)生的主要原因［1］。A 群雙埃可病毒（Parechovirus-A，PeV-A）過去稱為人雙埃可病毒，是單鏈、正股RNA病毒，屬于小RNA病毒科雙?？刹《緦伲?-4］。目前共發(fā)現(xiàn)了19種PeV-A的基因型（HPeV-1至HPeV-19），急性胃腸炎與多種基因型均有關(guān)［5］。國內(nèi)外已經(jīng)有一些PeV-A 相關(guān)的急性腸胃炎的流行病學(xué)研究［6-9］，熱帶地區(qū)是感染性腹瀉的高發(fā)地區(qū)，但是目前尚未見我國熱帶地區(qū)PeV-A 感染的研究報(bào)道。因此，我們?cè)?019-2020 年間，在三亞市某哨點(diǎn)醫(yī)院開展了急性腸胃炎患者的PeV-A 監(jiān)測(cè)和分子流行病學(xué)分析。
1 資料與方法
1.1 研究對(duì)象和樣本以門診和住院診斷為急性腸胃炎的患者為研究對(duì)象。研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：2019 年1 月至2020 年8 月，連續(xù)納入符合急性胃腸炎、自愿接受問卷調(diào)查的病例。急性胃腸炎患者定義：表現(xiàn)為腹瀉（過去24 h 內(nèi)大便次數(shù)超過3 次），并合并腹痛、惡心和嘔吐，同時(shí)排除已證實(shí)患有炎癥性腸病、腹瀉性乳糜瀉、囊性纖維化和食物不耐受的患者。調(diào)查信息包括一般人口學(xué)信息、臨床癥狀、流行病學(xué)史和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：基本人口信息不全或者沒有糞便標(biāo)本的病例。采集臨床上確診為急性胃腸炎患者的糞便樣本。遵循“先采集，后治療”的原則。所有糞便樣本在實(shí)驗(yàn)操作前均進(jìn)行-80℃低溫保存。本研究獲得三亞中心醫(yī)院（海南省第三人民醫(yī)院）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：LLKY2311118）。
1.2 病毒核酸提取糞便樣本使用TaKaRa Mini-BEST 病毒RNA/DNA 提取試劑盒（No. 9766）進(jìn)行病毒核酸提取。檢測(cè)前，使用羅氏一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（No. 4379012001）將病毒RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 備用。
1.3 PeV-A 及其他腹瀉病毒檢測(cè)采用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Nest Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，Nest RT-PCR）擴(kuò)增高度保守的5′端非翻譯區(qū)的片段（5′-UTR，243 bp）進(jìn)行糞便樣本中的PeV-A初篩［10］。初篩陽性樣本，根據(jù)PeV-A 的VP3/VP1 連接區(qū)片段（304 bp）進(jìn)行基因分型。VP1 區(qū)則使用改良引物進(jìn)行擴(kuò)增（758 bp）。本研究同時(shí)檢測(cè)與致腹瀉相關(guān)的腸道病毒，包括：A 群輪狀病毒、諾如病毒［11］、扎如病毒［12］、腺病毒［13］、人博卡病毒［14］、星狀病毒［15］和Salivirus［16］。PCR 產(chǎn)物條帶經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后在紫外光下觀察。
1.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析使用BLAST+2.14.0（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將所有5′-UTR 區(qū)及VP1 區(qū)核苷酸序列片段與NCBI 網(wǎng)站上的參考序列進(jìn)行比較。系統(tǒng)進(jìn)化分析使用MEGA-X（Mega Limited， Auckland， New Zealand）軟件進(jìn)行。使用基于p-距離模型的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。通過1 000個(gè)重復(fù)的bootstrap值來評(píng)估分支的統(tǒng)計(jì)支持度。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分類變量的描述性統(tǒng)計(jì)以頻率和比例或比率表示，連續(xù)變量的描述性統(tǒng)計(jì)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。使用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)法進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，以比較不同組間連續(xù)變量的差異。χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率檢驗(yàn)用于比較分類變量的差異。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 26.0 版（IBM Corp.， Armonk， NY， USA）軟件進(jìn)行。
2 結(jié)果
2.1 研究對(duì)象的人口學(xué)特征及臨床特征共收集了267 例臨床診斷為急性腸胃炎的門診患者（表1）及其糞便樣本。急性胃腸炎患者的中位年齡為3.9歲，5歲以下患者的比例為53.2%（142/267），男女性別比為1.36∶1?；颊咧饕獮樯⒕觾和?、幼托兒童和學(xué)生（66.6%）。
表1 2019-2020 年三亞市某醫(yī)院急性胃腸炎患者的人口學(xué)及臨床特征Tab.1 Demographic and Clinical characteristics of Sanya acute gastroenteritis patients between 2019 and 2020例（%）
在臨床特征方面，除了腹瀉（100%）癥狀，還有部分患者有惡心（14.6%）、腹痛（27.0%）、腹脹（24.0%）、發(fā)熱（17.2%）、嘔吐（14.2%）和乏力（10.1%）等癥狀（表1）。糞便特征分析顯示，32.6%病例糞便中發(fā)現(xiàn)其隱血陽性（表1），3.0%的病例觀察到黏液便。
2.2 PeV-A 腹瀉患病率及與其他腹瀉病毒共感染情況通過巢式RT-PCR 方法，三亞患者糞便標(biāo)本中PeV-A 核酸的檢出率為3.37%（9/267）。絕大多數(shù)PeV-A陽性者年齡在2歲以下，尤其是5 ～ 6個(gè)月的兒童。男女比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)急性胃腸炎全年流行，高峰在12 月至2 月，但與PeV-A 感染相關(guān)的季節(jié)性分布在夏季和冬季較多（圖1）。
圖1 2019-2020 年三亞市某醫(yī)院PeV-A 感染病例的季節(jié)分布圖Fig.1 Seasonal distribution of PeV-A infections in Sanya，China， 2019-2020
PeV-A 陽性者會(huì)出現(xiàn)腹瀉、呼吸道感染、惡心、腹痛、嘔吐和發(fā)燒癥狀。PeV-A 陽性者的腹瀉持續(xù)的中位天數(shù)為3.0 d，明顯高于PeV-A陰性者（P＜0.05）。但PeV-A陽性患者的最高腹瀉頻率與PeV-A陰性患者相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。
PeV-A 與A 群輪狀病毒（RoV-A）和諾如病毒（NoV）的共感染率分別為11.1%（1/9）和22.2%（2/9）。在嘔吐的占比方面，PeV-A陽性組高于陰性組（44.4%vs. 13.2%，P= 0.008）（表2）。
表2 PeV-A 病毒陽性患者與其他不同分組的急性胃腸炎患者的臨床癥狀比較Tab.2 Comparison of clinical symptoms of PeV-A infection between different groups of subjects with acute gastroenteritis例（%）
2.3 PeV-A 基因型的系統(tǒng)發(fā)育特征本研究糞便樣本中發(fā)現(xiàn)了HPeV-1、HPeV-3 和HPeV-5 的VP3/VP1 部分基因序列（圖2）。三亞患者的PeV-A基因型大多數(shù)為HPeV-1，與國內(nèi)外的參考株系緊密聚類；其中SY-1943 和SY-1944 與廣州的參考株（MK532597、MK532589）相似性達(dá)到100%。而SY-1952 株和SY-2195 株分別與蘭州的HPeV-3 參考株（JQ715773.1）以及鎮(zhèn)江的HPeV-5 參考株（KY067444.1）形成進(jìn)化分支，相似性分別為98%與93%（圖2）。此外，我們進(jìn)一步對(duì)上述序列進(jìn)行VP1 長(zhǎng)片段基因區(qū)的擴(kuò)增與系統(tǒng)進(jìn)化分析，也得到了類似的結(jié)果，即三亞急性胃腸炎患者的PeV-A基因片段可分為3 個(gè)不同型別的進(jìn)化分支；其VP1區(qū)的3 個(gè)不同基因型片段與來自北京或香港參考株的親緣關(guān)系最為接近，相似性為89% ～ 100%（圖3）。
圖2 三亞市PeV-A 病毒的VP1/VP3 片段基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed from VP1/VP3 partial gene of Sanya PeV-A
圖3 三亞市PeV-A 病毒的VP1 基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed from VP1 gene of Sanya PeV-A
3 討論
PeV-A 在急性胃腸炎患者中的檢出率不同地區(qū)報(bào)告的結(jié)果有所不同［17-19］。本研究中三亞的PeV-A 檢出率為3.37%，高于在泰國的報(bào)道（1.8%或2.4%）［20-21］，但低于CHEN 等［22］在廣州地區(qū)的研究報(bào)道。本研究幾乎所有的PeV-A 感染都發(fā)生在出生后的第1 ～ 2 年，5 ～ 6 個(gè)月齡的嬰幼兒感染比例較高，這與之前的研究結(jié)果一致［22-25］。在季節(jié)分布方面，PeV-A 的流行貫穿全年，雖然大多數(shù)研究都觀察到PeV-A感染的季節(jié)性模式，但高峰季節(jié)的差異性很大［26］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)了PeV-A在三亞地區(qū)相對(duì)明顯的季節(jié)性分布，即在夏季和冬季流行，并在7 月份達(dá)到高峰，這與泰國和日本的季節(jié)分布相似，與陳雪姣等在廣州地區(qū)的報(bào)道也相似［22，25］。
本研究中在三亞地區(qū)檢測(cè)到的PeV-A 基因型主要為HPeV-1、HPeV-3 以及HPeV-5，HPeV-1 檢出最多，其次為HPeV-3，與國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表的報(bào)告相似［22，25，27］。本研究還表明，與PeV-A 陰性腹瀉患者相比，大部分PeV-A 陽性腹瀉患者有更高比例的臨床特征：為腹瀉、呼吸道感染、惡心、腹痛、嘔吐和發(fā)燒，提示PeV-A 急性胃腸炎的癥狀比較明顯。但是，由于本研究只有9 例陽性病例，掌握其有關(guān)臨床特征還需要更大樣本量的研究。
綜上所述，本研究提供了2019-2020 年間三亞地區(qū)急性胃腸炎患者中存在PeV-A 感染的初步流行病學(xué)信息，以HPeV-1 基因型為主，其次是HPeV-3 和HPeV-5，病毒陽性者的臨床癥狀也比陰性者重，要引起重視。
【Author contributions】HUANG Liju designed the experiments and wrote the article. LI Yongzhi and HE Huan performed the experiments.SHI Tingli and CHEN Caiyun collected and analyzed data. ZHENG Liting， LIANG Minyi and CHEN Jiaqi revised the article. CHEN Qing designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.
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