秦志遠(yuǎn)，胡志航，楊 妮，王亞如，孔潔玙，李靜文，陳 益，王政善，李 彤，莊 靜*

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/茶葉科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095； 2. 連云港御龍茶業(yè)有限公司，江蘇 連云港 222114； 3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

0 引言

【研究意義】光合作用是植物最基本的生命活動(dòng)，光合作用通過一系列復(fù)雜的氧化還原過程使植物在同化CO2的同時(shí)，把太陽能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能并儲(chǔ)存在所形成的有機(jī)物中，正是這種重要的機(jī)制保障了植物正常的生長發(fā)育。在光合作用的過程中，光能的捕獲依托于多種色素分子對(duì)光能的吸收，其中Lhcb（light-harvesting chlorophyⅡa/b-binding proteins of photosystemⅡ）是植物光系統(tǒng)II（PSII）中的一類膜蛋白，由Lhcb基因家族編碼，含有保守的葉綠素結(jié)合（chlorophyllbinding，CB）結(jié)構(gòu)域，可以與葉綠素a/b結(jié)合形成捕光色素蛋白復(fù)合體（LHC）。LHC 在光合作用中發(fā)揮著重要的作用，不僅能夠捕獲光能，而且能將能量傳遞到反應(yīng)中心并發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，此外還參與激發(fā)能的在光系統(tǒng)之間的分配利用、光系統(tǒng)的保護(hù)、維持類囊體結(jié)構(gòu)和對(duì)環(huán)境變化的反應(yīng)[1-5]。雖然光對(duì)于植物至關(guān)重要，但過量的光超過了植物生長發(fā)育所能利用的量會(huì)對(duì)植物造成光氧化損傷并使得光合效率降低，PSII 中葉綠素?zé)晒獾姆枪饣瘜W(xué)猝滅（NPQ）就是應(yīng)對(duì)過量光的一種機(jī)制[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】當(dāng)茶樹受到干旱脅迫時(shí)，會(huì)激活一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如ABA 信號(hào)通路、Ca2+信號(hào)通路等，通過激活此類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以提高茶樹的抗旱性。同時(shí)，茶樹還可以通過減少水分降低蒸騰作用，水分的降低可以減少光合產(chǎn)物的消耗，從而延長茶樹葉片的生命周期。茶樹體內(nèi)的有機(jī)物主要包括：糖類、蛋白質(zhì)、游離氨基酸、茶多酚、咖啡堿等，都是光合作用的產(chǎn)物和衍生物。因此光合作用對(duì)茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)起著決定性作用，已日益受到人們的重視。隨著茶樹光合分子機(jī)制的揭示，光合規(guī)律的掌握和運(yùn)用，茶葉單產(chǎn)得到不斷提高，但茶樹光合作用的效率還不高，要實(shí)現(xiàn)茶葉生產(chǎn)的持續(xù)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)低耗，提高茶樹光合效率是一個(gè)重要的突破點(diǎn)。Lhcb基因家族作為與光合作用密切相關(guān)的基因，如楊樹（Populus trichocarpa）中得到了系統(tǒng)鑒定，并分為Lhcb1~8等亞家族[7-9]。Jiang[10]等研究發(fā)現(xiàn)芹菜中的lhcb1基因在干旱脅迫中的表達(dá)情況是降低的。目前，茶樹中卻尚未見到Lhcb基因家族的相關(guān)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】茶樹［Camellia sinensis(L.)O. Kuntze］是一種多年生木本植物，起源于我國的西南地區(qū)，具有喜濕耐陰的特征。我國茶區(qū)分布廣泛，部分茶區(qū)四季分明，雨量和太陽輻射能周年分布不均，6 月至9 月常發(fā)生高溫少雨、日照強(qiáng)烈的情況，故許多茶區(qū)都會(huì)先后出現(xiàn)不同程度的伏旱和秋旱[11]。近年來，隨著全球氣候變暖，極端高溫、干旱現(xiàn)象出現(xiàn)的頻率越來越高，干旱脅迫對(duì)茶樹生長發(fā)育帶來的負(fù)面問題越來越引起人們重視，了解并進(jìn)一步研究茶樹在干旱脅迫前后的變化，對(duì)優(yōu)化茶樹栽培管理、提高茶樹抗逆性及選育抗旱品種尤為重要[12]。茶作為全球三大無酒精飲料，有著很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[13]，而干旱脅迫不僅導(dǎo)致茶園總產(chǎn)量降低，還造成茶葉總蛋白、淀粉和雙糖含量降低，可溶性糖、可溶性蛋白和纖維素含量升高，使得茶葉品質(zhì)降低[14]，嚴(yán)重?fù)p害了茶產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[15]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以‘龍井43’‘舒茶早’和‘白葉一號(hào)’作為試驗(yàn)材料，首先克隆獲得茶樹CsLhcb1基因，利用聚乙二醇-6000（PEG-6000，Polyethylene glycol-6000）模擬干旱脅迫，再運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)分析茶樹CsLhcb1基因在干旱脅迫下的表達(dá)情況，為進(jìn)一步揭示茶樹CsLhcb1基因的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘龍井43’‘舒茶早’‘白葉一號(hào)’為兩年生茶樹扦插苗。預(yù)培養(yǎng)1 周后，將長勢一致的茶苗統(tǒng)一置于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物生長室內(nèi)，配制200 mg·mL-1PEG-6000（20% PEG）溶液，選取生長條件一致的茶苗，采用對(duì)扦插苗基部澆施的方式模擬干旱脅迫，對(duì)照組（CK）澆施等量蒸餾水，除施加的處理不同外，其他條件一致。上午9 時(shí)是取樣的第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0 h），并分別在處理后1、3、6、12、24 h進(jìn)行取樣，將所取材料立即置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)均設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：熒光定量PCR 儀（CFX96TMreal-time PCR system 平臺(tái)）；微量紫外分光光度計(jì)（Nanodrop ND 1000，上海譜元儀器有限公司）。

試劑：植物總RNA 提取試劑盒（RNA simple total RNA Kit，北京Tiangen 公司）；Prime Script RT 試劑盒（大連TaKaRa 公司）；Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）。

1.3 茶樹CsLhcb1 基因的克隆

采用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取茶樹總RNA，用分光光度計(jì)檢測所提取RNA 質(zhì)量，保存至-80℃?zhèn)溆?。按照Prime Script RT 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)茶樹CsLhcb1序列，如表1 所示，使用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)全長引物，將‘龍井43’的cDNA 作為模板，PCR 擴(kuò)增體系為20 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，45 個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸10 min。使用1.2%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR 結(jié)果進(jìn)行檢測后將剩余PCR 原液測序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 茶樹CsLhcb1 蛋白的生物信息分析

使用ProtParam 的在線工具分析蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量等理化性質(zhì)；借助DNAMAN 軟件對(duì)蛋白質(zhì)的親/疏水性分析；依托Swiss-Model 軟件預(yù)測茶樹CsLhcb1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用STRING 在線網(wǎng)站，預(yù)測茶樹CsLhcb1 蛋白潛在的互作關(guān)系；通過在線網(wǎng)頁NCBI 中的BLAST 工具同源比對(duì)不同物種Lhcb1 蛋白序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）；構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹依托MEGA 軟件。

1.5 茶樹CsLhcb1 基因在干旱脅迫下的表達(dá)分析

如表1 所示，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)CsLhcb1基因定量引物，選取茶樹CsGAPDH作為內(nèi)參基因[16]。選用Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn)，該反應(yīng)體系共20 μL，分別為：SYBR Green I mix酶10 μL；上下游引物各0.4 μL；模板2 μL；ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔCT法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsLchb1 基因的克隆與序列分析

利用NCBI 在線分析軟件BLAST 篩選出CsLchb1序列（LOC114265239） ， 序列ID 為XM_028206006.1，使用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，以‘龍井43’的cDNA 為模板經(jīng)PCR 擴(kuò)增，以CsLhcb1-F 和CsLhcb1-R 為引物，克隆得到CsLchb1基因，目的片段為810 bp（圖1）。

圖1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖Fig. 1 Agar gel electrophoresis of PCR amplification product

2.2 茶樹CsLchb1 基因所編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過NCBI 在線分析工具Conserved Domain Database（CDD）分析蛋白結(jié)構(gòu)域，茶樹CsLchb1基因所編碼的蛋白中存在兩個(gè)特殊結(jié)構(gòu)域，分別為：捕光色素蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)域（PLN00025），位于氨基酸序列第19 個(gè)和第269 個(gè)之間；葉綠素a/b結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域（pfam00504），位于氨基酸序列第68 個(gè)和第236 個(gè)之間。編碼蛋白屬于葉綠素a/b連接蛋白超家族成員（圖2）。

圖2 CsLhcb1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 2 Predicted conserved domain of CsLhcb1 protein

2.3 茶樹CsLhcb1 的生物信息分析

如圖3 所示，利用在線工具ProtParam 預(yù)測CsLhcb1 蛋白的分子式為C1328H2024N344O371S10。原子總數(shù)為4 077，分子量為29 065.36 Da，氨基酸數(shù)為269，屬于小分子蛋白；理論等電點(diǎn)為5.66，屬于酸性蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為20.26，屬于穩(wěn)定類蛋白；在親疏水性分析中得出，CsLhcb1 蛋白的平均親水性指數(shù)（Grand average of hydropathicity）為0.043，該蛋白疏水性氨基酸占比較高，屬于疏水性蛋白。

圖3 CsLhcb1 蛋白的親/疏水性預(yù)測Fig. 3 Predicted hydrophilicity/hydrophobicity of CsLhcb1 protein

對(duì)CsLhcb1編碼氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測，VMD 可視化顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、α 螺旋和β 折疊組成。通過Swiss-Model 軟件預(yù)測CsLhcb1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白主要由螺旋和折疊構(gòu)成，通過與豌豆PsLhcb1 蛋白對(duì)比發(fā)現(xiàn)，豌豆PsLhcb1 蛋白和茶樹CsLhcb1 蛋白結(jié)構(gòu)較為相似，結(jié)構(gòu)預(yù)測與二級(jí)結(jié)構(gòu)吻合。圖4 列舉了茶樹CsLhcb1 蛋白與豌豆PsLhcb1 蛋白的10 個(gè)差異位點(diǎn)，分別位于67（T）、95（R）、98（A）、104（G）、115（I）、121（Q）、177（F）、180（N）、218（I）、251（E）。

圖4 CsLhcb1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 4 Predicted tertiary structure of CsLhcb1 protein

2.4 茶樹CsLchb1 蛋白互作預(yù)測分析

利用STRING 在線網(wǎng)站，以擬南芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為參考，預(yù)測了LHCB1（茶樹CsLhcb1 蛋白）潛在的互作關(guān)系（圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LHCB1 與AT2G20060（核糖體蛋白L4/L1 家族）、AT1G64880（核糖體蛋白S5 家族蛋白）、RPL4（核糖體蛋白L4）、CAO（葉綠體信號(hào)識(shí)別顆粒組分）、CPFTSY（信號(hào)識(shí)別顆粒）存在較為直接的互作關(guān)系。其中AT2G20060、AT1G64880、RPL4 是核糖體的結(jié)構(gòu)成分，可以與rRNA 結(jié)合并參與蛋白質(zhì)的翻譯過程；CAO 可以與染色質(zhì)結(jié)合，參與響應(yīng)高光強(qiáng)、蛋白質(zhì)輸入葉綠體類囊體膜等過程。

圖5 LHCB1（CsLhcb1）蛋白互作預(yù)測與分析Fig. 5 Predicted and analyzed LHCB1 (CsLhcb1) protein interaction in tea plants

2.5 茶樹CsLhcb1 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

如圖6 所示，依托DNAMAN 對(duì)不同植物中Lhcb1 蛋白進(jìn)行同源比對(duì)，不同物種間具有高度同源性。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，茶樹Camellia sinensisCsLhcb1 蛋白與蔓花生Arachis duranensis（XP_015953926.1）和蒂羅花Telopea speciosissima（XP_043688472.1）聚為一類，表明該蛋白在進(jìn)化的過程中具有較近的親緣關(guān)系，與番木瓜Carica papaya（XP_021894790.1）、木豆Cajanus cajan（XP_020237928.1）和澳洲堅(jiān)果Macadamia integrifolia（XP_042504204.1）的蛋白進(jìn)化差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖7）。

圖6 茶樹與其他物種Lhcb1 蛋白的多重序列比對(duì)Fig. 6 Multiple sequence alignment on Lhcb1 proteins of tea plant and other species

圖7 茶樹CsLhcb1 蛋白與其他物種Lhcb1 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 7 Phylogenetic tree of CsLhcb1 protein in tea plant and Lhcb1 protein in other species

2.6 茶樹CsLchb1 基因在干旱脅迫下的表達(dá)分析

干旱脅迫處理下，‘龍井43’中的CsLhcb1基因相對(duì)表達(dá)量在1 h 時(shí)達(dá)到最高值，之后逐漸下降；在‘舒茶早’中該基因相對(duì)表達(dá)量也在1 h 時(shí)達(dá)到最高值，之后下降，24 h 又上升；而‘白葉一號(hào)’中該基因的相對(duì)表達(dá)量在6 h 時(shí)達(dá)到最高值，之后下降?？梢钥闯?，干旱處理下（20% PEG）CsLhcb1基因在3 個(gè)茶樹品種中表達(dá)量幾乎都是降低的，‘舒茶早’與CK 的表達(dá)量相差相對(duì)較小，除3 h 和6 h 時(shí)‘白葉一號(hào)’的表達(dá)量顯著高于其他品種，12 h 時(shí)略高于其他品種，其他時(shí)段均為‘舒茶早’的表達(dá)量高于其他品種。在1h 時(shí)‘舒茶早’的表達(dá)量分別為‘龍井43’和‘白葉一號(hào)’的1.49、1.6 倍；在24 h 時(shí)‘舒茶早’的表達(dá)量分別為‘龍井43’和‘白葉一號(hào)’的9.56、5.73 倍。上述結(jié)果說明，干旱脅迫影響了茶樹CsLhcb1的表達(dá)，且在不同的茶樹品種中表達(dá)量有差異（圖8）。

圖8 干旱脅迫下茶樹CsLhcb1 基因的表達(dá)量Fig. 8 Expressions of CsLhcb1 in tea plants under drought stress

3 討論

在高等植物的葉綠體中存在著兩個(gè)光系統(tǒng)分別是PSⅠ和PSⅡ，二者在光合作用中相輔相成，都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。PSⅠ具有4 種捕光色素蛋白，為Lhca1、Lhca2、Lhca3和Lhca4；PSⅡ具有3 種主要捕光色素蛋白，分別由Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3編碼，以及3 種次要捕光色素蛋白，分別由Lhcb4（cp29） 、Lhcb5（cp24） 和Lhcb6（cp26）編碼[18]。在蛋白結(jié)構(gòu)方面，主要捕光色素蛋白多數(shù)是三聚體，而次要捕光色素蛋白大多以單體形式存在，更靠近PSⅡ反應(yīng)中心，捕光色素蛋白復(fù)合體構(gòu)成PSⅡ外周捕光天線[4]。在功能方面，捕光色素蛋白復(fù)合體能夠傳遞和捕獲光能，分配和平衡PSⅡ和PSⅠ能量，光保護(hù)和過剩能量耗散，維持類囊體膜結(jié)構(gòu)[19-24]。其中，Lhcb 作為光合作用中重要的功能蛋白，在類囊體膜上的含量最為豐富，其結(jié)合葉綠素約占類囊體色素的50%，形成的復(fù)合體能夠迅速將光能傳到PSⅠ和PSⅡ反應(yīng)中心，使光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，促進(jìn)光合作用[25]。本研究首次從茶樹品種‘龍井43’中克隆得到CsLhcb1基因，生物信息分析表明：CsLhcb1基因所編碼的蛋白中包括一個(gè)捕光色素蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)域（PLN00025）和葉綠素a/b結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域（pfam00504）。茶樹為低光效植物，而光合效率又直接影響著茶葉的品質(zhì)與產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)，CsLhcb1 蛋白與蔓花生AdLhcb1 蛋白、蒂羅花TsLhcb1 蛋白具有高度保守性，若通過分子育種來提高茶樹光合效率時(shí)，蔓花生與蒂羅花或許可以作為理想的基因供體物種之一，并為分子進(jìn)化研究奠定理論基礎(chǔ)。

干旱脅迫導(dǎo)致茶樹生理水平發(fā)生一系列變化，如根系活力、光合作用能力及葉綠素含量下降，細(xì)胞質(zhì)膜透性、丙二醛（MDA）、可溶性蛋白質(zhì)及可溶性糖含量增加，多酚氧化酶 （PPO）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等保護(hù)酶呈先上升后下降的趨勢[26,27]。當(dāng)植物受到干旱脅迫時(shí)，為防止蒸騰作用導(dǎo)致更多的水分散失，氣孔會(huì)呈現(xiàn)一定程度的關(guān)閉，使得氣孔導(dǎo)度下降，氣孔導(dǎo)度的下降則導(dǎo)致從外界進(jìn)入植物葉片細(xì)胞的CO2量也會(huì)減少，這是導(dǎo)致光合作用下降的重要原因。除此之外，干旱脅迫還會(huì)從多個(gè)方面影響植物的光合能力，主要包括損傷光合系統(tǒng)的各種機(jī)構(gòu)、影響光合作用中電子的傳遞和光合磷酸化，以及對(duì)參與暗反應(yīng)有關(guān)的酶造成影響[28]。還有研究表明，在干旱脅迫下葉綠素的含量會(huì)降低，PEG 處理下的茶樹Fv/Fm和Fv/Fo明顯低于CK，說明干旱脅迫直接導(dǎo)致了葉綠素的講解，從而導(dǎo)致茶樹捕獲光能的效率降低[27]。本研究實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，在CK 處理下，‘龍井43’在1 h 的表達(dá)量顯著高于干旱脅迫，‘白葉一號(hào)’在3 h 和6 h 顯著高于干旱脅迫，本試驗(yàn)在上午9 時(shí)作為第一個(gè)取樣的時(shí)間段，1 h、3 h 和6 h 分別對(duì)應(yīng)上午10 時(shí)、12 時(shí)和下午3 時(shí)。由于該基因還受到生物鐘、溫度等環(huán)境因素的調(diào)節(jié)，可能在該時(shí)段較為活躍，表達(dá)量顯著高于其他時(shí)段，這也與胡志航等[29]的研究結(jié)果相符。本研究中，干旱脅迫下，茶樹CsLhcb1基因表達(dá)量降低。已有研究證明，在持續(xù)干旱下，細(xì)胞需要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累來調(diào)節(jié)水勢，合成這些物質(zhì)需要的能量來源于光合作用。捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因表達(dá)量增加可能促進(jìn)植物的光合作用，這也與趙彥等[30]研究結(jié)果類似。Loukehaich 等[31]發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，植物通用脅迫蛋白基因（SpUSP）過表達(dá)，27 個(gè)葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因表達(dá)量上調(diào)。Guo 等[32]以大麥為試驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)不同大麥品種間葉綠素a/b結(jié)合蛋白表達(dá)有差異。據(jù)推測，在干旱脅迫下，茶樹CsLhcb1基因可能通過參與光合作用的循環(huán)或調(diào)控植物對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)來發(fā)揮作用，由于光合作用的減弱，導(dǎo)致能量的捕獲和儲(chǔ)存受限，茶樹體內(nèi)積累的有機(jī)物分解供能時(shí)優(yōu)先供應(yīng)給相關(guān)抗逆基因的表達(dá)，可能導(dǎo)致茶樹CsLhcb1基因的表達(dá)量降低。

4 展望

本研究克隆獲得茶樹CsLhcb1基因，并對(duì)該基因生物信息及其在干旱脅迫下的基因表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析。但對(duì)CsLhcb1基因是依托何種分子機(jī)制來實(shí)現(xiàn)基因的表達(dá)調(diào)控以及它是如何響應(yīng)干旱脅迫的，這些均尚不清楚，仍需要進(jìn)一步的深入探究。