翁錦龍，熊尚全，江澍，鄭峰，林超，趙利

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）指急性阻塞的冠狀動脈血運(yùn)重建后造成不可逆損傷的病理過程，其可危及患者的生命安全，且具有較高的致死率［1］。近年來缺血性心臟病已逐漸成為心血管疾病患者的重要死亡原因之一［2］，而血運(yùn)重建是恢復(fù)心肌血供最直接、有效的治療手段，但其常伴隨再灌注損傷，進(jìn)而影響血運(yùn)重建效果［3］。同時，MIRI還是急性心肌梗死患者預(yù)后不良的關(guān)鍵影響因素，與后期心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)［4］。因此，如何有效防治MIRI以提高心肌缺血救治效果是當(dāng)前亟需解決的臨床問題。研究表明，核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號通路與心肌缺血損傷關(guān)系密切，而Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是其上游因子，故TLR4/NF-κB信號通路可作為中醫(yī)藥防治MIRI的靶點(diǎn)［5］。

瓜蔞薤白半夏湯是醫(yī)圣張仲景基于“陽微陰弦”病機(jī)理論創(chuàng)立的治療“胸痹病”的經(jīng)典名方，研究表明，該方可通過減輕炎癥反應(yīng)、抑制自噬、改善細(xì)胞凋亡等機(jī)制而減輕心肌細(xì)胞損傷，具有良好的心肌保護(hù)作用，且應(yīng)用前景廣泛［5］。但瓜蔞薤白半夏湯的心肌保護(hù)作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步挖掘。本研究以瓜蔞薤白半夏湯為干預(yù)藥物，旨在探究其對MIRI模型大鼠的心肌保護(hù)作用及機(jī)制，以期為發(fā)掘經(jīng)方提供有價值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時間 本實(shí)驗(yàn)時間為2022年2月至2023年2月。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 選取健康雄性SD大鼠40只，SPF級，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量（300±20）g，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010。在動物實(shí)驗(yàn)中心分籠飼養(yǎng)（5只/籠），大鼠可自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，不限制進(jìn)食，飼養(yǎng)溫度控制在18～22 ℃，相對濕度為40%～70%，12 h/12 h明暗晝夜循環(huán)，實(shí)驗(yàn)操作均符合動物倫理要求。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及儀器

1.3.1 藥物 制備瓜蔞薤白半夏湯［6］，具體藥材如下：瓜蔞24 g，薤白9 g、半夏12 g；統(tǒng)一由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院中藥房采購，藥材均為同一批次，將藥材放于2 L白酒（市售的米酒頭，酒精含量35%）中，攪拌后浸泡0.5～1.0 h以充分浸泡藥材，加入適量水，開啟自動煎藥機(jī)統(tǒng)一煎煮，按成人（70 kg）每日劑量換算，濃縮成含生藥1.3 g/ml的水煎液，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 試劑 吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidinedi thiocarbamate，PDTC）（生產(chǎn)批號：BM000043）、兔抗TLR4抗體（貨號：66350-1-Ig）、兔抗NF-κB抗體（貨號：66535-1-Ig）、GAPDH（貨號：60004-1-Ig）、山羊抗兔HRP二抗（貨號：SA00001-2）、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號：KE20005）、TNF-α ELISA試劑盒（貨號：KE20018）均購自Proteintech公司，PVDF膜（貨號：AR0136-02）、RIPA裂解液（貨號：AR0102）、蛋白酶抑制劑（貨號：AR1178）、BCA蛋白定量試劑盒（貨號：AR0198）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物（貨號：AR1111）均購自武漢博士德生物工程有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（貨號：A001-3）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（貨號：A003-1）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（貨號：A020-2）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3.3 儀器 DYCP-31DN型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），冷凍離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司，JID-17R），凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技有限公司，JS-2012），透射電鏡（日本日立公司，HT7700），SpectraMax酶標(biāo)儀（上海美谷分子儀器有限公司，CMax Plus），分光光度計（杭州米歐儀器有限公司，ND-100c），梯度PCR儀（杭州米歐儀器有限公司，MV-C155-ov71），RT-PCR儀（北京鯤鵬基因科技有限責(zé)任公司，Archimed X6）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 MIRI模型制備 采用左前降支結(jié)扎法制備MIRI模型［7］，具體如下：腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液以麻醉大鼠，取仰臥位固定，在其四肢皮下插入針電極并連接心電圖儀，待波形穩(wěn)定后行氣管插管，然后連接小動物呼吸機(jī)（潮氣量5 ml/100 g，頻率60～80次/min）。胸部皮膚消毒備皮，沿胸骨左緣第3～4肋處剪開肋間皮膚，逐層暴露心臟，在左心耳下方約2 mm處穿進(jìn)6-0帶線縫合針并穿過心肌表層，在肺動脈圓錐旁出針，將直徑1.5 mm的硅膠管放在結(jié)扎線與左前降支血管之間。結(jié)扎線系緊時，左前降支受硅膠管壓迫而閉塞。心尖及左心室前壁變白，心電圖檢查顯示ST段即刻抬高、T波高聳，結(jié)扎線下心肌顏色變暗，左心室發(fā)紺蒼白，提示心肌缺血；30 min后松開結(jié)扎線，左心室發(fā)紺蒼白區(qū)出現(xiàn)充血反應(yīng)，再灌注120 min以制備MIRI模型。

1.4.2 分組與干預(yù)方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠分為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）、瓜蔞薤白半夏湯組（C組）、NF-κB抑制劑組（D組），每組10只。采用苦味酸在大鼠頭、四肢部位進(jìn)行染色標(biāo)記，四組大鼠在MIRI模型制備前采用藥物灌胃法進(jìn)行預(yù)處理，方法參照文獻(xiàn)［8］，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物劑量換算給藥量〔大鼠給藥量（g/kg）=成人給藥量（g/kg）×6.3〕，其中C組、D組給予瓜蔞薤白半夏湯水煎液預(yù)處理，給藥劑量為4.05 g/kg，A組、B組給予等量0.9%氯化鈉溶液預(yù)處理，均1次/d，連續(xù)干預(yù)7 d。此外，A組大鼠于末次給藥后1 h開胸并在冠狀動脈處完成穿線，但不結(jié)扎；其余三組大鼠于末次給藥后1 h制備MIRI模型，其中D組大鼠于再灌注前10 min腹腔注射PDTC 100 mg/kg。

1.4.3 血清與心肌組織標(biāo)本采集 再灌注結(jié)束后采集四組大鼠腹主動脈血5 ml，4 ℃環(huán)境下離心15 min（離心半徑10 cm，離心機(jī)轉(zhuǎn)速3 000 r/min），分離血清待檢。然后結(jié)扎大鼠冠狀動脈，在其左頸動脈注射3%伊文思藍(lán)2 ml后迅速摘除心臟，洗凈殘血，剪去多余組織，采用濾紙吸干，取部分心肌組織標(biāo)本置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?；余心肌組織標(biāo)本固定于4%多聚甲醛溶液中。

1.4.4 TTC法檢測心肌梗死面積百分比 采用0.9%氯化鈉溶液洗凈心臟殘血，將心臟置于-20 ℃環(huán)境中冷凍10 min，采用組織切片機(jī)沿心臟短軸方向?qū)⑵淝谐?.0～1.5 mm薄片，共5片，將切片置于2% TTC磷酸鹽緩沖液（pH=7.3）中，37 ℃避光孵育30 min，加入4%多聚甲醛溶液于室溫固定10 min。拍照記錄并采用Image J軟件計算心肌梗死面積百分比，心肌梗死面積百分比=心肌梗死區(qū)面積/心肌切片區(qū)面積×100%。

1.4.5 心肌組織病理學(xué)檢查 （1）HE染色：將大鼠心臟置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，烘干，二甲苯脫蠟，梯度乙醇溶液脫水處理，按照HE染色試劑盒說明書染色。（2）Masson染色：將大鼠心臟置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，按照試劑盒說明書進(jìn)行Masson染色，觀察心肌纖維化情況，其中藍(lán)色代表膠原纖維、紅色代表肌纖維。梯度乙醇溶液脫水后采用二甲苯透明、中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.6 血清炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取血清，采用ELISA檢測血清IL-1β、TNF-α水平，具體操作嚴(yán)格參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。采用TBA法檢測血清MDA水平，采用WST-1法檢測血清SOD活性，采用微板法檢測血清LDH活性，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.7 透射電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu) 切取大小約1 mm×1 mm×1 mm的心肌組織，置于2.5%戊二醛中固定2～4 h，采用磷酸漂洗液漂洗3次，采用1%鋨酸于4 ℃環(huán)境下固定2 h；采用ddH2O漂洗3次，梯度乙醇溶液脫水，環(huán)氧丙烷過渡，812樹脂梯度滲透后包埋，60 ℃聚合，采用Leica UC7型超薄切片機(jī)將包埋塊進(jìn)行半薄定位及超薄切片，采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對切片進(jìn)行雙染色，在透射電鏡下觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)。

1.4.8 Western blot法檢測心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平 取心肌組織，沖洗干凈后進(jìn)行組織勻漿，低溫高速（4 ℃，12 000×g）離心15 min以提取胞質(zhì)蛋白，采用BCA法在562 nm波長處測定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣本測得的OD值帶入曲線，得到蛋白濃度。然后進(jìn)行SDS-PAGE，將轉(zhuǎn)膜夾板放入含轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)移電泳槽中轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后漂洗3次，放入5% BSA后室溫封閉2 h，稀釋一抗至工作濃度（TLR4 1∶4 000，NF-κB p65 1∶2 000，GAPDH 1∶20 000），將膜置于一抗溶液中，于4 ℃環(huán)境下?lián)u床、孵育過夜，次日洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h，加入顯影液，置于化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光成像，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.4.9 RT-PCR檢測心肌組織TLR4、NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量 稱取100～150 μg心肌組織塊，置于預(yù)冷研磨機(jī)中進(jìn)行粉碎（頻率60 Hz，30 s，振動3次），采用RNA提取試劑盒提取樣本組織RNA，取5 μl RNA進(jìn)行電泳以檢測RNA的完整性，從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找大鼠TLR4、NF-κB基因的mRNA序列，并以相應(yīng)種屬的GAPDH作為內(nèi)參基因，根據(jù)引物設(shè)計原則，采用Primer Premier 5.0設(shè)計目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的特異性引物，引物設(shè)計由上海博尚生物工程技術(shù)有限公司合成，RTPCR引物序列見表1。將樣本組織RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Archimed X6型熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為20 μl，循環(huán)40次，每組設(shè)3個復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死面積百分比 A組、B組、C組、D組大鼠心肌梗死面積百分比分別為（1.2±0.5）%、（28.6±2.2）%、（18.4±2.9）%、（24.4±1.2）%。四組大鼠心肌梗死面積百分比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=232.00，P＜0.001）；B組大鼠心肌梗死面積百分比高于A組，C組和D組大鼠心肌梗死面積百分比低于B組，D組大鼠心肌梗死面積百分比高于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 四組大鼠心肌組織TTC染色結(jié)果Figure 1 TTC staining results of myocardial tissue in the four groups of rats

2.2 心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，A組大鼠心肌纖維排列整齊，心肌組織形態(tài)正常，可見橫紋結(jié)構(gòu)；B組大鼠心肌纖維呈不規(guī)則排列，橫紋斷裂，出現(xiàn)心肌間質(zhì)水腫且有明顯壞死；C組大鼠心肌組織纖維排列、心肌組織形態(tài)改變、橫紋結(jié)構(gòu)改變均優(yōu)于B組；D組大鼠細(xì)胞核散落在外側(cè)明顯，見圖2。Masson染色結(jié)果顯示，A組大鼠心肌細(xì)胞排列有序；B組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，少部分膠原纖維染色陽性；C組和D組大鼠心肌細(xì)胞排列較規(guī)則，幾乎無膠原纖維染色陽性，見圖3。

圖2 四組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果（×200）Figure 2 HE staining results of myocardial tissue in the four groups of rats

圖3 四組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果（×200）Figure 3 Masson staining results of myocardial tissue in the four groups of rats

2.3 血清炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo) 四組大鼠血清IL-1β、TNF-α、MDA水平及SOD、LDH活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組大鼠血清IL-1β、TNF-α、MDA水平及LDH活性高于A組，血清SOD活性低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C組和D組大鼠血清IL-1β、TNF-α、MDA水平及LDH活性低于B組，血清SOD活性高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；D組大鼠血清IL-1β、TNF-α、MDA水平及LDH活性低于C組，血清SOD活性高于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 四組大鼠血清炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s，n=10）Table 2 Comparison of serum inflammatory factors and oxidative stress index in the four groups of rats

表2 四組大鼠血清炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s，n=10）Table 2 Comparison of serum inflammatory factors and oxidative stress index in the four groups of rats

注：A組為假手術(shù)組，B組為模型組，C組為瓜蔞薤白半夏湯組，D組為核因子κB（NF-κB）抑制劑組；MDA=丙二醛，SOD=超氧化物歧化酶，LDH=乳酸脫氫酶；a表示與A組比較，P＜0.05；b表示與B組比較，P＜0.05；c表示與C組比較，P＜0.05

LDH（U/g prot）A組41.23±2.42 13.52±0.83 9.34±0.9892.33±1.7832.68±2.12 B組149.90±7.81a 56.02±0.71a 33.32±2.02a 20.18±0.67a 101.70±2.16a C組97.60±3.09b 40.82±1.88b 23.13±0.96b 40.89±2.18b72.86±1.68b D組70.46±2.00bc 25.79±1.45bc 15.62±0.51bc 66.03±1.62bc 51.68±2.11bc F值1 063.001 992.00676.703 549.002 133.00 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001組別IL-1β（pg/ml）TNF-α（pg/ml）MDA（nmol/ml）SOD（U/mg prot）

2.4 心肌組織超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡掃描結(jié)果顯示，A組大鼠心肌纖維排列基本規(guī)則、整齊，肌絲清晰，線粒體基本完整，線粒體嵴排列整齊、無斷裂，細(xì)胞中無明顯自噬泡；B組大鼠心肌纖維排列紊亂、斷裂，線粒體大小不等，可見聚集，線粒體嵴明顯減少、變短，細(xì)胞質(zhì)中存在較多空泡，自噬體較多；C組大鼠心肌纖維排列較整齊，可觀察到部分肌絲，少數(shù)線粒體嵴斷裂，可見少數(shù)自噬泡；D組大鼠心肌纖維斷裂，線粒體聚集、大小不等，線粒體嵴斷裂現(xiàn)象嚴(yán)重，細(xì)胞質(zhì)部分呈空泡化，見圖4。

圖4 四組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)（×6 000）Figure 4 Ultrastructure of myocardial tissue in the four groups of rats

2.5 心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平、mRNA相對表達(dá)量 四組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平、mRNA相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平、mRNA相對表達(dá)量高于A組，C組和D組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平、mRNA相對表達(dá)量低于B組，D組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平、mRNA相對表達(dá)量低于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 四組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平、mRNA相對表達(dá)量比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of protein expression level and mRNA relative expression level of TLR4 and NF-κB p65 in myocardial tissue in the four groups of rats

表3 四組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平、mRNA相對表達(dá)量比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of protein expression level and mRNA relative expression level of TLR4 and NF-κB p65 in myocardial tissue in the four groups of rats

注：a表示與A組比較，P＜0.05；b表示與B組比較，P＜0.05；c表示與C組比較，P＜0.05

TLR4NF-κB p65蛋白表達(dá)水平 mRNA相對表達(dá)量蛋白表達(dá)水平 mRNA相對表達(dá)量A組0.35±0.021.00±0.000.57±0.081.00±0.00 B組1.06±0.03a7.54±0.19a1.71±0.04a6.34±0.33a C組0.80±0.11b2.78±0.46b1.26±0.15b2.64±0.18b D組0.42±0.02bc1.14±0.03bc0.92±0.21bc1.17±0.06bc F值101.40442.6538.87502.30 P值0.002＜0.0010.001＜0.001組別

3 討論

目前，開通狹窄或閉塞血管是心肌梗死患者的首選治療方案，但缺血心肌再灌注可能造成心肌組織二次損傷，進(jìn)而引起心律失常、心力衰竭等并發(fā)癥，故減少M(fèi)IRI的發(fā)生對于挽救梗死心肌組織具有重要意義。MURRY等［9］于1986年首次提出心肌缺血預(yù)處理的概念，即血管再通前對心肌預(yù)先進(jìn)行數(shù)次短時間的缺血再灌注處理，是延緩后期心肌損傷的一項(xiàng)內(nèi)源性措施，但該方式對操作者的技術(shù)要求較高，在臨床上具有一定操作難度。近年來有關(guān)中醫(yī)藥防治MIRI的研究較多，一項(xiàng)文獻(xiàn)計量學(xué)分析結(jié)果顯示，中醫(yī)藥在預(yù)防MIRI發(fā)生和促進(jìn)經(jīng)皮冠狀動脈介入治療患者康復(fù)方面具有良好作用［10］。如敖玉涵等［11］在常規(guī)診療方案基礎(chǔ)上聯(lián)用參芪瓜蔞半夏薤白湯治療PCI后患者，結(jié)果顯示，治療后患者心絞痛癥狀、中醫(yī)證候療效、硝酸甘油用量及血脂指標(biāo)改善效果均確切。瓜蔞薤白半夏湯出自張仲景《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證并治》，該方主要由栝樓實(shí)、薤白、半夏及白酒組成，具有宣痹通陽、祛痰散結(jié)之功效，是治療胸陽不振、痰濁痹阻之胸痹的代表方。

本研究旨在探討瓜蔞薤白半夏湯對MIRI模型大鼠的心肌保護(hù)作用及機(jī)制，結(jié)果顯示，B組大鼠心肌梗死面積百分比高于A組，C組大鼠心肌梗死面積百分比低于B組；HE染色結(jié)果顯示，C組大鼠心肌組織纖維排列、心肌組織形態(tài)改變、橫紋結(jié)構(gòu)改變均優(yōu)于B組；Masson染色結(jié)果顯示，B組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，少部分膠原纖維染色陽性；C組大鼠心肌細(xì)胞排列較規(guī)則，幾乎無膠原纖維染色陽性。提示瓜蔞薤白半夏湯預(yù)處理可有效縮小MIRI模型大鼠心肌梗死面積，保護(hù)心肌細(xì)胞。目前認(rèn)為，MIRI的發(fā)病機(jī)制主要包括線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和凋亡級聯(lián)反應(yīng)等，其中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激貫穿MIRI的全過程［12-13］。炎癥反應(yīng)是機(jī)體對損傷因子的防御行為，適度的炎癥反應(yīng)可參與組織損傷的修復(fù)過程，而過度的炎癥反應(yīng)可引發(fā)嚴(yán)重的功能損傷，目前認(rèn)為心肌二次損傷后的過度炎癥反應(yīng)是MIRI的重要發(fā)病機(jī)制之一［14］，故抑制炎癥因子過度釋放可保護(hù)受損心肌組織，進(jìn)而減輕MIRI后的心功能障礙［15］。自噬是一種通過自我清除模式使自身細(xì)胞得到更新的能力。研究表明，提高自噬水平可提高M(jìn)IRI病變過程中心肌細(xì)胞的生存機(jī)會［15］。本研究結(jié)果顯示，B組大鼠血清IL-1β、TNF-α、MDA水平及LDH活性高于A組，血清SOD活性低于A組；C組大鼠血清IL-1β、TNF-α、MDA水平及LDH活性低于B組，血清SOD活性高于B組。透射電鏡掃描結(jié)果顯示，B組大鼠細(xì)胞質(zhì)中存在較多空泡，自噬體較多，C組大鼠心肌組織可見少數(shù)自噬泡。提示瓜蔞薤白半夏湯預(yù)處理可減輕MIRI模型大鼠的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及抑制心肌細(xì)胞自噬小體產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

研究表明，NF-κB信號通路作為關(guān)鍵炎癥信號通路，在MIRI期間被激活并引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而加重心肌損傷程度［16］。Toll樣受體是機(jī)體固有免疫的關(guān)鍵組成部分，作為炎癥通路中的模式識別受體，其在MIRI發(fā)生時可激活下游信號分子，促使TNF-α、IL-1β等促炎因子釋放；此外，作為NF-κB的上游信號，TLR4參與了MIRI的發(fā)生過程［17］。且目前TLR4/NF-κB信號通路已成為MIRI的治療靶點(diǎn)，其已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。本研究結(jié)果顯示，B組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平、mRNA相對表達(dá)量高于A組，C組和D組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平、mRNA相對表達(dá)量低于B組，提示瓜蔞薤白半夏湯預(yù)處理可抑制TLR4/NF-κB信號通路。

目前研究認(rèn)為，抑制NF-κB活性能有效減輕心肌氧化損傷，從而起到心肌保護(hù)作用［18］，而為了明確瓜蔞薤白半夏湯對TLR4/NF-κB信號通路的調(diào)控作用，本研究在瓜蔞薤白半夏湯預(yù)處理基礎(chǔ)上加用了NF-κB抑制劑，結(jié)果顯示，D組大鼠血清IL-1β、TNF-α、MDA水平及LDH活性低于C組，血清SOD活性高于C組，提示瓜蔞薤白半夏湯預(yù)處理可通過抑制NF-κB信號通路而減輕MIRI模型大鼠的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激。但D組大鼠心肌梗死面積百分比高于C組，D組大鼠細(xì)胞核散落在外側(cè)明顯、心肌纖維斷裂，線粒體聚集、大小不等，線粒體嵴斷裂現(xiàn)象嚴(yán)重，細(xì)胞質(zhì)部分呈空泡化，提示與瓜蔞薤白半夏湯預(yù)處理相比，增加NF-κB抑制劑并未發(fā)揮更好的心肌保護(hù)作用，分析原因可能為：抑制TLR4/NF-κB信號通路雖能減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，但也可能抑制了機(jī)體的正常自我防御功能；而瓜蔞薤白半夏湯是通過調(diào)控機(jī)體免疫平衡而發(fā)揮心肌保護(hù)作用的，其除了調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路外，還可能通過調(diào)控其他信號分子而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，這值得進(jìn)一步探究。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以加用NF-κB通路激動劑，分析不同劑量瓜蔞薤白半夏湯對MIRI的心肌保護(hù)作用，從細(xì)胞層面驗(yàn)證該方對缺血缺氧心肌細(xì)胞模型的保護(hù)作用機(jī)制，以期為臨床防治MIRI提供更可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，瓜蔞薤白半夏湯預(yù)處理可減輕炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及抑制心肌細(xì)胞自噬小體產(chǎn)生，進(jìn)而縮小MIRI模型大鼠心肌梗死面積，保護(hù)心肌細(xì)胞，其機(jī)制可能與瓜蔞薤白半夏湯抑制TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)，這為臨床防治MIRI后的心肌損傷提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：翁錦龍進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實(shí)施與可行性分析，負(fù)責(zé)撰寫、修訂論文，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；翁錦龍、熊尚全、江澍、鄭峰、林超、趙利進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；翁錦龍、熊尚全、江澍進(jìn)行結(jié)果分析與解釋。

本文無利益沖突。