曾稍俏

(漳州城市職業(yè)學(xué)院 食品工程系,福建 漳州 363000)

木耳菜(Gynuracusimbua)又稱紫角葉、藤菜、豆腐菜等,是一種原產(chǎn)于亞熱帶地區(qū)的落葵科草本植物[1]。隨著蔬菜產(chǎn)業(yè)迅速壯大和品種逐漸豐富,我國(guó)各地對(duì)木耳菜的種植數(shù)量逐漸增加。木耳菜含有豐富的蛋白質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),還含有機(jī)酸、黃酮、皂苷、黏多糖和葡聚糖等天然有效成分,具有清血解毒、降壓、利尿、健腦、清熱和降低膽固醇等生理作用,因此被廣泛視為一種有益健康的蔬菜[2-3]。黃酮類化合物廣泛存在于藥草、蔬菜、谷物和水果等植物中,具有保護(hù)心腦血管、抗氧化和延緩衰老等生理活性[4-5]。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)木耳菜的研究主要集中在栽培技術(shù)和加工工藝方面。許為義等[6]研究了基質(zhì)和農(nóng)藥對(duì)木耳菜富硒能力的影響,結(jié)果表明相對(duì)于土壤基質(zhì),火山巖表現(xiàn)出更好的促進(jìn)作用;草甘膦和氯氰菊酯對(duì)木耳菜的富硒均有促進(jìn)效果,但草甘膦促進(jìn)作用更為顯著。鄭植等[7]通過超聲波輔助提取法對(duì)木耳菜的果膠資源進(jìn)行提取,結(jié)果表明木耳菜果膠提取率達(dá)到19.22%,所提取的果膠符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),是一種具有抗氧化活性的低酯果膠。目前,尚未有關(guān)于木耳菜中黃酮的提取和開發(fā)的報(bào)道。因此,提高木耳菜的經(jīng)濟(jì)附加值,合理利用木耳菜資源,是木耳菜產(chǎn)業(yè)深度發(fā)展的重要方向?，F(xiàn)代科技的發(fā)展推動(dòng)了超聲波輔助提取方法在黃酮提取中的應(yīng)用,超聲波輔助提取方法操作簡(jiǎn)便、無需添加化學(xué)試劑,能更好地保留黃酮化合物的活性成分,符合現(xiàn)代化和環(huán)?；纳a(chǎn)要求[8]。牛金鴿等[9]研究了超聲波對(duì)藏羊皮膠原蛋白肽提取率及功能活性的影響,結(jié)果表明超聲波輔助處理能顯著提高膠原蛋白肽提取率,并能提高膠原蛋白肽的還原力和OH自由基清除率。因此,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步使用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)木耳菜總黃酮的超聲波輔助提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,并確定最佳工藝參數(shù),最后評(píng)價(jià)其抗氧化活性,為木耳菜作為天然綠色抗氧化添加劑的應(yīng)用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木耳菜,購(gòu)自漳州市新華都超市西洋坪店,經(jīng)黃寶華教授鑒定為落葵科木耳菜[Gynuracusimbua(D.Don) S.Moore in Journ];試劑有蘆丁(福州飛凈生物科技有限公司,標(biāo)準(zhǔn)品)、乙醇(動(dòng)力派(汕頭)食品有限公司,食品級(jí))等,其他均為市售分析純?cè)噭?/p>

儀器有超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,KQ100DE)、紫外-可見分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司,UV-200)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 使用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇配制含有0.05g/L蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)液[10]。取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液,分別加入到10mL容量瓶中。隨后,依次向容量瓶中加入2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的NaNO2溶液和1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的Al(NO)3溶液,搖勻靜置5min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液2mL,定容后靜置6min,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液,并測(cè)得510nm處的吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo),吸光度作為縱坐標(biāo),得到了標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過回歸分析,計(jì)算得到了回歸方程:y=0.9637x-0.0475,相關(guān)系數(shù)R2為0.9996。

1.2.2 木耳菜總黃酮的提取 將購(gòu)買的木耳菜從超市中取回后,進(jìn)行充分洗凈,并自然晾干。然后將完全干燥的木耳菜進(jìn)行細(xì)碎處理,通過60目篩。取質(zhì)量為m(g)的木耳菜樣品粉末置于100mL燒瓶中,按照單因素工藝條件加一定體積的乙醇,并置于超聲波輔助提取器中進(jìn)行提取。提取結(jié)束后,通過過濾、濃縮和定容等步驟,得到木耳菜總黃酮提取液V(mL)。

吸取1mL木耳菜總黃酮提取液,按1.2.1方法顯色,測(cè)得在510nm處的吸光度,通過回歸方程換算得到總黃酮提取液質(zhì)量濃度為b(g/L)?？傸S酮提取率Y(mg/g)計(jì)算公式如下:

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 總黃酮提取的單因素水平如表1所示。由表1可知,通過一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)成功確定了乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度和液料比的最佳取值范圍。在此基礎(chǔ)上,通過固定其他3個(gè)因素水平,分別改變乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度和液料比的水平,來考察這些變化對(duì)木耳菜總黃酮提取率的影響,以確定最佳的提取條件。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 因素編碼水平如表2所示。由表2可知,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇了4個(gè)自變量,以總黃酮提取率Y作為響應(yīng)值,進(jìn)一步使用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)了一個(gè)包含4個(gè)因素和3個(gè)水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案。

表2 因素編碼水平Tab.2 Factor coding level

1.3 木耳菜總黃酮的抗氧化活性

1.3.1 DPPH自由基清除率 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的DPPH粉末,用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇配成100mg/L DPPH儲(chǔ)備液,并將其儲(chǔ)存在2～4℃的環(huán)境中。將2.0mL的木耳菜總黃酮提取液分別吸取到10mL容量瓶中,加入2mL質(zhì)量濃度為100mg/L的DPPH儲(chǔ)備液到樣品中,搖勻后在暗處?kù)o置30min。隨后,使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其在510nm處的吸光度,記為Ai。接下來,取相同體積的木耳菜總黃酮提取液,將其中的DPPH儲(chǔ)備液用2.0mL無水乙醇代替,測(cè)得吸光度,記為Aj。將木耳菜總黃酮提取液替換成2.0mL無水乙醇,測(cè)得吸光度,記為A0。并以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率R(%)計(jì)算公式如下:

1.3.2 OH自由基清除率 將2.0mL木耳菜總黃酮提取液分別吸取到10mL容量瓶中,先后加入6.0mmol/L FeSO4溶液、8.0mmol/L水楊酸溶液、8.8mmol/L H2O2溶液各2.0mL。搖勻后靜置30min,接著在510nm處測(cè)定其吸光度值,記為Am;再以蒸餾水替換上述H2O2溶液,測(cè)得吸光度值為An;以蒸餾水替換上述木耳菜總黃酮提取液,測(cè)得吸光度值為Ak。并以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。OH自由基的清除率Q(%)計(jì)算公式如下:

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響如圖1所示。由圖1可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí),提取率最大。這是因?yàn)楫?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較小時(shí),乙醇中的水分含量相對(duì)較高,乙醇的溶劑力較強(qiáng),但溶劑的極性也相對(duì)較大,使得一些脂溶性和醇溶性的黃酮類物質(zhì)不能充分溶解在乙醇中,從而降低了提取率。而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí),同樣導(dǎo)致木耳菜中的一些非黃酮類脂溶性和醇溶性物質(zhì)化合物的溶解和溶出,降低了黃酮的提取率[11]。因此,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響圖2 超聲時(shí)間的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fractionFig.2 Effect of ultrasonic time

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響如圖2所示。由圖2可知,超聲時(shí)間為30min時(shí),提取率最大。這是因?yàn)楫?dāng)超聲時(shí)間較短時(shí),植物細(xì)胞壁未能充分破壞,導(dǎo)致黃酮類化合物無法充分釋放,從而降低了提取率。然而,隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到更大程度的破壞,進(jìn)一步提高了木耳菜中總黃酮溶解出來的數(shù)量,提高了提取率。然而,當(dāng)超聲時(shí)間超過30min時(shí),超聲波的高強(qiáng)度震蕩對(duì)總黃酮的分子結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞,從而降低了提取率[12]。因此,選擇超聲時(shí)間為30min。

2.1.3 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響如圖3所示。由圖3可知,超聲溫度為60℃時(shí),提取率最大。這是因?yàn)楫?dāng)超聲溫度較低時(shí),沒有足夠的熱能來促進(jìn)總黃酮的釋放和溶解,總黃酮提取率較低。隨著超聲溫度的升高,黃酮類化合物分子的熱運(yùn)動(dòng)能量增加,擴(kuò)散速率加快,從而增加了黃酮類化合物在溶劑中的溶解度,提高了總黃酮的提取率。然而,當(dāng)超聲溫度超過60℃時(shí),繼續(xù)增加溫度將導(dǎo)致部分黃酮類化合物化學(xué)鍵斷裂,分子結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生改變,從而降低了黃酮類化合物的穩(wěn)定性和可提取性[13]。因此,選擇超聲溫度為60℃。

圖3 超聲溫度的影響圖4 液料比的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperatureFig.4 Effect of liquid-material ratio

2.1.4 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響如圖4所示。由圖4可知,液料比為40mL/g時(shí),提取率最大。這是因?yàn)橐毫媳容^小時(shí),溶劑的量相對(duì)較少,不能充分地覆蓋原料,導(dǎo)致超聲波無法充分地穿透和破壞原料細(xì)胞壁,影響了總黃酮的釋放和溶解。隨著液料比的增加,提取溶劑相對(duì)于樣品的比例增加,溶劑能更好地覆蓋樣品表面,使得樣品中的化合物被更容易地提取出來,有利于樣品中總黃酮的溶出。但液料比高于40mL/g時(shí),樣品中總黃酮已經(jīng)完全溶解出來,進(jìn)一步增加液料比將無法提高總黃酮的提取率,反而會(huì)增加后續(xù)過濾、分離和濃縮等單元操作中總黃酮的損失[14]。因此,選擇液料比為40mL/g。

2.2 木耳菜總黃酮優(yōu)化實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 使用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法所得到的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果如表3所示。由表3可知,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇了乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲溫度(C)和液料比(D)4個(gè)自變量,并以總黃酮提取率Y作為響應(yīng)值。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Experimental results of Box-Behnken

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析 使用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)表3中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了方差分析,以確定實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)變量方差的貢獻(xiàn)程度,得到了回歸模型方程為Y=53.49+4.42A-1.24B+5.35C+3.05D+2.72AB-1.96AC+1.17AD+0.92BC-2.00BD-0.10CD-7.58A2-2.74B2-7.55C2-7.49D2。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

2.2.3 因素交互作用對(duì)木耳菜總黃酮提取率的影響 為了更直觀地觀察4個(gè)因素的交互作用,繪制了等高線圖和響應(yīng)面圖,如圖5～10所示?？梢越柚憫?yīng)面和等高線來評(píng)估各個(gè)因素之間的交互作用對(duì)結(jié)果的影響程度。如果響應(yīng)面越陡峭、等高線越密集,說明各因素之間的交互作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響;反之,如果響應(yīng)面較平緩、等高線較稀疏,則表示交互作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小[15]。

(a) 響應(yīng)面圖 (b) 等高線圖圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間的交互作用Fig.5 Interaction between ethanol volume fraction and ultrasonic time

由圖5可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定時(shí),木耳菜總黃酮的提取率隨著超聲時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。同樣的,當(dāng)超聲時(shí)間保持不變時(shí),提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先升高后降低。從響應(yīng)面圖的陡峭程度和等高線圖的形狀可以看出,二者之間存在極顯著的交互作用。

由圖6可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定時(shí),木耳菜總黃酮的提取率隨著超聲溫度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。同樣的,當(dāng)超聲溫度保持不變時(shí),提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先升高后降低。從響應(yīng)面圖的陡峭程度和等高線圖的形狀可以看出,二者之間存在極顯著的交互作用。

(a) 響應(yīng)面圖 (b) 等高線圖圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲溫度的交互作用Fig.6 Interaction between ethanol volume fraction and ultrasonic temperature

由圖7可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定時(shí),木耳菜總黃酮的提取率隨著液料比的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。同樣的,當(dāng)液料比保持不變時(shí),提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先升高后降低。從響應(yīng)面圖的陡峭程度和等高線圖的形狀可以看出,二者之間存在顯著的交互作用。

(a) 響應(yīng)面圖 (b) 等高線圖圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的交互作用Fig.7 Interaction between ethanol volume fraction and liquid-material ratio

由圖8可知,當(dāng)超聲時(shí)間固定時(shí),木耳菜總黃酮的提取率隨著超聲溫度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。同樣的,當(dāng)超聲溫度保持不變時(shí),提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低。從響應(yīng)面圖的陡峭度和等高線圖的形狀可以看出,二者之間存在的交互作用不顯著。

(a) 響應(yīng)面圖 (b) 等高線圖圖8 超聲時(shí)間與超聲溫度的交互作用Fig.8 Interaction between ultrasonic time and temperature

由圖9可知,當(dāng)超聲時(shí)間固定時(shí),木耳菜總黃酮的提取率隨著液料比的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。同樣的,當(dāng)液料比保持不變時(shí),提取率隨著超聲時(shí)間的增加先升高后降低。從響應(yīng)面圖的陡峭程度和等高線圖的形狀可以看出,二者之間存在極顯著的交互作用。

(a) 響應(yīng)面圖 (b) 等高線圖圖9 超聲時(shí)間與液料比的交互作用Fig.9 Interaction between ultrasonic time and liquid-material ratio

由圖10可知,當(dāng)超聲溫度固定時(shí),木耳菜總黃酮的提取率隨著液料比的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。同樣的,當(dāng)液料比保持不變時(shí),提取率隨著超聲溫度的升高先升高后降低。從響應(yīng)面圖的陡峭程度和等高線圖的形狀可以看出,二者之間存在的交互作用不顯著。

(a) 響應(yīng)面圖 (b) 等高線圖圖10 超聲溫度與液料比的交互作用Fig.10 Interaction between ultrasonic temperature and liquid-material ratio

2.2.4 回歸模型最優(yōu)化驗(yàn)證 經(jīng)過使用響應(yīng)面軟件進(jìn)行優(yōu)化后,得到了最優(yōu)的木耳菜總黃酮提取工藝條件參數(shù):乙醇體積分?jǐn)?shù)為72.44%、超聲時(shí)間為28.61min、超聲溫度為63.13℃、液料比為42.39mL/g。模型預(yù)測(cè)顯示,木耳菜的總黃酮提取率可達(dá)到55.32mg/g。為了操作的便捷性,將最佳工藝參數(shù)微調(diào)為整數(shù):乙醇體積分?jǐn)?shù)為72%、超聲時(shí)間為29min、超聲溫度為63℃、液料比為42mL/g。在此條件下,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),實(shí)際得到木耳菜總黃酮的提取率為54.23mg/g,與理論最大值的相對(duì)誤差僅為1.97%,這說明回歸模型對(duì)于木耳菜總黃酮的提取率預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。值得注意的是,經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化后,木耳菜總黃酮的提取率與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)提取率最高的2組數(shù)據(jù)是一致的。通過比較均值,發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的總黃酮提取率比中心點(diǎn)高0.74mg/g,即提高了1.38%,說明通過響應(yīng)面優(yōu)化可以獲得更高提取率的工藝參數(shù),實(shí)現(xiàn)更高效的木耳菜總黃酮提取,為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供了有力支持。

2.3 木耳菜總黃酮的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率 維生素C和木耳菜總黃酮對(duì)自由基的清除率如圖11所示。由圖11(a)可知,隨著木耳菜總黃酮質(zhì)量濃度的增加,可以觀察到對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,木耳菜總黃酮的半數(shù)抑制濃度值(IC50)為69.61mg/L。特別是當(dāng)木耳菜總黃酮的質(zhì)量濃度達(dá)到100mg/L時(shí),其對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到68.67%,相當(dāng)于維生素C的82.62%。說明木耳菜總黃酮具備一定的DPPH自由基清除能力,但相對(duì)于維生素C來說,其清除能力略低。

(a) DPPH自由基 (b) OH自由基圖11 維生素C和總黃酮對(duì)自由基的清除率Fig.11 Free radical scavenging rate of vitamin C and total flavonoids

2.3.2 OH自由基清除率 由圖11(b)可知,隨著木耳菜總黃酮質(zhì)量濃度的增加,可以觀察到對(duì)OH自由基的清除率逐漸提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,其IC50值為154.90mg/L。特別是當(dāng)木耳菜總黃酮質(zhì)量濃度為250mg/L時(shí),觀察到對(duì)OH自由基的清除率可達(dá)到75.63%,相當(dāng)于維生素C的86.97%。說明木耳菜總黃酮具備一定的OH自由基清除能力,但相對(duì)于維生素C來說,其清除能力略低。

綜上所述,木耳菜總黃酮具有顯著的抗氧化潛力,為其作為天然綠色抗氧化添加劑的應(yīng)用提供了科學(xué)基礎(chǔ)和可行性。

3 結(jié)論

以木耳菜為原料,通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化了木耳菜總黃酮的超聲波輔助提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,最佳提取參數(shù)是乙醇體積分?jǐn)?shù)為72%、超聲時(shí)間為29min、超聲溫度為63℃以及液料比為42mL/g。根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),木耳菜總黃酮的提取率為54.23mg/g,相對(duì)誤差僅為1.97%,驗(yàn)證了回歸模型的可靠性。此外,木耳菜總黃酮具有一定的自由基清除能力,對(duì)DPPH自由基、OH自由基的IC50值分別為69.61、154.90mg/L,相對(duì)于維生素C來說其清除能力略低。這項(xiàng)研究表明木耳菜總黃酮具有抗氧化潛力,為其作為天然綠色抗氧化添加劑的應(yīng)用提供了科學(xué)基礎(chǔ)和可行性。