楊森，吳上志，黃展航，林育能，陳曉雯，譚錦莉，徐清云，盧成瑜，陳德暉*

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，廣東廣州 510120；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510120

伏立康唑是一種廣譜三唑類抗真菌藥物，用于治療侵襲性曲霉病、足放線病菌屬、鐮刀菌屬等所致嚴(yán)重感染及非中性粒細(xì)胞減少的念珠菌血癥，以及經(jīng)過(guò)其他抗真菌藥物治療后無(wú)效或不能耐受的患者[1]，對(duì)新型隱球菌、念珠菌、病原性酵母菌等有良好的抗菌活性，亦可用于預(yù)防真菌感染[2]。一項(xiàng)納入9 項(xiàng)研究的Meta 分析顯示，伏立康唑治療和預(yù)防兒童深部真菌感染的最佳藥谷濃度為1～3 mg/L[3]，低濃度常致臨床治療效果不佳，高濃度則可產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)。伏立康唑主要由細(xì)胞色素P450(CYP)酶代謝，尤其是CYP2C19。CYP2C19基因在不同個(gè)體中的表型有顯著差異，CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*4和CYP2C19*17常發(fā)生等位基因缺陷。

CYP2C19基因型對(duì)伏立康唑治療和預(yù)防真菌感染效果的影響是目前的研究熱點(diǎn)[4-6]，成人此方面的報(bào)道較多，但兒童CYP2C19基因型與伏立康唑血藥濃度相關(guān)性的研究相對(duì)較少，伏立康唑藥谷濃度在患兒中的差異極大[7]，不僅受CYP2C19基因型和表型的影響，還可能受其他多種因素影響。本研究對(duì)使用伏立康唑患兒所攜帶的CYP2C19基因型、表型和等位基因分布情況進(jìn)行分析，并探討其與血清藥谷濃度的關(guān)系，為臨床達(dá)到最佳伏立康唑藥物濃度提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2013 年9 月－2021 年9 月因肺部侵襲性真菌感染在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科住院的58例患兒進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合英國(guó)抗微生物與化療協(xié)會(huì)發(fā)布的肺部侵襲性真菌感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，并同時(shí)滿足以下條件：(1)病原學(xué)檢查結(jié)果提示應(yīng)使用伏立康唑或用其他抗真菌藥治療無(wú)效，而改用伏立康唑治療或粒細(xì)胞缺乏，無(wú)病原學(xué)結(jié)果而需搶先治療者；(2)使用伏立康唑療程需≥5次；(3)伏立康唑起始劑量為6 mg/(kg.d)，1次/12 h。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>18歲；(2)合并嚴(yán)重的肝腎功能不全需要調(diào)整伏立康唑劑量者；(3)拒絕使用伏立康唑或?qū)Ψ⒖颠蜻^(guò)敏者。58 例中4 例拒絕行CYP2C19基因檢測(cè)，最終納入54 例進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究獲廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(C202210040443)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 收集患兒年齡、性別、體重、體重指數(shù)(body mass index，BMI)等一般臨床資料，同時(shí)檢測(cè)血常規(guī)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷酰轉(zhuǎn)肽酶(gamma-glutamyl transpeptidase，GGT)、血肌酐(creatinine，Cr)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎癥指標(biāo)水平。

1.2.2 伏立康唑血藥谷濃度的檢測(cè)及分組 伏立康唑開(kāi)始治療≥5次后進(jìn)行血藥谷濃度檢測(cè)，即在下一次給藥前使用乙二胺四乙酸(EDAT)抗凝管抽取靜脈血3 ml，2000 r/min 離心10 min，保留上清液。采用高效液相色譜法-熒光法測(cè)定血清伏立康唑濃度。同時(shí)記錄伏立康唑的起始劑量、給藥方式、血藥谷濃度等情況。伏立康唑有效的血藥谷濃度為0.4～5.0 μg/ml， <0.4 μg/ml 達(dá) 不 到 臨 床 效 果[9]， 而>5.0 μg/ml則可增加藥物的不良反應(yīng)。由于兒童血清伏立康唑濃度超標(biāo)的情況較少見(jiàn)，本研究依據(jù)血藥濃度范圍將患兒分為低濃度組(<0.4 μg/ml，n=40)與正常濃度組(0.4～5.0 μg/ml，n=14)。

1.2.3 伏立康唑耐藥基因檢測(cè) 抽取患兒空腹外周靜脈血2 ml 于EDTA 抗凝管中，反復(fù)顛倒混勻數(shù)次，2 h 內(nèi)送至檢驗(yàn)科檢測(cè)。檢測(cè)伏立康唑的耐藥CYP2C19基因表型，主要有3 種類型：快代謝型(extensive metabolizer，EM，CYP2C19*1/*1)、中代謝型(intermediate metabolizer， IM，CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3)、慢代謝 型(poor metabolizer，PM，CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3、CYP2C19 *2/*3)。檢測(cè)過(guò)程：(1)全血伏立康唑耐藥基因組DNA 的提取。采用上海百傲科技有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。隨后檢測(cè)DNA的濃度和純度，DNA的濃度須達(dá)到10～60 ng/μl，A260/A280比值為1.7～2.0，然后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。如不能立即檢測(cè)，DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20 ℃冰箱，以防DNA 降解。(2)PCR 擴(kuò)增。按照CYP2C19基因檢測(cè)試劑盒準(zhǔn)備好擴(kuò)增液，在各擴(kuò)增管中加入1 μl PCR 擴(kuò)增酶液和5 μl 提取的樣品DNA溶液，振蕩混勻，12 000 r/min離心15 min。將各管放入PCR 儀中，擴(kuò)增條件如下：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s、48 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。取出擴(kuò)增產(chǎn)物，2～8 ℃保存。

1.2.4 雜交顯色和結(jié)果判讀 取出顯色雜交試劑盒，按照使用說(shuō)明書(shū)將完成雜交的芯片置入BE-2.0 生物芯片識(shí)讀儀的掃描窗口，啟動(dòng)配套的芯片分析系統(tǒng)，掃描芯片并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。不同基因型對(duì)應(yīng)不同的顯色模式，根據(jù)軟件讀取的顯色模式，判斷各個(gè)患兒的基因型。基因型和表型對(duì)應(yīng)的基因模式圖見(jiàn)圖1。

圖1 不同基因型及表型的芯片顯色模式Fig.1 Chip color rendering mode of different genotypes and phenotypes

1.2.5 指標(biāo)分析 分析CYP2C19基因型及等位基因在肺部侵襲性真菌感染患兒中的分布情況，比較不同基因型及等位基因?qū)Ψ⒖颠蜓帩舛鹊挠绊懀槐容^低濃度組與正常濃度組患兒年齡、肝腎功能(GGT、ALT、Cr)、炎癥指標(biāo)(CRP、IL-6)的差異，并進(jìn)一步分析伏立康唑血藥濃度的影響因素。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilktest法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布者以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布者以M(Q1，Q3)表示，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例或%表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，不同藥谷濃度下基因型和等位基因的差異采用Bonferroni 校正分析；采用二元logistics 回歸分析年齡、BMI、CRP、IL-6、ALT、Cr對(duì)患兒伏立康唑血藥谷濃度的影響。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患兒的基本特征 58例患兒病因包括社區(qū)獲得性肺炎并急性肺部真菌感染42例(有肺部基礎(chǔ)疾病26例)，原發(fā)免疫缺陷病6例，化療相關(guān)粒細(xì)胞缺乏所致感染10 例。4 例存在肺部基礎(chǔ)疾病患兒拒絕行CYP2C19基因檢測(cè)，其余54 例納入本研究。其中，男35 例(64.8%)，女19 例(35.2%)，年 齡2.7(1.2，6.5)歲，BMI 15.3(13.5，16.5) kg/m2；其中伏立康唑口服10例(18.5%)，靜脈輸注44 例(81.5%)。兩組患兒的肝腎功能基線特征無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；炎癥指標(biāo)和伏立康唑血藥谷濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患兒炎癥指標(biāo)及藥谷濃度比較[M(Q1, Q3)]Tab.1 Inflammatory indicators and drug minimum concentration of included children with invasive fungal infections in lungs[M(Q1, Q3)]

2.2CYP2C19基因型、表型分布及在不同血清藥谷濃度患兒中的分布 完成檢測(cè)的54例樣本中共檢出4種CYP2C19基因型，其中*1/*1(636 GG，681 GG)基因型患兒最多(30 例)；其余患兒基因型依次為*1/*2(636 GG，681 GA，20 例)、*1/*3(636 GA，681 GG，2 例)和*2/*3(636 GA，681 GA，2 例)，未檢出*2/*2(636 GG，681 AA)基因型和*3/*3(636 AA，681 GG)基因型患兒。54例中，30例CYP2C19*1/*1型為快代謝型，22 例CYP2C19*1/*2 和CYP2C19*1/*3 型為中代謝型，2 例CYP2C19*2/*3 為慢代謝型。CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*3 基 因型對(duì)患兒伏立康唑血藥濃度的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(趨勢(shì)χ2=7.008，P=0.045)；以CYP2C19*1/*1為參考值，采用Bonferroni 校正法進(jìn)一步行兩兩比較顯示，與CYP2C19*1/*1 比較，CYP2C19*2/*3 對(duì)血藥濃度的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。正常濃度組與低濃度組在快代謝和慢代謝基因型間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 CYP2C19基因多態(tài)性在不同藥物濃度患兒中的分布Tab.2 Distribution of CYP2C19 gene polymorphism in different drug concentrations

2.3CYP2C19等位基因頻率及等位基因在不同藥物濃度患兒中的分布 54 例患兒中，等位基因CYP2C19*1 出現(xiàn)的頻數(shù)為82，頻率最高，為75.9%；等位基因CYP2C19*2 出現(xiàn)的頻數(shù)為22，頻率為20.4%；等位基因CYP2C19*3 出現(xiàn)的頻數(shù)為4，頻率為3.7%。CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3 等位基因型對(duì)患兒伏立康唑血藥濃度的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(趨勢(shì)χ2=6.782，P=0.026)；以CYP2C19*1 為參考值，采用Bonferroni 校正法進(jìn)一步行兩兩比較顯示，與CYP2C19*1比較，CYP2C19*2對(duì)血藥濃度的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。CYP2C19*1、CYP2C19*2 等位基因在正常濃度組與低濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 CYP2C19等位基因在不同藥物濃度患兒中的分布Tab.3 Distribution of CYP2C19 allele in different drug concentrations

2.4 影響伏立康唑藥谷濃度的相關(guān)因素分析 二元logistics回歸分析結(jié)果顯示，BMI、CRP、IL-6和基因型對(duì)伏立康唑藥谷濃度有明顯影響(P<0.05)，其中BMI、CRP可升高伏立康唑血藥濃度，而IL-6和基因型可降低伏立康唑血藥濃度。患兒年齡、ALT 及Cr對(duì)伏立康唑血藥谷濃度無(wú)明顯影響(P>0.05)(表4)。

表4 影響伏立康唑血藥谷濃度的相關(guān)因素分析Tab.4 Analysis of the related factors affecting the blood minimum concentration of voriconazole

3 討 論

伏立康唑主要通過(guò)肝臟細(xì)胞色素P450 酶CYP2C19 代謝[10]，也可經(jīng)CYP3A代謝[11]，還有少部分經(jīng)CYP2C9 代謝[12]。不同基因型對(duì)伏立康唑藥代動(dòng)力學(xué)的影響十分明顯。CYP2C19基因型及表型常見(jiàn)的有以下幾種：CYP2C19*1/*17 為超快代謝型(UM)，CYP2C19*1/*1為快代謝型(EM)，CYP2C19*1/*2和CYP2C19*1/*3 為 中 代 謝 型(IM)，CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3 為 慢 代 謝 型(PM)[13]。然而根據(jù)CYP2C19基因型和催化能力可分為UM、EM、IM和PM四種代謝型，其中EM為CYP2C19*1/*1野生純合子，UM為CYP2C19*17基因突變，IM包括CYP2C19*1/*2 和CYP2C19*1/*3 雜合子兩種基因型，PM 基 因 型 則 包 括CYP2C19*2/*3、CYP2C19*2/*2 和CYP2C19*3/*3。當(dāng)CYP2C19為PM[10](即純合突變，*2/*2、*2/*3、*3/*3)時(shí)，伏立康唑代謝極慢[5]，其暴露濃度為EM(即野生型，*1/*1)的3～4 倍[14]；當(dāng)CYP2C19為IM(即雜合突變，*1/*2、*1/*3)時(shí)，伏立康唑代謝減慢，其暴露濃度為EM 的1.5～2 倍[15]，可能導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯增高[14]。相反，當(dāng)CYP2C19為UM時(shí)(*1/*17或*17/*17)，伏立康唑的暴露濃度相比正常代謝降低約50%[16]，因此，使用標(biāo)準(zhǔn)劑量治療時(shí)，暴露濃度低是治療失敗的一個(gè)重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，患兒中以EM 和IM 居多，共占96.3%，與亞洲地區(qū)成年人CYP2C19弱代謝者發(fā)生率不一致[17]，可能與本研究所納入病例種類不同或樣本量較小有關(guān)。

CYP2C19具有遺傳多態(tài)性，是引起個(gè)體和種族間對(duì)同一藥物表現(xiàn)出不同代謝能力的原因之一[18]。CYP2C19基因突變導(dǎo)致編碼的酶活性改變，產(chǎn)生不同的表型。CYP2C19*1/*1 型無(wú)突變位點(diǎn)，酶活性正常，表型為EM；CYP2C19*1/*2和CYP2C19*1/*3型為雜合突變，突變位點(diǎn)分別為681G>A 和636G>A，酶活性為中間型， 表型為IM；CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3型為純合突變，突變位點(diǎn)為681G>A和636G>A，酶活性弱，表型為PM。白種人和黑種人中CYP2C19弱代謝者發(fā)生率為3%～5%，而亞洲人中弱代謝者發(fā)生率則高達(dá)15%～20%[19]。對(duì)健康白種人和健康日本人的研究結(jié)果顯示，同一種族中弱代謝者伏立康唑的血藥濃度較強(qiáng)代謝者高4 倍以上[19-20]。一項(xiàng)來(lái)自加沙地帶健康兒童的CYP2C19基因型流行病學(xué)調(diào)查表明，CYP2C19的*1/*1、*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3 基因型占比分別為86.5%、6.5%、3.0%、1.5%、2.0%、0.5%[21]。本研究中CYP2C19*1/*1、*1/*2 基因型是常見(jiàn)的類型，以快代謝和中代謝表型居多，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。既往研究發(fā)現(xiàn)，亞洲人群中UM 代謝類型占比僅約4%[16,22]，而PM 占比為12%～23%，檢測(cè)CYP2C19*2和CYP2C19*3兩個(gè)位點(diǎn)即可覆蓋99%以上的突變類型[20]。 本 研 究 發(fā) 現(xiàn)， 等 位 基 因CYP2C19*1和CYP2C19*2占比為97%，與文獻(xiàn)報(bào)道不一致，可能存在地域或人種的差異。

本研究對(duì)影響伏立康唑血藥谷濃度的相關(guān)因素(年齡、BMI、CRP、基因型、肝腎功能)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CRP 和基因型對(duì)藥谷濃度有明顯影響(P<0.05)。CRP較高時(shí)，藥谷濃度也較高，考慮可能的原因?yàn)椋篊RP 是反映炎性嚴(yán)重程度、炎癥急性時(shí)相的非特異性指標(biāo)，主要受IL-6 的調(diào)控，而IL-6 和一些上游促炎因子均可下調(diào)CYP2C19和CYP3A4基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致藥谷濃度升高[23]；CRP 和IL-6 同為炎性因子，CRP 主要在肝臟產(chǎn)生，而IL-6 主要由粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生且為CRP 的上游促炎因子，這可能是IL-6 和CRP 對(duì)血藥濃度的影響不一致的原因，與文獻(xiàn)研究結(jié)果相似[24]。本研究還發(fā)現(xiàn)，PM的藥谷濃度明顯高于EM(P<0.05)，且PM 患兒的CRP較高時(shí)具有更高的藥谷濃度，提示PM與EM患兒使用相同劑量藥物時(shí)可導(dǎo)致藥谷濃度上升，因此，應(yīng)降低患兒的起始用藥劑量，密切關(guān)注不良反應(yīng)的發(fā)生[6,25-26]。此外，建議所有使用伏立康唑治療的患兒應(yīng)盡早進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，以便更早地達(dá)到有效的藥谷濃度，及時(shí)調(diào)整藥物劑量，減少藥物不良反應(yīng)，并提高治療效果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，伏立康唑用于兒童肺部侵襲性真菌感染的治療效果與CYP2C19基因多態(tài)性密切相關(guān)，CYP2C19基因型決定了代謝表型，影響了伏立康唑的血藥谷濃度，進(jìn)而影響了臨床效果，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[4,27-28]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，BMI、CRP、IL-6也同樣可影響藥谷濃度，提示在使用伏立康唑治療侵襲性真菌感染患兒時(shí)，除基因外還應(yīng)關(guān)注其他指標(biāo)，以提高用藥安全性。本研究仍存在一些不足之處：(1)研究對(duì)象僅限于侵襲性真菌感染的兒童患者，未納入成人進(jìn)行對(duì)比分析；(2)為只針對(duì)中國(guó)人種的小部分研究；(3)是一項(xiàng)回顧性研究，不能證明因果關(guān)系，只能說(shuō)明相關(guān)性和影響因素。未來(lái)有待設(shè)計(jì)高質(zhì)量的隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證本研究結(jié)果的可靠性?？傊?，盡早完成侵襲性真菌感染患兒的CYP2C19基因型檢測(cè)并關(guān)注炎性因子的變化，可合理指導(dǎo)患兒首次給藥的劑量，盡快達(dá)到有效的藥谷濃度，為伏立康唑合理、安全、有效地運(yùn)用于此類患兒的治療提供臨床依據(jù)。