五味子是木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實,習稱“北五味子”,而南五味子為木蘭科植物華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實。五味子和南五味子均具有益氣生津、補腎寧心、收斂固澀的作用,臨床應用廣泛。《中國方劑數(shù)據庫》收載了含五味子的方劑631首[1],同時還可見多種相關的成方制劑和單方制劑上市銷售[2-3]。五味子和南五味子由于在保肝、調節(jié)中樞神經系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等方面治療效果顯著,臨床上經常與其他藥物聯(lián)合使用。前人研究已發(fā)現(xiàn)五味子和南五味子在聯(lián)合用藥時,容易發(fā)生藥效、代謝方面的相互作用[4-7]。吳靜靜等[8]借助網絡藥理學的研究方法,建立了疾病-基因和中藥活性成分-蛋白質靶標的相互作用網絡,由此闡明了五味子配伍枸杞子治療兒童注意缺陷多動障礙癥的藥效作用機制。

細胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)的誘導或抑制作用是導致藥物代謝的相互作用的主要因素(約占70%)[9-11]。CYP3A(cytochrome P450 3A)占CYP450總含量的50%以上,參與50%～70%的藥物代謝[12]。藥物代謝學研究發(fā)現(xiàn),五味子提取物及其所含的單一木脂素成分均對CYP3A酶的活性呈現(xiàn)了不同程度的誘導作用或抑制作用,如Brandin等[13]發(fā)現(xiàn)五味子醇提取物具有誘導CYP3A4酶活性的作用;陳倩等[14]的實驗結果表明五味子對CYP3A 酶活性呈現(xiàn)抑制和誘導雙重作用;Iwata等[15]發(fā)現(xiàn)五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、戈米辛B、戈米辛C、戈米辛G、戈米辛N等單一木脂素成分對cytochrome P450 3A4(CYP3A4)具有不同程度的抑制作用;李維亮等[16]研究發(fā)現(xiàn)五味子乙素在體外可抑制CYP3A活性。但迄今為止,尚未有人比較研究五味子和南五味子提取物對CYP450酶活性的影響作用。

體外肝微粒體結合探針藥物的方法是評價藥物影響CYP450酶代謝的經典方法之一[17]。該法通常是在肝微粒體中加入CYP450探針藥物(如睪酮或咪達唑侖)進行溫孵,然后檢測探針藥物的代謝物的生成量,由此評估CYP450酶活性的影響程度[18-20]。為此,在本實驗中,采用人肝微粒體體外溫孵法,通過高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術(liquid chromatography tandem-mass spectrometry,HPLC-MS/MS)檢測CYP3A4探針藥物睪酮的代謝物6β-羥基睪酮含量,考察南、北五味子提取物、主要木脂素成分對CYP3A4酶活性的影響,以預測其聯(lián)合用藥時可能發(fā)生的藥物代謝方面的相互作用,為五味子和南五味子在臨床上安全、合理用藥提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290-AB QTRAP4500三重四級桿-線性離子阱液質聯(lián)用儀(含自動進樣器、在線脫氣機、柱溫箱、二元泵、ESI離子源、三重四極桿-離子肼質譜分析器和檢測器),美國Agilent 公司;QYC-200型恒溫搖床,中國上海?，攲嶒炘O備有限公司;MS3型渦旋混合器,德國IKA公司;SIGMA3-18K型高速低溫離心機,德國Sigma公司。

1.2 藥材

南五味子(SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.)和五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.)購于北京市同仁堂科技有限公司,經中國中醫(yī)科學院中藥研究所李化研究員鑒定。南五味子和五味子醇提物浸膏和水提物浸膏由本課題組自制(浸膏得率依次為34%、38%、20%和23%)。

1.3 試劑

睪酮、6β-羥基睪酮均購自上海甄準生物科技有限公司,貨號分別為ZC-55873、IR-12693;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉(reduced coenzyme Ⅱ tetrasodium salt,NADP-Na2)購自北京索萊寶科技有限公司,貨號為718B0225;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADPH)再生系統(tǒng)(-80℃冷凍保存)購自武漢普來特生物醫(yī)藥技術有限公司,A液貨號為NRS001、B液貨號為NRS002;五味子醇甲(純度>98%)、五味子酯甲(純度>98%)、五味子甲素(純度>98%)、五味子乙素(純度>98%)對照品,均購自成都曼斯特生物科技有限公司,貨號分別為Must-13061206、Must-13110606、Must-13080205、Must-13091606;色譜級甲醇和色譜級乙腈購自美國Fisher公司,貨號分別為206403和204681;超純水由Milli-Q型超純水制備儀(法國Millipore公司)制備。

1.4 細胞

混合人源性肝微粒體(THP)購自上海瑞德肝臟疾病研究所,于-80 ℃冷凍保存。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 6β-羥基睪酮貯備液及其系列梯度稀釋溶液的配制 取6β-羥基睪酮對照品適量,精密稱定,用甲醇定容至10 mL棕色量瓶中,搖勻,得到質量濃度為1.0 mg/mL的6β-羥基睪酮貯備液。于4 ℃冰箱中密封保存,備用。臨用前,用甲醇逐級稀釋至相應質量濃度,得到6β-羥基睪酮系列梯度稀釋標準溶液。

2.1.2 內標貯備溶液及內標稀釋溶液的配制 取對乙酰氨基酚對照品適量,精密稱定,用甲醇定容至10 mL棕色量瓶中,搖勻,得到質量濃度為0.96 mg/mL內標貯備溶液。于4 ℃冰箱中密封保存,備用。臨用前,用甲醇稀釋至質量濃度為50 μg/L的內標稀釋溶液。

2.1.3 NADPH-Na4溶液的配制 取NADPH-Na4適量,精密稱定,用磷酸緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)溶解,制得質量濃度為2 mmol/L的NADPH-Na4溶液。臨用前配制。

2.1.4 提取物溶液的配制 取五味子和南五味子水提物浸膏和醇提物浸膏適量,精密稱定,分別置4個10 mL量瓶中,其中水提物干膏用超純水溶解并定容,醇提物干膏用少量二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解,然后加超純水定容至刻度,DMSO含量不得超過1%,配制得到相應濃度的提取物溶液。將上述每種提取物溶液分別稀釋成7.5、15、30 mg/mL的溶液,于4 ℃冰箱中密封保存,備用。

2.1.5 五味子木脂素單體成分溶液的配制 取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素適量,精密稱定,分別置4個10 mL量瓶中,加少量甲醇溶解,然后加超純水定容至刻度,依次得到質量濃度為0.208、0.373、0.217、0.258 mg/mL的五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素對照品溶液。并將上述每種對照溶液分別稀釋成25、50、100 μmoL/L的溶液,于4 ℃冰箱中密封保存,備用。

2.2 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(2.1×100 mm,3.5 μm);流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫,0～1.5 min,10%～40%B,1.5～3.5 min,40%～75%B,3.5～4 min,75%～75%B,4～6 min,75%～10%B,流速0.4 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量2 μL。

2.3 質譜條件

離子源采用電噴霧離子源,離子化電壓5.5 kV;離子源溫度為550 ℃;氣簾氣為241 kPa;噴霧氣為350 kPa;輔助加熱氣為310 kPa,以多反應監(jiān)測模式進行正離子掃描,用于定量分析的監(jiān)控離子為m/z152.00～109.70(對乙酰氨基酚,內標),m/z305.20～269.00(6β-羥基睪酮)。采用上述條件檢測6β-羥基睪酮的含量。

2.4 樣品孵育

參考文獻[18]建立孵育體系。孵育體系總體積為100 μL,包含1 mg/mL的人肝微粒體、2 mmol/L的NADPH、10 μmol/L的睪酮溶液、待測樣品10 μL、PBS緩沖液,加入順序為人肝微粒體、PBS緩沖液、睪酮溶液和待測樣品(提取物溶液/木脂素溶液),體系中有機相含量應小于1%。待加入緩沖液、睪酮、人肝微粒體后,于37 ℃預孵5 min,再加入NADPH-Na4啟動反應,37 ℃恒溫震蕩(150 r/min)5 min后,立即向體系中加入100 μL含50 μg/L的對乙酰氨基酚冰乙腈終止反應。

樣品的處理:取上述溫孵后的反應體系渦旋混勻1 min后,置于-20 ℃冰箱5 min,再離心10 min(16 000×g,4 ℃),取上清液,按上述檢測條件進行LC-MS/MS分析。

3 結果

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性考察 分別取空白人肝微粒體加入6β-羥基睪酮標準液和對乙酰氨基酚內標液溫孵后,按2.4項下操作后,進樣,得到相應的色譜圖,見圖1。結果顯示,內標(對乙酰氨基酚)和6β-羥基睪酮的保留時間分別為1.50 min和2.61 min,各峰達到基線分離,空白人肝微粒體中無內源性雜質的干擾,方法專屬性良好。

3.1.2 標準曲線的制備 在空白溫孵液中分別加入系列6β-羥基睪酮稀釋標準溶液(15、30、60、120、240、480、960.0 μg/L)和內標溶液,按照2.4項下方法進行處理,取上清液進樣檢測,記錄6β-羥基睪酮峰和內標峰的峰面積,以二者的峰面積比為縱坐標(Y),相應的6β-羥基睪酮質量濃度為橫坐標(X),進行加權線性回歸(權重=1/X2),得到標準曲線方程為Y= 0.311 1X+ 2.616 5,r= 0.999 9結果表明6β-羥基睪酮在15.0～960 μg/L線性關系良好。

3.1.3 日內和日間精密度試驗 在空白溫孵液中加入低、中、高3個濃度(15.0、240、960.0 μg/L)的6β-羥基睪酮,每個濃度各5份,連續(xù)測定3天,計算6β-羥基睪酮峰和內標峰的峰面積比值、日內和日間精密度以及其相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。結果低、中、高濃度日內精密度RSD%分別為8.5%、4.5%、5.8%;日間精密度RSD%分別為10.3%、5.6%、4.8%;日內和日間精密度均小于11%,見表1,表明日內和日間精密度良好。

表1 人肝微粒體中6β-羥基睪酮的精密度和提取回收率實驗結果(n=5)

3.1.4 提取回收率試驗 在空白溫孵液中加入低、中、高3個濃度(15.0、240.0、960.0 μg/L)的6β-羥基睪酮,每個濃度各5份,進樣記錄峰面積,計算6β-羥基睪酮峰和內標峰的峰面積比值、提取回收率以及其RSD。結果顯示低、中、高提取回收率分別為102.1%±5.4%,105.2%±4.9%,105.7%±4.1%,RSD均小于11%,見表1,表明回收率良好。方法學驗證的結果表明,該方法特異性、精密度和準確度等均符合本實驗的要求。

3.2 五味子和南五味子提取物對人CYP3A4酶活性影響

按照“2.4”項下方法向孵育體系中分別加入低、中、高濃度(7.5、15、30 g/L)五味子和南五味子水提取物溶液、五味子和南五味子醇提取物溶液與睪酮溶液共同孵育,并設置不加五味子提取物的空白對照組,各濃度樣品平行操作3次,采用LC-MS/MS檢測相應代謝產物6β-羥基睪酮的生成量。以6β-羥基睪酮的生成速率作為酶活性指標,用V(mmol/min/mg)表示,其中,C為各樣品組中6β-羥基睪酮生成量(mmoL/L),Cpro為微粒體蛋白質量濃度(mg/mL),t為孵育時間(min),計算公式為V=1 000×0.2×C/(t×Cpro)。

各樣品組酶活性的測定結果如表2所示。五味子和南五味子醇提物和水提物在高中低三個濃度條件下,對CYP3A4酶活性均有抑制作用,呈濃度依賴性,且南、北五味子醇提物較水提物抑制程度更明顯。五味子水提物和醇提物抑制人CYP3A4酶活性的能力強于南五味子水提物和醇提物。

表2 五味子和南五味子醇提物和水提物對人CYP3A4酶活性的影響

3.3 五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素對人CYP3A4酶活性的影響

按照2.4項下方法向孵育體系中分別加入低、中、高濃度(25、50、100 μmoL/L)五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素對照品溶液與睪酮溶液共同孵育,并設置不加上述活性成分的對照組,各濃度樣品平行操作3次,采用LC-MS/MS檢測相應代謝產物6β-羥基睪酮的生成量。以6β-羥基睪酮的生成速率作為酶活性指標,用V(mmol/min/mg)表示,其中,C為各樣品組中6β-羥基睪酮生成量(mmoL/L),Cpro為微粒體蛋白質量濃度(mg/mL),t為孵育時間(min),計算公式為V=1 000×0.2×C/(t×Cpro)。

各樣品組酶活性的測定結果見表3。在人肝微粒體實驗中,在五味子醇甲、五味子酯甲,五味子甲素,五味子素等單一木脂素成分的高、中、低三個濃度條件下,上述木脂素成分對CYP3A4酶活性都有不同程度的抑制效果,隨濃度的增加抑制作用愈明顯。其抑制能力由高到低依次為五味子酯甲,五味子乙素,五味子甲素和五味子醇甲。這與Iwata 等[15]的研究結果一致,五味子木脂素成分中以五味子酯甲的抑制作用最強。

表3 五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素對人CYP3A4酶活性的影響

4 討論

本文建立了人肝微粒體溫孵液中睪酮代謝物6β-羥基睪酮的HPLC-MS/MS分析方法,方法學考察的數(shù)據表明該方法簡單、靈敏、準確,適用于開展6β-羥基睪酮的定量研究。研究結果為五味子和南五味子提取物在人肝微粒體中代謝特征及藥物相互作用奠定了一定的實驗基礎。

本實驗比較研究了五味子和南五味子提取物對藥物代謝酶活性的影響,發(fā)現(xiàn)二者的醇提物和水提物均能對人CYP3A4酶活性產生抑制作用;二者的醇提物的抑制作用強于二者的水提物;五味子的醇提物和水提物的抑制作用強于南五味子。究其原因,這可能與提取物中木脂素成分含量差異密切相關。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)五味子中總木脂素、五味子醇甲和五味子乙素的含量高于南五味子,五味子酯甲和五味子甲素的含量低于南五味子[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)上述木脂素成分對人CYP3A4酶活性抑制能力也存在差異,抑制能力從高到低依次為五味子酯甲,五味子乙素,五味子甲素和五味子醇甲。課題組后續(xù)還將開展體內代謝研究,并觀察這些木脂素成分對CYP3A4酶蛋白或基因表達的影響,為進一步闡明五味子和南五味子在臨床上混用是否會產生臨床治療風險提供科學依據。

鑒于五味子和南五味子及其制成的制劑中木脂素成分含量的差異性,以及它們對人CYP3A4酶產生的不同程度的抑制作用,提示五味子和南五味子在臨床上混用,可能產生不良反應,同時也會因劑量使用不當,導致不良反應的發(fā)生?，F(xiàn)版《中華人民共和國藥典》規(guī)定南、北五味子每日臨床用量均為2～6 g,但臨床上有的方劑在治療心臟疾病時重用五味子,用量已高達100 g[23]。如果臨床需要大量服用五味子時,尤其需要注意處方中南五味子和五味子的區(qū)分,并加強對患者的木脂素類成分的血藥濃度監(jiān)測,避免與其他藥物聯(lián)合使用時產生的藥物代謝性相互作用,從而確保其臨床用藥的安全性和有效性。