劉文慧,徐 爍,潘 瑩,顧 焱,孫紅娟,鄒文軍

（江南大學(xué)附屬中心醫(yī)院/無(wú)錫市第二人民醫(yī)院眼科，江蘇 無(wú)錫 214000）

化學(xué)損傷及物理?yè)p傷均會(huì)破壞眼表的正常生理結(jié)構(gòu)，對(duì)眼睛造成損傷，有時(shí)甚至波及眼球，同時(shí)會(huì)損傷角膜緣干細(xì)胞，導(dǎo)致其數(shù)量嚴(yán)重下降，引起角膜緣干細(xì)胞缺乏（limbal stem cells deficiency，LSCD），最終導(dǎo)致角膜上皮脫落，引發(fā)角膜基質(zhì)潰瘍、上皮血管新生、瞼球粘連及角膜血管翳等一系列并發(fā)癥，不但影響美觀，而且極其損傷視力[1-3]。有研究表明，眼熱燒傷或化學(xué)損傷可傷及角膜緣干細(xì)胞，占眼外傷的7.7%～18.0%，且患者呈年輕化發(fā)展，可造成不同程度的角膜穿孔及復(fù)發(fā)性角膜潰瘍[3-4]。臨床治療LSCD 的方法包括藥物和手術(shù)治療。藥物治療只能改善角膜緣基底層殘存角膜緣干細(xì)胞的生存環(huán)境，并不能使已經(jīng)凋亡的角膜緣干細(xì)胞復(fù)活或增殖，因此單一藥物治療并不能治愈LSCD[3-6]。目前認(rèn)為手術(shù)是治療LSCD 最為有效的方法，手術(shù)治療主要通過(guò)移植對(duì)眼表進(jìn)行重建，移植物包括羊膜、自體角膜緣干細(xì)胞、自體結(jié)膜、異體角膜緣干細(xì)胞以及體外培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞等[3,7]。研究表明，通過(guò)合適的移植物進(jìn)行眼表重建能有效改善眼瞼結(jié)構(gòu)，提高淚膜穩(wěn)定性，減輕LSCD 引起的炎癥反應(yīng)，對(duì)于矯正燒傷引發(fā)的瞼內(nèi)翻，改善術(shù)后美觀，恢復(fù)眼表功能意義重大[8-9]。本研究首次采用羊膜移植聯(lián)合瞼內(nèi)翻矯正術(shù)治療化學(xué)或熱燒傷致眼表?yè)p傷及下眼瞼內(nèi)翻，觀察患者術(shù)后恢復(fù)情況，以期為眼表燒傷患者的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016 年6 月至2021 年12 月于我院接受診治的80 例眼部燒傷患者為研究對(duì)象。其中男53 例，女27 例，年齡（46.37±17.12）歲。所有患者均接受羊膜移植聯(lián)合瞼內(nèi)翻矯正術(shù)治療。納入標(biāo)準(zhǔn)[10]：①損傷眼部殘留部分健康角膜緣；②損傷致下眼瞼內(nèi)翻；③臨床資料完整；④年齡18～65歲。排除標(biāo)準(zhǔn)[10]：①燒傷前患有其他眼部疾病；②全角膜緣損害；③角膜基質(zhì)潰瘍；④合并其他疾病，不適合進(jìn)行手術(shù)治療。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[2022倫理審查第（Y-171）號(hào)]。

1.2 手術(shù)方法

羊膜移植術(shù)[10]：術(shù)中于球結(jié)膜下注射2%利多卡因進(jìn)行浸潤(rùn)麻醉。所有操作均在顯微鏡下進(jìn)行，使用開(kāi)瞼器開(kāi)瞼，刮除干凈角膜表面的壞死組織，沿角膜緣剪開(kāi)球結(jié)膜，清除壞死組織，盡量保留角鞏緣組織。對(duì)存在瞼球粘連者，松解瞼球粘連。取適當(dāng)大小已于林格氏液中復(fù)水1 h 的羊膜，上皮面朝上平鋪于角結(jié)膜創(chuàng)面，10-0 縫合線縫合固定于角鞏膜表面。術(shù)中確保羊膜植片平整，植片下無(wú)積血、積液，黏附緊密。暴露角膜緣，將羊膜平鋪于患側(cè)，確?；紓?cè)角膜緣與羊膜的角膜緣側(cè)貼合、無(wú)縫隙，并將外側(cè)緣固定縫合于近穹隆處?kù)柲\層，結(jié)膜部分覆蓋于羊膜表面，與患側(cè)周圍球結(jié)膜縫合。

瞼內(nèi)翻矯正術(shù)[11]：浸潤(rùn)麻醉后，作瞼緣牽引縫線，翻轉(zhuǎn)眼瞼，充分暴露瞼結(jié)膜面，在平行于瞼緣的瞼板溝處切斷瞼板，切口長(zhǎng)度一般超出瘢痕區(qū)兩端1～2 mm，同時(shí)切除壞死的瞼板組織以及增生的肉芽，充分暴露缺損區(qū)。將異體鞏膜經(jīng)乙醇浸泡復(fù)水后，根據(jù)瞼板缺損區(qū)的大小制作異體鞏膜條，并將鞏膜條內(nèi)面朝向眼瞼皮膚面平貼在瞼板缺損區(qū)，最后將異體鞏膜條與瞼緣以及周圍瞼結(jié)膜面以8-0 可吸收尼龍線連續(xù)縫合固定。

1.3 觀察指標(biāo)

所有患者于術(shù)前、術(shù)后8 周分別進(jìn)行裂隙燈顯微鏡檢查并拍照。采用視力表分別測(cè)定患者術(shù)前、術(shù)后8 周視力，根據(jù)視力情況將患者分為視力0.3～0.5，視力0.1～＜0.3 和視力＜0.1。比較患者術(shù)前、術(shù)后8 周的淚膜破裂時(shí)間，將熒光素鈉滴在眼瞼里后閉眼，然后睜開(kāi)眼睛在裂隙燈下用鈷藍(lán)光迅速觀察，出現(xiàn)第一個(gè)破裂斑時(shí)即為淚膜破裂時(shí)間。分別抽取患者術(shù)前、術(shù)后8周的外周血，于4 ℃下以3 000 r/min 離心5 min，收集上清液備用。采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）、胰島素生長(zhǎng)因子1（insulin growth factor 1，IGF-1）水平。

1.4 PAS染色及免疫熒光染色

眼表脫落上皮細(xì)胞收集[3]：在患者結(jié)膜囊內(nèi)滴鹽酸奧布卡因滴眼液1～2 滴，擦拭干凈淚液。夾取醋酸纖維膜，并將其粗糙面接觸角膜、角膜緣，同時(shí)采集部分患者的結(jié)膜脫落上皮細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。需要注意的是在收集角膜緣脫落上皮細(xì)胞時(shí)，標(biāo)記端纖維膜片應(yīng)與結(jié)膜側(cè)貼合。醋酸纖維膜粗糙面與角膜接觸15 s后將標(biāo)本置于95%乙醇中固定處理5～10 min。

PAS 染色[3]：將標(biāo)本從95%乙醇中取出，用蒸餾水洗3 次，滴加1 滴高碘酸染色5 min，蒸餾水沖洗1 次，滴加1 滴Schiff 氏液染色10 min，棄去Schiff 氏液，滴加1 滴偏重亞硫酸鈉30 s 后用流水沖洗1 min，然后滴加蘇木素染核10 s，蒸餾水洗1次，用95%乙醇脫水10 s，最后將脫水后的標(biāo)本置于載玻片上，室溫下干燥，封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察記錄并拍照。

免疫熒光染色：從95%乙醇中取出標(biāo)本后用蒸餾水沖洗3 次，山羊血清室溫封閉1 h 后，與兔抗人細(xì)胞角蛋白12（cytokeratin 12, CK12）抗體（英國(guó)Abcam 公司）于4 ℃孵育16 h，加FITC 標(biāo)記的兔抗大鼠IgG 二抗（英國(guó)Abcam 公司），在室溫下濕盒中孵育1 h；滴加DAPI 孵育5 min，注意避光，PBST 洗3 次，每次3 min；加入抗熒光淬滅劑，于倒置熒光顯微鏡下拍照記錄。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料符合正態(tài)分布則采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布則選擇非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者手術(shù)前后眼表恢復(fù)情況

患者術(shù)前瞼球粘連及下眼瞼內(nèi)翻，術(shù)后8 周眼表恢復(fù)良好，羊膜移植在角膜表面后均存活、穩(wěn)定，下眼瞼內(nèi)翻及倒睫得到顯著改善，見(jiàn)圖1。

圖1 手術(shù)前后患者眼表恢復(fù)情況（箭頭指下眼瞼內(nèi)翻及倒睫）

2.2 患者手術(shù)前后視力及淚膜破裂時(shí)間

與術(shù)前比較，術(shù)后8周患者視力顯著提高（P＜0.05），淚膜破裂時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 患者手術(shù)前后視力及淚膜破裂時(shí)間（±s）

表1 患者手術(shù)前后視力及淚膜破裂時(shí)間（±s）

項(xiàng)目術(shù)前術(shù)后8周χ2/t P視力情況[例（%）]0.3～0.5 12（15.00）33（41.25）23.126 0.000 0.1～＜0.3 29（36.25）37（46.25）16.033 0.000＜0.1 39（48.75）10（12.50）28.116 0.000淚膜破裂時(shí)間（s）4.31±1.37 6.46±1.51 4.032 0.008

2.3 患者手術(shù)前后血清VEGF、TGF-β1、IGF-1水平

與術(shù)前比較，術(shù)后8 周患者血清VEGF、TGF-β1、IGF-1水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 患者手術(shù)前后血清VEGF、TGF-β1、IGF-1水平（±s）

表2 患者手術(shù)前后血清VEGF、TGF-β1、IGF-1水平（±s）

項(xiàng)目VEGF(ng/mL)TGF-β1(pg/mL)IGF-1(pg/mL)術(shù)前0.18±0.08 3.35±1.19 20.55±5.27術(shù)后8周0.53±0.06 6.15±1.58 31.39±8.67 t 7.216 7.221 4.983 P 0.001 0.001 0.017

2.4 術(shù)后角膜及角膜緣細(xì)胞情況

PAS 染色結(jié)果顯示，術(shù)后8 周，患者結(jié)膜上皮細(xì)胞中存在較多杯狀細(xì)胞，而角膜上皮和角膜緣上皮細(xì)胞中無(wú)杯狀細(xì)胞，表明角膜上皮和角膜緣上皮形態(tài)正常，沒(méi)有被結(jié)膜上皮化，見(jiàn)圖2。

圖2 角膜上皮細(xì)胞、角膜緣上皮細(xì)胞及結(jié)膜上皮細(xì)胞PAS染色結(jié)果（箭頭指杯狀細(xì)胞）

2.5 術(shù)后角膜及角膜緣上皮細(xì)胞CK12表達(dá)水平

免疫熒光染色結(jié)果顯示，術(shù)后8 周，CK12 在角膜上皮細(xì)胞中高表達(dá)，而在角膜緣上皮細(xì)胞中低表達(dá)，見(jiàn)圖3。

3 討論

中度以上眼部燒傷，常因急性期結(jié)膜嚴(yán)重壞死，角膜緣血管血栓形成，引發(fā)角膜缺氧以及嚴(yán)重的營(yíng)養(yǎng)障礙，使受損角膜上皮無(wú)法再生，此時(shí)藥物治療效果極其有限，而羊膜移植術(shù)是治療該類眼部燒傷的常用方法[12-13]。單純羊膜移植術(shù)能夠改善角膜干細(xì)胞缺乏癥狀，重建患者眼部，但是由于眼部燒傷患者往往伴隨瞼板損傷嚴(yán)重，且很多患者存在瞼緣變形或缺損[14]。從解剖和功能上修復(fù)燒傷后眼表?yè)p傷，恢復(fù)眼瞼、結(jié)膜等組織的生理功能，從而獲得持續(xù)穩(wěn)定的眼表面，對(duì)提高角膜移植的療效十分重要。以往治療方式通常是在羊膜移植術(shù)恢復(fù)角膜干細(xì)胞后，再行眼瞼矯正手術(shù)，該種方式不僅會(huì)增加患者的負(fù)擔(dān)，還會(huì)因?yàn)檠鄄€損傷進(jìn)一步造成角膜炎癥反應(yīng)，不利于羊膜移植術(shù)后恢復(fù)[15]。因此，羊膜移植術(shù)結(jié)合眼表重建術(shù)可能是眼部燒傷的治療方向。

本研究所選取的患者均被診斷為全角膜上皮干細(xì)胞缺乏，均表現(xiàn)為嚴(yán)重的上皮損傷、瞼球粘連、內(nèi)翻，患者不僅要求重建眼瞼和結(jié)膜表面，而且要求重建角膜表面，向角膜供應(yīng)上皮干細(xì)胞。為此，我們用羊膜移植重建角膜表面，可補(bǔ)充眼角膜緣干細(xì)胞數(shù)量，在改善角膜緣屏障功能的同時(shí)，促進(jìn)角膜上皮的增殖和分化，有助于維持角膜上皮的完整性，促進(jìn)角膜緣干細(xì)胞的增殖，為角膜緣干細(xì)胞提供生長(zhǎng)的微環(huán)境[16]。為修復(fù)患者瞼內(nèi)翻損傷，羊膜移植術(shù)結(jié)束后，立即對(duì)患者行瞼內(nèi)翻矯正術(shù)，以矯正瞼內(nèi)翻情況。結(jié)果顯示，與術(shù)前相比，手術(shù)后羊膜在角膜表面存活，且恢復(fù)迅速、穩(wěn)定，患者眼部恢復(fù)良好，瞼內(nèi)翻及視力顯著改善，淚膜破裂時(shí)間顯著延長(zhǎng)，表明羊膜移植聯(lián)合瞼內(nèi)翻矯正術(shù)治療眼部燒傷具有較好的療效。研究發(fā)現(xiàn)，角膜新生血管可影響角膜透明度的恢復(fù)，而角膜內(nèi)的調(diào)節(jié)因子在角膜新生血管形成過(guò)程中具有重要作用，其中VEGF 具有促進(jìn)血管生成和組織纖維化以及增加血管通透性的作用；TGF-β1通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化促進(jìn)血管新生；IGF-1 通過(guò)調(diào)控VEGF 的表達(dá)，參與血管內(nèi)皮增生[16-18]。本研究結(jié)果顯示，羊膜移植聯(lián)合瞼內(nèi)翻矯正術(shù)后，患者血清VEGF、TGF-β1、IGF-1水平均顯著高于術(shù)前，提示術(shù)后患者角膜血管新生加速。有研究表明，結(jié)膜富含杯狀細(xì)胞，而角膜則不含杯狀細(xì)胞[19]。本研究采用PAS染色對(duì)角膜及角膜緣細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果顯示，角膜及角膜緣上皮細(xì)胞不含杯狀細(xì)胞，表明角膜上皮和角膜緣上皮形態(tài)正常，沒(méi)有被結(jié)膜上皮化。CK12主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，在維持組織的完整性和連續(xù)性方面具有十分重要的作用[3,20]。角膜緣上皮細(xì)胞和結(jié)膜上皮細(xì)胞均不表達(dá)CK12，只有正常角膜上皮細(xì)胞可以特異性表達(dá)CK12[3,21]。免疫熒光染色結(jié)果顯示，術(shù)后8 周，CK12 在患者角膜上皮細(xì)胞中高表達(dá)，而在角膜緣上皮細(xì)胞中低表達(dá)，表明角膜上皮細(xì)胞形態(tài)正常，角膜緣近角膜側(cè)的上皮細(xì)胞開(kāi)始分化為角膜上皮細(xì)胞。

羊膜移植聯(lián)合瞼內(nèi)翻矯正術(shù)治療眼部燒傷效果顯著，可促進(jìn)患者眼表恢復(fù)，矯正眼瞼內(nèi)翻，改善術(shù)后視力，實(shí)現(xiàn)角膜干細(xì)胞的自體擴(kuò)增及血管新生，是一種安全有效的治療方法。