李亞楠,李爭,廖明麗△,李菲,李軍山,2

（1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司,河北 石家莊 051430;2.云南神威施普瑞藥業(yè)有限公司,云南 楚雄 675099）

經(jīng)典名方一貫煎出自清代魏之琇所著《續(xù)名醫(yī)類案》，為滋陰疏肝之良方[1]。清朝錢敏捷《醫(yī)方絜度》所載一貫煎由沙參、麥冬、當(dāng)歸、枸杞子、生地黃、川楝子6味藥物組成，以水煎服。該方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，用藥精簡。古醫(yī)籍記載一貫煎功效為滋陰疏肝，主治肝腎陰虛，肝氣郁滯證，臨床上廣泛應(yīng)用于慢性肝病、胃病、干燥綜合征、糖尿病、干眼癥、耳鳴等證屬肝腎陰虛，肝郁氣滯者[2-12]。目前對一貫煎的研究多處于基礎(chǔ)實驗研究和臨床研究。作為湯劑，在現(xiàn)代臨床應(yīng)用過程中存在需臨用新制、久置易發(fā)霉變質(zhì)、攜帶不便、服用量大等缺點。且已上市的中成藥由于歷史和技術(shù)的原因，存在工藝數(shù)據(jù)不充分、不同廠家質(zhì)量差異較大、臨床評價難度大等問題，因此科學(xué)地設(shè)定工藝參數(shù)、保證產(chǎn)品均一穩(wěn)定、符合傳統(tǒng)療效已經(jīng)成為經(jīng)典名方發(fā)展的重要問題。

為此，本研究以組方中生地黃活性成分毛蕊花糖苷為指標(biāo)成分，考察其最優(yōu)提取工藝，為后期工業(yè)化生產(chǎn)提供合理數(shù)據(jù)支持。為保證臨床用藥的質(zhì)量與療效，須對其制備工藝進(jìn)行研究。文獻(xiàn)[13]顯示，在研究水煎煮過程中，水的加入量、提取次數(shù)和提取時間是影響提取效率的重要因素，直接影響有效成分在提取物中的溶解效果。為全面考察該方劑的提取效果，使藥材有效成分最大程度地發(fā)揮臨床療效，本研究基于成熟的含量測定方法，按照L9（34）表進(jìn)行正交試驗。以毛蕊花糖苷含量和干浸膏收率、毛蕊花糖苷含量轉(zhuǎn)移率為考察結(jié)果，綜合分析各影響因素，確定最優(yōu)提取工藝。

1 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）；CPA225D電子分析天平[賽多利斯股份公司（德國）]；KH7200DE型數(shù)控超聲波清洗器；JJJ1000型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DK-98-ⅡA型水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；Agilent

10.0

10.00 ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）色譜柱；毛蕊花糖苷對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號111610-201908）；甲醇、乙腈均為色譜純（天津科密歐試劑有限公司）；水為純化水；其他試劑均為色譜純。中藥飲片均購自于河北藺氏盛泰藥業(yè)有限公司，經(jīng)原河北省藥品檢驗所孫寶惠老師鑒定符合《中國藥典》2020年版一部項下相關(guān)規(guī)定[14]。

2 方法

為使制劑最大程度地保留其標(biāo)準(zhǔn)煎劑屬性，并使處方中各中藥材的有效成分被最大程度的提取，還原其湯劑的臨床療效，經(jīng)查閱相關(guān)資料[15]，處方中的各味藥材的有效成分均溶于水，均可用水作為提取溶媒。生地黃作為一貫煎處方中的君藥，且毛蕊花糖苷作為地黃中的活性成分，其水溶性較好，自2010年起就收錄于藥典中[16]。因此本實驗將毛蕊花糖苷的含量和干膏率、含量轉(zhuǎn)移率作為考察指標(biāo)，結(jié)合正交試驗優(yōu)選提取條件。

2.1 干膏率的測定 取按正交試驗所得的提取液，濃縮成120ml浸膏，移取20ml至已經(jīng)恒重的干燥蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，移至烘箱中，80℃干燥5h，取出，置干燥器中，冷卻30min后精密稱定，再在上述溫度條件下干燥1h，冷卻，稱定重量，至連續(xù)兩次稱定質(zhì)量的差異不超過3mg為止，計算干膏得率。

2.2 含量轉(zhuǎn)移率的計算 將按正交試驗所得的提取液進(jìn)行濃縮，干燥后測定干膏粉中毛蕊花糖苷含量，同時測定生地黃飲片中毛蕊花糖苷的含量。結(jié)合2.1中各正交試驗所得干膏率，計算每組實驗所得干膏粉的含量轉(zhuǎn)移率。

計算公式為：毛蕊花糖苷含量轉(zhuǎn)移率=干膏率×各實驗干膏粉毛蕊花糖苷含量/飲片毛蕊花糖苷含量。

2.3 毛蕊花糖苷含量測定方法學(xué)考察

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 采用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）色譜柱，以乙腈-0.5%冰醋酸溶液（15∶85）為流動相，檢測波長334nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μl，理論板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計算應(yīng)不低于5000，色譜峰之間分離度良好。

2.3.2 對照品溶液的制備 取毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，加乙腈-0.1%冰醋酸（16∶84）混合溶液制成每1ml含20μg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml，稱定重量，加熱回流提取30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。對照品色譜圖見圖1、樣品色譜圖見圖2。

圖2 樣品中毛蕊花糖苷色譜圖

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取毛蕊花糖苷對照品9.96mg，以乙腈-0.1%冰醋酸（16∶84）混合溶液為溶劑定容置5ml量瓶中。按照2.3.1項下色譜條件，精密吸取12μl、16μl、20μl、24μl、32μl、40μl，分別注入高效液相色譜儀測定峰面積，以毛蕊花糖苷的峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）對毛蕊花糖苷的質(zhì)量（X）作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得毛蕊花糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝147429.61X+3505682.96（r=0.9996）。結(jié)果表明，毛蕊花糖苷在23.90-79.68ug之間與峰面積成線性關(guān)系，并且效果良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 分別稱取同一正交試驗所得干膏粉樣品6份，按2.3.3項下供試品處理方法制備供試品溶液，按照2.3.1項下的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果顯示樣品中毛蕊花糖苷含量平均值為4.27%，RSD=1.1，證明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 精密度試驗 將2.3.4中對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，RSD=0.1，說明儀器精密度良好，符合分析要求。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 將同一正交試驗所得干膏粉樣品按2.3.3項下供試品處理方法制備供試品溶液，按照2.3.1項下的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，分別在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h進(jìn)樣，測定樣品峰面積。RSD=0.6，結(jié)果表明樣品中毛蕊花糖苷在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 分別稱取同一正交試驗所得干膏粉樣品6份，各0.5g，分別加入對照品適量，按2.3.3項下方法制備供試品溶液，測定樣品含量，計算平均回收率和RSD。結(jié)果表明樣品平均回收率為100.04%，RSD＝1.7。

2.4 正交試驗 分別將提取時間、加水倍數(shù)、提取次數(shù)3項作為考察因素，每個因素選擇3個水平，其分別為：加水倍數(shù)8倍、10倍、12倍；提取時間設(shè)定為0.5h、1h、1.5h；提取次數(shù)1、2、3次；按照L9（34）表進(jìn)行正交試驗。并對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，篩選一貫煎的最佳提取工藝。正交試驗因素水平表見表1，正交試驗設(shè)計表見表2。

表1 正交試驗因素及水平表

表2 正交試驗設(shè)計表

3 數(shù)據(jù)處理與分析

3.1 綜合指標(biāo)計算 因本次試驗涉及多個指標(biāo)，參照Hassan法對3個指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理，將3個指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合處理，得到一個總評指數(shù)，并對總評指數(shù)進(jìn)行分析?？傇u指數(shù)計算公式為：Di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)，OD=D1+D2+D3…+Dn/N。

Ymin為組內(nèi)最小值，Ymax為組內(nèi)最大值，N為指標(biāo)數(shù)，將各實驗所得干膏粉的毛蕊花糖苷含量、干膏率、毛蕊花糖苷含量轉(zhuǎn)移率按照上述公式進(jìn)行計算，將結(jié)果作為最終評價指標(biāo)進(jìn)行分析。OD值結(jié)果見表3，正交試驗分析及結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表4 正交試驗分析及結(jié)果

表5 方差分析表

根據(jù)表5方差分析結(jié)果可知，因素的影響大小順序為：C＞A＞B，即提取次數(shù)＞加水量＞提取時間。方差分析得出的最優(yōu)提取條件應(yīng)選為：A3B3C2，即按處方量稱取一貫煎飲片，加水煎煮2次，每次加12倍水，每次提取1.5小時。經(jīng)過多重分析及結(jié)合實際生產(chǎn)經(jīng)驗，保證干膏率符合一貫煎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的同時，毛蕊花糖苷含量提取1.5小時與提取1小時差異不大，加10倍量水與加12倍量水差異不大。為使提取效果滿足預(yù)期目標(biāo)的同時節(jié)約生產(chǎn)能源，將提取工藝改為：按處方量稱取一貫煎飲片，加水煎煮兩次，第一次加飲片量12倍飲用水，加熱煎煮1小時，第二次加飲片量10倍量的飲用水，加熱煎煮1小時。濾過，合并兩次煎液，濃縮，干燥。

4 驗證

按照處方量稱取一貫煎飲片300kg，均勻分成三份，每份100kg，按上述最優(yōu)工藝進(jìn)行三批生產(chǎn)驗證。即取100kg一貫煎飲片，加水煎煮兩次，第一次加飲片量12倍飲用水，加熱煎煮1小時，第二次加飲片量10倍量的飲用水，加熱煎煮1小時。濾過，合并兩次煎液，濃縮，干燥，所得生產(chǎn)數(shù)據(jù)見表6。通過三批驗證，此工藝生產(chǎn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定，可以生產(chǎn)出安全、均勻、穩(wěn)定可靠的產(chǎn)品。

表6 生產(chǎn)數(shù)據(jù)匯總表

故此工藝可作為經(jīng)典名方一貫煎在生產(chǎn)上的提取工藝。

5 結(jié)論

自2017年3月國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布《古代經(jīng)典名方目錄制定的遴選規(guī)范和遴選原則（征求意見稿）》以來，共100首方劑入選。一貫煎作為傳統(tǒng)中藥方劑補益劑的代表，也列入此目錄。根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2014年149個獲批上市的新藥中，中藥只有11個，僅占7.38%，2015年獲批上市的新藥中，中藥僅有7個。中醫(yī)藥作為我國歷史上獨特的文化瑰寶，在市場上具有龐大的空間，而經(jīng)典名方作為中醫(yī)藥文化中不可或缺的一部分，經(jīng)過上千年的積累，其療效確切，應(yīng)用廣泛，具有扎實的臨床療效積累。本研究基于傳統(tǒng)一貫煎方劑的處方配伍，以干浸膏出膏率、地黃中毛蕊花糖苷含量及含量轉(zhuǎn)移率為綜合考量指標(biāo)，結(jié)合以往生產(chǎn)經(jīng)驗優(yōu)選出一貫煎工業(yè)生產(chǎn)的最優(yōu)提取工藝，并通過三批生產(chǎn)驗證確認(rèn)工藝的穩(wěn)定性、可靠性，為一貫煎大批量生產(chǎn)積累了數(shù)據(jù)和經(jīng)驗，同時也為經(jīng)典名方的傳承與創(chuàng)新貢獻(xiàn)力量。但是一貫煎處方中中藥材種類較多，僅以單一藥材的活性成分作為最終成品的指標(biāo)成分太過單一，仍需對其含量指標(biāo)成分的充分性進(jìn)行深入研究。