姜曉紅 朱家漘, 孫忠剛 曲紹軒 馬 林 李輝平*

（1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；2. 江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3. 江蘇淮香食用菌有限公司，江蘇 淮安 223009）

杏鮑菇（Pleurotuseryngii），學(xué)名刺芹側(cè)耳，隸屬側(cè)耳科、側(cè)耳屬，是我國(guó)三大重要工廠化栽培珍稀食用菌之一，其野生種質(zhì)資源主要集中在南歐、北非、中亞等地[1]。杏鮑菇含有多種膳食纖維、維生素、人體必需氨基酸及功能性多糖等，具有藥食兼用的功能，深受消費(fèi)者的歡迎。

分子標(biāo)記的開發(fā)對(duì)開展種質(zhì)資源收集與評(píng)價(jià)，培育優(yōu)質(zhì)新品種具有重要意義。杏鮑菇子實(shí)體形態(tài)特征較少且極易受外界環(huán)境因素影響，單從形態(tài)水平鑒定杏鮑菇菌株的親緣關(guān)系比較困難。DNA分子標(biāo)記技術(shù)作為一種快速鑒定樣品間遺傳多樣性的方法被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、基因定位、分子輔助育種等多方面。目前在杏鮑菇上得到應(yīng)用的分子標(biāo)記主要包括有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）[2]、隨即擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）[3]、簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性（SSR）[4]、簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)（ISSR）[5]和多核苷酸多態(tài)性（MNP）[6]標(biāo)記技術(shù)等。

插入/缺失（insertion-deletion，InDel）是指在不同個(gè)體之間基因組同一位點(diǎn)的序列發(fā)生了數(shù)個(gè)堿基的插入或缺失，在基因組中的分布密度僅次于SNP，適用于全基因組分子標(biāo)記的開發(fā)。InDel標(biāo)記目前在醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物遺傳學(xué)都得到廣泛應(yīng)用，在食用菌遺傳多樣性中也逐步得到應(yīng)用[7]。Xiang等篩選了68對(duì)InDel引物，分析了88個(gè)香菇栽培群體的遺傳多樣性[8]。沈秀芬等通過對(duì)5個(gè)香菇菌株重測(cè)序，開發(fā)并利用InDel標(biāo)記對(duì)44份香菇菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，并將其分為4個(gè)亞群[9]。

本研究通過InDel分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)搜集的杏鮑菇菌株進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)，為杏鮑菇種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

65份杏鮑菇菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供（表1），其中栽培菌株主要來自國(guó)內(nèi)企業(yè)和市場(chǎng)，CCMSSC菌株來自國(guó)家食用菌標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(kù)。

表1 供試菌株編號(hào)信息

1.2 菌絲培養(yǎng)

采用常規(guī)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）進(jìn)行菌絲活化3 d后，打孔接入250 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）搖瓶進(jìn)行菌絲擴(kuò)大培養(yǎng)，25 ℃下150 r/min培養(yǎng)5 d，接真空泵抽濾收集菌絲，用純凈水洗滌2次。

1.3 DNA純化

取10 mg的菌絲體，研缽中用液氮將其迅速研磨成粉狀，用DNA提取試劑盒（上海生工）按操作手冊(cè)純化DNA。檢測(cè)OD260/OD280比值，范圍在1.7～1.9為合格，并將核酸濃度統(tǒng)一為50 ng/μL后放入 - 20 ℃冰箱備用。

1.4 InDel位點(diǎn)篩選與引物設(shè)計(jì)

依據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的杏鮑菇基因組數(shù)（GCA_015484515.1和GCA_001717165.1），通過Minimap2進(jìn)行基因組比對(duì)[10]，以GCA_001717165.1為參考基因組，篩選30～200 bp堿基差異的InDel位點(diǎn)，隨機(jī)選擇36個(gè)位點(diǎn)，在其上下游各150 bp內(nèi)利用Primer 3設(shè)計(jì)（參數(shù)默認(rèn)）引物（表2），引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

表2 引物序列及多態(tài)性

1.5 PCR擴(kuò)增和電泳分析

PCR反應(yīng)體系：2 × PCRmix 10 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1μL，模板DNA 1μL，補(bǔ)dd H2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 4 min預(yù)變性；95 ℃10 s，63 ℃10 s，72 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min延伸后4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，200 V電泳20 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)處理

在Excel 2016中用1或0標(biāo)記泳道間相同位移上條帶的有或無，再導(dǎo)入NTSYSpc 2.10進(jìn)行分析，計(jì)算遺傳相似系數(shù)并用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel標(biāo)記開發(fā)

經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GCA_015484515.1和GCA_001717165.1間30～200 bp InDel位點(diǎn)共135個(gè)，其中插入45個(gè)，缺失90個(gè)，分布在64條Contig上，每條Contig上的目標(biāo)InDel位點(diǎn)少于5個(gè)。位點(diǎn)之間平均距離大于20 kb，50個(gè)位點(diǎn)之間距離大于10 kb，只有4個(gè)位點(diǎn)距離小于1 kb。隨機(jī)選取的36對(duì)InDel引物中篩選出條帶清晰、重復(fù)性好的多態(tài)性引物25對(duì)，對(duì)擴(kuò)增出的63個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表2，圖1）。

圖1 PerSV16和PerSV20 InDel標(biāo)記多態(tài)性標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

2.2 供試菌株遺傳多樣性分析

利用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行矩陣分析并計(jì)算65份材料間遺傳相似系數(shù)，供試菌株遺傳相似系數(shù)最低值是0.362，表明存在較大的遺傳差異，有豐富的遺傳多態(tài)性，具有很大的開發(fā)潛力。其中菌株P(guān)er22與其他菌株間的遺傳相似系數(shù)均很低，與Per18之間的相似遺傳系數(shù)僅為0.362；而Per53、Per54、Per55、Per56兩兩之間的相似系數(shù)為1，表明這四者之間的親緣關(guān)系極近，很有可能屬于同株異名。

通過UPGMA聚類分析法構(gòu)建的杏鮑菇菌株遺傳親緣聚類樹（圖2），在遺傳相似系數(shù)為0.616的水平上將其分為5大類，第1類群數(shù)量最多，包括Per1、Per2、Per14等51個(gè)菌株，包含了大量國(guó)內(nèi)栽培菌株；第2類群6個(gè)菌株，分別是Per4、Per37、Per39、Per42、Per17、Per46；第3類群6個(gè)菌株，分別是Per3、Per48、Per68、Per70、Per67、Per69。Per45和Per22與其他菌株之間的親緣關(guān)系都很遠(yuǎn)。

圖2 65株杏鮑菇菌株遺傳親緣聚類樹

3 結(jié)論與討論

InDel在基因組中分布廣泛、數(shù)目眾多，分布密度僅次于SNP，遠(yuǎn)高于SSR，是人類和植物中第二豐富的基因變異形式[11-13]，而且大片段InDel標(biāo)記可以直接利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分型檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求低、簡(jiǎn)單易行，成本大大低于SNP和SSR檢測(cè)成本[14,15]，更因其共顯性遺傳、變異穩(wěn)定、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，在群體遺傳分析、基因定位及遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[9,11,16-19]。本研究專門針對(duì)30～200 bp的InDel位點(diǎn)進(jìn)行開發(fā)，雖然得到的候選標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)量有限，但是符合易于檢測(cè)的出發(fā)點(diǎn)，且在首批36個(gè)位點(diǎn)中就篩選得到25個(gè)多態(tài)性候選標(biāo)記，都可用瓊脂糖凝膠直接電泳檢測(cè)，成功比例較高。

InDel標(biāo)記開發(fā)一般利用不同材料重測(cè)序后與參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析獲得[9,20-22]，這就需要該物種有公開的參考基因組，同時(shí)對(duì)不同材料進(jìn)行重測(cè)序，需要一定的資金和時(shí)間成本。對(duì)于SNP和小InDel，重測(cè)序數(shù)據(jù)更多的測(cè)序深度帶來了更高的準(zhǔn)確度。但隨著測(cè)序技術(shù)和組裝算法的不斷進(jìn)步，大InDel在基因組組裝過程中假陽(yáng)性越來越低。本研究通過比對(duì)已公開的杏鮑菇基因組數(shù)據(jù)，簡(jiǎn)單快捷且成本低，后續(xù)可利用更多的基因組組裝數(shù)據(jù)進(jìn)一步擴(kuò)充。

杏鮑菇野生種質(zhì)資源主要分布于南歐、北非、中亞等地區(qū)，雖我國(guó)四川、青海、新疆也有分布報(bào)道[23]，但關(guān)于野生種質(zhì)資源采集的報(bào)道較少。國(guó)內(nèi)工廠化栽培菌株很多是引進(jìn)自日本，并得到推廣[24]。此間經(jīng)過系統(tǒng)選育和雜交育種，我國(guó)栽培菌株具有一定的遺傳多樣性。劉曉紅等對(duì)來自中國(guó)不同地區(qū)的杏鮑菇品種進(jìn)行RAPD分析，發(fā)現(xiàn)23份材料遺傳多樣性很豐富，可分為5大類[25]。馬紅等用RAPD和ISSR標(biāo)記將34個(gè)中國(guó)工廠化栽培杏鮑菇菌株分為4～5大類[26]。楊和川等基于ISSR標(biāo)記對(duì)27株杏鮑菇種質(zhì)資源評(píng)價(jià)也得到類似結(jié)果[27]。這與本研究結(jié)果較為類似。但是魏傳正等利用基因二代測(cè)序技術(shù)的MNP標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)56份工廠化栽培菌株分析后，發(fā)現(xiàn)相似度均接近100.00%，認(rèn)為國(guó)內(nèi)杏鮑菇栽培品種高度一致[6]。對(duì)國(guó)內(nèi)栽培菌株的遺傳多樣性分析還值得進(jìn)一步研究探討。