王柏蓮 林 青 林慧珍 蔣誠傳 廖 瑜 潘慧穎 李泰階

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣西南寧 530199

科學(xué)技術(shù)的發(fā)展帶動了醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)經(jīng)歷了漫長的手工鑒定過程，從經(jīng)典手工鑒定到全自動微生物鑒定再到如今的質(zhì)譜鑒定時(shí)代，實(shí)現(xiàn)了革命性的飛躍。廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院是武鳴區(qū)唯一的一所三級甲等醫(yī)院，承擔(dān)著武鳴區(qū)內(nèi)幾所醫(yī)學(xué)院校的大專生、本科生的實(shí)習(xí)帶教工作，這些學(xué)生畢業(yè)后很多就業(yè)于基層醫(yī)院或一些檢測儀器設(shè)施不夠完善的小型醫(yī)院，大部分基層醫(yī)院并未配置質(zhì)譜儀，其檢測能力尚待提高，而如何在當(dāng)今的質(zhì)譜時(shí)代下，讓學(xué)生既能掌握質(zhì)譜快速鑒定微生物技術(shù)，又能牢固掌握經(jīng)典微生物鑒定方法（形態(tài)學(xué)及生理生化學(xué)），并利用經(jīng)典鑒定方法與質(zhì)譜鑒定技術(shù)的結(jié)合，提高對苛養(yǎng)菌、厭氧菌和罕見菌的認(rèn)知，使學(xué)生能夠從容地走向工作崗位，這是一個(gè)值得探索的問題。

1 質(zhì)譜技術(shù)原理以基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）技術(shù)鑒定微生物為例

微生物的主要生物活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)和核酸，核酸決定蛋白的表達(dá)，蛋白的表達(dá)決定生物體表型。基于蛋白質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行的微生物鑒定,相比核酸水平進(jìn)行的鑒定更為準(zhǔn)確和直接[1]。MALDITOF MS 技術(shù)通過對微生物蛋白質(zhì)的解吸分析達(dá)到對微生物鑒定和分型目的。其檢測原理是基質(zhì)與微生物蛋白質(zhì)形成共結(jié)晶體，共結(jié)晶體在激光照射下，發(fā)生解吸和電離，菌體蛋白質(zhì)發(fā)生離子化，帶電離子在電場作用下進(jìn)入飛行時(shí)間檢測器，離子依質(zhì)荷比不同而分離，最終在飛行管末端檢測到每個(gè)離子峰度，形成指紋圖譜。通過軟件對這些指紋圖譜進(jìn)行處理并和數(shù)據(jù)庫中已知微生物標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對，達(dá)到鑒定微生物目的[2]。

2 MALDI-TOF MS技術(shù)在微生物鑒定中的優(yōu)勢與局限

近年來，MALDI-TOF MS 是在微生物鑒定領(lǐng)域方面發(fā)展迅速的一種新型鑒定技術(shù)，不僅對常見病原菌鑒定準(zhǔn)確率達(dá)95%以上[3]，還能快速鑒定經(jīng)典方法很難鑒定的苛養(yǎng)菌、厭氧菌、罕見菌等。經(jīng)典的生理生化鑒定方法對這些生長條件要求高，生化反應(yīng)不活躍的細(xì)菌，很難鑒定到種水平[4]；質(zhì)譜技術(shù)在真菌鑒定方面，特別是對酵母菌的鑒定已成為一種常規(guī)的鑒定方法，對絲狀真菌的鑒定也取得了一定成效[5]；MALDI-TOF MS 技術(shù)憑借其具有簡單快速、高效準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品[6]、水產(chǎn)[7]、獸醫(yī)及臨床[8-9]等多個(gè)領(lǐng)域的病原微生物鑒定工作，在細(xì)菌、真菌和病毒鑒定方面，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。但該技術(shù)也存在一定的局限性，如質(zhì)譜技術(shù)無法鑒定數(shù)據(jù)庫中沒有的菌種、新出現(xiàn)的菌種，另外對混合菌的鑒定還不太準(zhǔn)確，直接檢測時(shí)因細(xì)菌濃度不夠而不能檢出[10]；遺傳物質(zhì)相近的菌種，由于蛋白質(zhì)指紋圖譜接近無法區(qū)分，導(dǎo)致鑒定結(jié)果存在偏差和誤差[11]，如陰溝、神戶、霍氏等；質(zhì)譜技術(shù)無法代替需經(jīng)全面生化反應(yīng)和血清學(xué)試驗(yàn)鑒定分型的細(xì)菌，如沙門菌屬、志賀菌屬等需要經(jīng)典手工的血清學(xué)鑒定作為補(bǔ)充。

3 質(zhì)譜時(shí)代經(jīng)典微生物鑒定的傳承與創(chuàng)新

質(zhì)譜時(shí)代下臨床微生物教學(xué)面臨的現(xiàn)狀：由于質(zhì)譜技術(shù)在微生物鑒定中具有高效、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢，加上臨床工作量大，師資力量不足，帶教老師只顧著埋頭完成工作，往往忽略了給實(shí)習(xí)生傳授經(jīng)典的微生物鑒定方法，只有當(dāng)質(zhì)譜結(jié)果與細(xì)菌形態(tài)特征不相符時(shí)，才會用經(jīng)典的鑒定方法進(jìn)行鑒定。學(xué)生進(jìn)入微生物室實(shí)習(xí)階段，是理論與實(shí)踐結(jié)合的提升，但是目前由于過度依賴質(zhì)譜，致使學(xué)生在課堂上學(xué)到的經(jīng)典鑒定方法的理論知識未能在臨床實(shí)踐中得到鞏固，如何解決目前面臨的這個(gè)問題？本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行探索與實(shí)踐。

3.1 以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，增強(qiáng)學(xué)生對常見病原菌的感性認(rèn)知

細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查是細(xì)菌重要的鑒定手段之一，通過觀察細(xì)菌鏡下形態(tài)染色特點(diǎn)和平板上菌落特征，可以為后續(xù)的檢驗(yàn)提供參考依據(jù)，對少數(shù)具有典型特征的細(xì)菌可以進(jìn)行初步診斷[12]。臨床微生物待測標(biāo)本在完成檢測前涉及多個(gè)崗位環(huán)節(jié)，包括標(biāo)本核收、接種、涂片閱片、分離鑒定、藥敏試驗(yàn)、結(jié)果報(bào)告等。學(xué)生輪轉(zhuǎn)到分離鑒定崗位時(shí)，帶教老師會帶領(lǐng)學(xué)生對前一天接種的平板進(jìn)行判讀，挑選出可疑菌落進(jìn)行鑒定。帶教老師采用以提問題為基礎(chǔ)的啟發(fā)式教學(xué)模式[13]，引導(dǎo)學(xué)生識別臨床標(biāo)本可疑致病菌在不同平板上的菌落特征及其染色特點(diǎn)。如：血平板上菌落形成“臍窩狀”的細(xì)菌懷疑什么細(xì)菌？為什么會有“臍窩狀”？血平板上有生姜?dú)馕丁a(chǎn)生金屬光澤的菌落懷疑什么細(xì)菌？麥康凱平板適合哪類細(xì)菌生長？為什么有些菌落是紅色，有些菌落是無色透明？通過提問式、啟發(fā)式教學(xué)模式引導(dǎo)學(xué)生對臨床常見病原菌的菌落形態(tài)特征有初步的感性認(rèn)識，對于不常見和不認(rèn)識的可疑菌落做重點(diǎn)標(biāo)記，等待質(zhì)譜鑒定結(jié)果再決定下一步的鑒定步驟。

3.2 生化反應(yīng)是框架，由點(diǎn)到面構(gòu)建細(xì)菌知識體系

3.2.1 基于觸酶試驗(yàn)構(gòu)建革蘭氏陽性菌知識體系 革蘭氏陽性病原性球菌是一類主要引起化膿性感染的球菌。臨床常見主要包括葡萄球菌屬、鏈球菌屬和腸球菌屬。挑選出的可疑革蘭氏陽性病原性球菌通過觸酶試驗(yàn)由點(diǎn)到面進(jìn)行拓展。通過觸酶試驗(yàn)把革蘭氏陽性球菌分成觸酶陽性的葡萄球菌屬和觸酶陰性鏈球菌屬、腸球菌屬兩大類。通過七葉苷、膽汁七葉苷試驗(yàn)鑒別出鏈球菌屬和腸球菌屬；利用桿菌試驗(yàn)、Optoeh 試驗(yàn)、CAMP 試驗(yàn)鑒別出化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌、B 群鏈球菌；進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)，鑒定葡萄球菌的致病性。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，使血漿凝固，是葡萄球菌屬中致病力最強(qiáng)的。鑒定出金黃色葡萄球菌后，可以進(jìn)一步做能夠初步鑒定流感嗜血桿菌的“衛(wèi)星試驗(yàn)”。通過由點(diǎn)到面、觸類旁通進(jìn)行拓展，把革蘭氏陽性病原性球菌的生化鑒定要點(diǎn)高度概括總結(jié)，梳理出脈絡(luò)清晰的鑒定思路，使學(xué)生系統(tǒng)、牢固地掌握革蘭氏陽性病原性球菌經(jīng)典鑒定方法。

3.2.2 基于氧化酶、氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)構(gòu)建革蘭氏陰性菌知識體系 革蘭氏陰性桿菌是臨床最常見的病原菌之一，是泌尿道、呼吸道、腸道、腹腔和盆腔等常見病原菌。革蘭氏陰性桿菌鑒定是否準(zhǔn)確，對選擇正確的藥敏鑒定板條非常重要。面對種類繁多的革蘭氏陰性桿菌，怎樣才能達(dá)到正確鑒定的目的？從培養(yǎng)學(xué)生正確的鑒定思路著手，通過關(guān)鍵性試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌的大致分類。對于挑選出的可疑革蘭氏陰性桿菌病原菌，可通過氧化酶試驗(yàn)和葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)把革蘭氏陰性桿菌分成三大類：一是腸桿菌科細(xì)菌，氧化酶陰性、發(fā)酵葡萄糖；二是非發(fā)酵菌，氧化酶陽性（不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌除外），不發(fā)酵葡萄糖；三是氧化酶既陽性又發(fā)酵葡萄糖的弧菌屬、氣單胞菌屬和鄰單胞菌屬。腸桿菌科細(xì)菌又可以根據(jù)苯丙氨酸脫氨酶和葡萄糖酸鹽試驗(yàn)分為三大類：一是苯丙氨酸脫氨酶和葡萄糖酸鹽試驗(yàn)陰性的腸桿菌科細(xì)菌；二是苯丙氨酸脫氨酶陰性，葡萄糖酸鹽陽性的腸桿菌科細(xì)菌；三是苯丙氨酸脫氨酶陽性，葡萄糖酸鹽陰性的腸桿菌科細(xì)菌。通過關(guān)鍵性試驗(yàn)對細(xì)菌進(jìn)行鑒定分類，使學(xué)生對種類繁多的革蘭氏陰性桿菌進(jìn)行生化鑒定時(shí)，沿著氧化酶試驗(yàn)和葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)這條主線，達(dá)到思路清晰、觸類旁通的效果，不至于面對種類繁多的革蘭氏陰性桿菌，感到無所適從。

3.3 血清學(xué)是補(bǔ)充，快速診斷病原菌

質(zhì)譜技術(shù)鑒定無法代替血清學(xué)，血清學(xué)試驗(yàn)是質(zhì)譜鑒定技術(shù)的有效補(bǔ)充。需經(jīng)全面生化反應(yīng)和血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行分型的細(xì)菌如沙門菌屬、志賀菌屬、霍亂弧菌，致病性大腸埃希菌等，質(zhì)譜只能鑒定到屬水平，必須進(jìn)行經(jīng)典手工的血清學(xué)鑒定才能進(jìn)行分型和保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。比如質(zhì)譜鑒定出沙門菌屬，須用沙門菌A ～F 多價(jià)血清做玻片凝集試驗(yàn)，凝集后進(jìn)一步作O 抗原、H 抗原進(jìn)行分型。對這些可引起人與人之間的傳播的病原菌，質(zhì)譜的快速鑒定加上血清學(xué)的有效補(bǔ)充，可以快速診斷病原菌，這對控制傳染病的傳播具有重要意義，并為臨床感染性疾病的快速準(zhǔn)確診斷和有效治療提供方案[14]。

3.4 關(guān)鍵生化反應(yīng)結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)的應(yīng)用

質(zhì)譜鑒定是對微生物的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，核酸決定蛋白的表達(dá)，遺傳物質(zhì)相近的菌種檢測結(jié)果會存在一定的誤差，因此需要關(guān)鍵生化反應(yīng)加以鑒別。例如SS 平板上志賀菌與不發(fā)酵乳糖或緩慢發(fā)酵乳糖的大腸埃希菌，菌落形態(tài)相似，志賀菌抗血清有交叉反應(yīng)，質(zhì)譜鑒定為大腸埃希菌，四種多價(jià)血清凝集，可用關(guān)鍵生化反應(yīng)醋酸鈉試驗(yàn)鑒別出來。臨床常見的腸桿菌屬細(xì)菌，如陰溝腸桿菌、神戶腸桿菌、阿氏腸桿菌、霍氏腸桿菌，其蛋白峰十分接近，質(zhì)譜無法區(qū)別出來，因此可利用兩個(gè)關(guān)鍵生化反應(yīng)V-P 試驗(yàn)和蜜二糖試驗(yàn)進(jìn)行鑒別。

3.5 借助質(zhì)譜鑒定技術(shù)建立罕見細(xì)菌菌種庫，提高學(xué)生對苛養(yǎng)菌、厭氧菌和罕見菌的認(rèn)識

閱板時(shí)遇到不常見、不認(rèn)識的可疑菌落，借助質(zhì)譜鑒定結(jié)果，查閱相關(guān)資料和文獻(xiàn)，通過外送菌株進(jìn)行16s RNA 測序確證后[15]，實(shí)驗(yàn)室建立本室罕見細(xì)菌庫目錄。微生物實(shí)習(xí)期一般為6 ～8 周，實(shí)習(xí)生在實(shí)習(xí)期內(nèi)無法獲取一些罕見細(xì)菌的標(biāo)本，導(dǎo)致對某些罕見、苛養(yǎng)菌缺少直觀認(rèn)識[16]。帶教老師可以通過罕見細(xì)菌庫目錄挑選出需要教學(xué)的細(xì)菌，在帶教老師的指導(dǎo)下由學(xué)生進(jìn)行培養(yǎng)，通過培養(yǎng)鑒定讓學(xué)生掌握罕見菌的菌落特征、染色特點(diǎn)、生化特性、耐藥特點(diǎn)，提高實(shí)習(xí)生專業(yè)實(shí)踐能力。質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展在當(dāng)今實(shí)習(xí)帶教中發(fā)揮了重要的作用，為學(xué)生認(rèn)識和學(xué)習(xí)苛養(yǎng)菌、厭氧菌和罕見菌提供了有利機(jī)會，同時(shí)借助質(zhì)譜技術(shù)，建立實(shí)驗(yàn)室罕見細(xì)菌菌種庫，可實(shí)現(xiàn)對當(dāng)代學(xué)生的創(chuàng)新性教學(xué)。

4 小結(jié)

臨床微生物實(shí)習(xí)生在實(shí)習(xí)階段是深化理論知識、提升專業(yè)實(shí)踐能力的關(guān)鍵階段。在質(zhì)譜快速鑒定微生物時(shí)代下，把質(zhì)譜快速鑒定與經(jīng)典的微生物鑒定貫穿于病原體鑒定的教學(xué)過程中，使學(xué)生既能掌握先進(jìn)質(zhì)譜快速鑒定新技術(shù)，并在質(zhì)譜技術(shù)指導(dǎo)下掌握苛養(yǎng)菌、厭氧菌和罕見菌的菌落形態(tài)特征、染色特點(diǎn)、生化特性，又能夠熟練掌握經(jīng)典手工鑒定方法，以便更好地適應(yīng)各級醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室的工作需要。