李海霞，周 民，周有君，常 依，王雅露

（湖南省兒童醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

水牛角為?？苿?dòng)物水牛（Bubalus bubalisLinnaeus）的角，可作為中藥犀角的代用品。水牛角始載于梁·陶弘景《名醫(yī)別錄》，味苦、咸，性寒，歸心、肝、胃經(jīng)，專入血分，為治血熱毒盛之要藥，臨床常用于治療血熱出血證。但其止血作用機(jī)制及有效成分尚不明確[1-2]。以往學(xué)者大多采用藥理實(shí)驗(yàn)研究水牛角主要成分，發(fā)現(xiàn)水牛角含有膽甾醇、強(qiáng)心成分、蛋白質(zhì)、肽類、氨基酸及鈣鹽。水牛角粉及水牛角煎液中含有鎂、磷、鈉等元素以及硅、鐵、錳、鋅、銅、鋁、鈦等微量元素[3-5]。有研究發(fā)現(xiàn)水牛角水解物在體外能夠抗炎、止血，且有一定誘導(dǎo)血小板聚集的作用[6-8]。本課題組前期研究以干姜水煎劑為造模用藥，建立了大鼠血熱出血模型，故本研究采用大鼠血熱出血模型研究水牛角的止血功效和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（350±50）g，8～9周齡，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SYXK（湘）2020-0012。湖南省兒童醫(yī)院兒科醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物房飼養(yǎng)。濕度50%～55%，溫度22～24 ℃，定期更換墊料，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)遵循有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)已通過湖南省兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查（批件號：HCHLL-2020-36）。

1.2 藥物 水牛角飲片（批號：201911902）、干姜飲片（批號：1812020242）均購自湖南三湘中藥飲片有限公司，經(jīng)戴冰主任藥師鑒定，水牛角為?？苿?dòng)物水牛BubalisLinnaens的角，干姜為姜科植物Zingiber officinaleRosc.的干燥根莖，質(zhì)量均為優(yōu)。云南白藥（云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號：ZLA1811）；無水乙醇（鄭州派尼化學(xué)試劑廠，批號：181216）。水牛角水煎液制備：在水牛角中加入雙蒸水500 mL，砂鍋武火熬開后，文火熬30 min，去上沫，再煮30 min，倒出上清液；再煎煮一次，兩次液體混合。離心10 min（3 000 r/min，離心半徑為30 cm），調(diào)配至質(zhì)量濃度分別為3.60、1.80、0.90 g/mL，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

干姜水煎液制備：將干姜飲片（適量）加10倍水浸泡后，武火煮開，文火煎煮1 h，趁熱過濾，同上操作再煎煮2次之后，3次濾液混合至一起濃縮至1.5 kg/L，即為干姜水煎劑，冷凍保存，備用。

云南白藥生理鹽水溶液配制：將4 g的云南白藥以無菌生理鹽水將原液稀釋為50 mg/mL。

1.3 試劑 HE染色液（上海埃彼化學(xué)試劑有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，湖北威德利化學(xué)試劑有限公司，批號：14S002）；10%水合氯醛（湖南省兒童醫(yī)院藥房配制）；蘇木素-伊紅染色液（批號：P032IH）、中性樹膠（批號：P033IH）均購自Auragene；二甲苯（批號：10023418）、無水乙醇（批號：10009218）均購自國藥集團(tuán)。

1.4 主要儀器 SSW-600-2S型電熱恒溫水槽（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；YT-6C型生物組織攤烤片機(jī)（湖北孝感分析試劑公司）；P031IH防脫載玻片（Auragene）；AE41光學(xué)顯微鏡（美國Motic）；AG135電子天平（梅特勒-托利多）；M1ii1-Qadvantage自動(dòng)雙重純水蒸餾器（貝徠美生物科技有限公司）；可調(diào)式移液器（德國Eppendorf公司）；5810R臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；LMQ.C立式高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)藥公司）；BJH-30P陶瓷自動(dòng)中藥煲（潮州市科力電器有限公司）。

1.5 分組與造模 將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、出血模型組、云南白藥組、水牛角高劑量組、水牛角中劑量組、水牛角低劑量組，每組10只。除正常對照組大鼠外，其余各組大鼠以5%乙醇代替自由飲水，并灌胃干姜水煎液（15 g/kg），復(fù)制血熱出血模型[6]。正常對照組自由飲水，并灌胃等體積蒸餾水。

1.6 實(shí)驗(yàn)給藥 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置各組給藥劑量。造模6 h后，云南白藥組灌胃云南白藥溶液，0.5 g/（kg·d）。水牛角高、中、低劑量組大鼠分別灌胃高、中、低劑量的水牛角水煎液，劑量分別為36.0、18.0、9.0 g/（kg·d）。正常對照組、出血模型組大鼠灌胃等體積蒸餾水，10.0 mL/（kg·d）。1次/d，連續(xù)14 d。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 一般體征 給藥前、給藥后（第14天），24 h之內(nèi)監(jiān)測代謝籠中各組大鼠飲水量、攝食量、尿量及糞便量的變化，繼續(xù)觀察24 h，計(jì)算各組大鼠每100 g體質(zhì)量的上述指標(biāo)平均值；并于每組大鼠各取新鮮糞便1粒，先測濕質(zhì)量，再置于105 ℃的烘干箱5 h，冷卻后測干質(zhì)量。糞便含水量=[（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量]×100%；體質(zhì)量增長率=（給藥后體質(zhì)量-給藥前體質(zhì)量）/給藥前體質(zhì)量×100%。

給藥前、給藥后清晨分別測定大鼠肛溫。

1.7.2 凝血功能 末次給藥1 h后，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，手術(shù)臺上切開腹腔找到腹主動(dòng)脈，用采血管穿入其中，每只大鼠取10 mL血液，3.8%枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝，4 ℃，3 000 r/min（離心半徑30 cm）離心10min，取血清，測定凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、纖維蛋白原（FIB）、凝血酶時(shí)間（TT）、纖維蛋白降解產(chǎn)物（FDP）、抗凝血酶Ⅲ（AT）。

1.7.3 肺組織、胃組織病理學(xué)變化 大鼠取血后處死，取右葉肺、胃組織，10%多聚甲醛溶液固定48 h，用全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片、蘇木精和伊紅（HE）染色，光鏡觀察拍片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊，計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般體征 出血模型組大鼠肛溫高于正常對照組（P＜0.01），體質(zhì)量增長率、攝食量、飲水量、尿量、糞便量及糞便含水量均低于正常對照組（P＜0.01）；云南白藥組大鼠肛溫低于出血模型組（P＜0.05），體質(zhì)量增長率高于出血模型組（P＜0.01）；水牛角高、中劑量組大鼠肛溫低于出血模型組（P＜0.01或P＜0.05），體質(zhì)量增長率、攝食量、飲水量、尿量、糞便量及糞便含水量均高于出血模型組（P＜0.01或P＜0.05）；水牛角高劑量組大鼠肛溫低于云南白藥組（P＜0.01）；水牛角高、中劑量組大鼠攝食量、飲水量、尿量、糞便量及糞便含水量均高于云南白藥組（P＜0.01或P＜0.05）；水牛角高劑量組大鼠體質(zhì)量增長率、攝食量、飲水量、尿量、糞便量及糞便含水量均高于水牛角低劑量組（P＜0.01或P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠一般體征比較 （）

表1 各組大鼠一般體征比較 （）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與出血模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與云南白藥組比較，dP＜0.05，eP＜0.01；與水牛角低劑量組比較，fP＜0.05，gP＜0.01。

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2.2 各組大鼠凝血功能比較 出血模型組大鼠PT、APTT均低于正常對照組，F(xiàn)IB、TT均高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。云南白藥組大鼠TT、FIB均低于出血模型組（P＜0.05）；云南白藥組大鼠PT、APTT與出血模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。水牛角高、中劑量組大鼠PT、APTT均高于出血模型組，F(xiàn)IB、TT均低于出血模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；水牛角低劑量組大鼠FIB低于出血模型組（P＜0.01）；水牛角低劑量組大鼠PT、APTT、TT與出血模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。水牛角高劑量組大鼠PT、APTT高于云南白藥組（P＜0.05）；水牛角高、中劑量組大鼠PT、APTT高于水牛角低劑量組，F(xiàn)IB低于水牛角低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；水牛角高劑量組大鼠PT、APTT、TT、FIB與水牛角中劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠凝血功能指標(biāo)比較 （）

表2 各組大鼠凝血功能指標(biāo)比較 （）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與出血模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與云南白藥組比較，eP＜0.05；與水牛角低劑量組比較，fP＜0.05，gP＜0.01。

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2.3 各組大鼠FDP、AT比較 出血模型組大鼠FDP、AT高于正常對照組（P＜0.01）；云南白藥組大鼠AT與出血模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；云南白藥組大鼠FDP低于出血模型組（P＜0.01）；水牛角高、中劑量組大鼠FDP、AT均低于出血模型組（P＜0.01）；水牛角低劑量組大鼠FDP、AT與出血模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。水牛角高劑量組大鼠FDP、AT低于云南白藥組（P＜0.01）；水牛角中劑量組大鼠AT低于云南白藥組（P＜0.05）；水牛角中劑量組大鼠FDP與云南白藥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。水牛角高、中劑量組大鼠AT、FDP低于水牛角低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；水牛角高劑量組大鼠FDP、AT與水牛角中劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠FDP、AT 比較 （）

表3 各組大鼠FDP、AT 比較 （）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與出血模型組比較，bP＜0.01；與云南白藥組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與水牛角低劑量組比較，eP＜0.05，fP＜0.01。

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2.4 大鼠肺組織病理學(xué)變化 正常對照組大鼠肺泡、支氣管及肺間隔基本正常。出血模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)明顯被破壞，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔少量紅細(xì)胞浸潤，伴炎癥細(xì)胞浸潤。與出血模型組比較，云南白藥組、水牛角低劑量組、水牛角中劑量組、水牛角高劑量組大鼠肺出血表現(xiàn)均不同程度減輕，尤其以水牛角高劑量組最明顯。水牛角高劑量組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，肺間質(zhì)及間隔出血、肺泡壁顯著改善，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。云南白藥組、水牛角中劑量組可見部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)和間隔少量出血，纖維組織少量增生，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤。水牛角低劑量組以上情況稍有改善，但不明顯。（見圖1）

圖1 各組大鼠肺組織病理圖 （HE，×100）

2.5 大鼠胃組織病理學(xué)變化 正常對照組大鼠胃黏膜基本正常。與正常對照組比較，出血模型組大鼠胃黏膜水腫、充血、炎癥細(xì)胞浸潤，固有層中性粒細(xì)胞浸潤，胃底腺有少量不規(guī)則現(xiàn)象，主細(xì)胞和壁細(xì)胞數(shù)明顯減少。與出血模型組比較，云南白藥組、水牛角低劑量組、水牛角中劑量組、水牛角高劑量組大鼠胃黏膜損傷有不同程度減輕，尤其以水牛角高、中劑量組改善明顯。（見圖2）

圖2 各組大鼠胃組織病理圖 （HE，×100）

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，清熱類中藥可在炎癥反應(yīng)環(huán)節(jié)發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗感染作用[9-11]，但水牛角的清熱止血作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用干姜水煎液灌胃并以5%乙醇代替自由飲水，建立大鼠血熱出血模型。結(jié)果顯示，模型大鼠體質(zhì)量、攝食量等減少，肺組織、胃組織出血，并且大鼠PT、APTT縮短，F(xiàn)IB含量增加，TT延長，AT、FDP升高，表明血熱出血模型復(fù)制成功。

血液黏度是反映血液在血管中流動(dòng)是否通暢的指標(biāo)。血液黏度高和血流速度變慢，則容易發(fā)生血栓或栓塞性疾病，從而導(dǎo)致血液淤滯、血溢脈外而出血[12-13]。常見原因有血細(xì)胞數(shù)量增多，紅細(xì)胞變形性差，血小板數(shù)量增高及黏附性增強(qiáng)等，或血漿中溶質(zhì)成分改變，如血糖、血脂、纖維蛋白原濃度升高等[14]。本實(shí)驗(yàn)中，血熱出血模型組大鼠飲水量、攝食量明顯減少，尿量、糞便含水量及體質(zhì)量增長率均明顯下降，全血黏度及血漿黏度顯著增加，表明干姜之辛熱能入血分，耗傷津液，導(dǎo)致全血黏度增加、凝血功能異常，引起DIC傾向；而高、中劑量的水牛角水煎液和云南白藥可改善大鼠飲水量、攝食量等一般體征，降低FIB、AT、FDP，延長PT、APTT，縮短TT，使全血及血漿黏度下降，改善血液流動(dòng)性。而低劑量水牛角水煎液對以上指標(biāo)改善不明顯，提示水牛角的清熱止血作用與劑量密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，水牛角高、中劑量組大鼠FDP、AT均低于出血模型組，表明水牛角水煎液能通過調(diào)整纖溶系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，改善肺組織和胃組織出血等病理損傷，從而綜合發(fā)揮止血作用。與既往學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)一致[2，15]。

關(guān)于水牛角的成分，有研究采用超高效液相色譜-四極飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UHPLC Q-TOF-MS）結(jié)合主成分分析法（principal component analysis, PCA）對水牛角、羚羊角、山羊角、牛角骨的角蛋白進(jìn)行分類，并找出其標(biāo)記肽段而進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，每個(gè)樣品的標(biāo)記肽隱藏在大量的胰蛋白酶肽中，4種樣品的四基峰離子（BPI）圖譜非常相似[16]。近紅外光譜技術(shù)結(jié)果顯示，水牛角水解過程中脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸的濃度最高[17-18]；且水牛角與羚羊角均含有酰胺基團(tuán)、CH基團(tuán)和Ca3（PO4）2混合物[19]。因此，水牛角的抗血栓、抗凝血作用，可能與其含有的多肽段及氨基酸成分有關(guān)[20-22]。水牛角發(fā)揮止血的具體機(jī)制及成分有待于進(jìn)一步研究。