王曉戈，張靖笛，李 月，田林強

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院創(chuàng)傷與骨科研究所，河南 新鄉(xiāng) 453000）

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是最常見的肌肉骨骼系統(tǒng)疾病，是導致老年人殘疾和生活能力喪失的常見原因。OA病理特征是軟骨退變和丟失、軟骨下骨損傷和硬化，主要以行動受限及關節(jié)疼痛為主要臨床癥狀[1]。研究[2]表明，在發(fā)達國家中OA產生了較大的經濟負擔，其治療費用占國內生產總值的1.0%～2.5%。目前骨關節(jié)炎傳統(tǒng)的治療主要包括健康教育、疼痛管理、藥物治療和手術治療[3-4]。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）在表觀遺傳等多種層面上對靶基因調控，從而發(fā)揮調節(jié)細胞分化、增殖和凋亡等作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG14能通過刺激miR-4673調節(jié)細胞因子信號傳導抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）表達，從而促進肝癌細胞的增殖和抑制凋亡[5]。但是，lncRNA SNHG14在骨關節(jié)炎中的作用尚未見報道。

木犀草苷(Cynaroside, Cy)，是植物中廣泛存在的一種黃酮苷類化合物[3]。Cy具有抗腫瘤[6]、抗炎[7]、抗糖尿病[8]和抗氧化[9]等藥理活性。研究[10]表明，Cy是能夠發(fā)揮抗炎作用的主要化合物之一，但Cy對人軟骨細胞的保護作用尚未見報道。因此，本研究在體外構建骨關節(jié)炎細胞模型，并探討Cy對骨關節(jié)炎細胞模型的保護作用及其可能的機制，旨在為臨床治療提供新的藥物選擇。

1 材料

1.1 實驗藥物及細胞 木犀草苷（批號：SC8790）購自北京索萊寶公司；SW1353人軟骨肉瘤細胞系（GDC0621）由新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學學院王磊教授惠贈。

1.2 主要試劑與儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基（批號：AD1002）購自河南省普諾易生物制品研究院有限公司；胎牛血清（批號：16140089）購自購自美國賽默飛世爾科技公司；0.25%胰蛋白酶（批號：C125C1）購自新賽美生物科技有限公司；PBS緩沖液（批號：BL302A）購自蘭杰柯科技有限公司；白細胞介素-1β（IL-1β）（批號：200-01B）購自美國派普泰克生物科技有限公司；反轉錄試劑盒（批號：KR116-02）、熒光定量試劑盒（批號：FP209-02）購自天根生化科技有限公司；無水乙醇（批號：20201112）購自天津市德恩化學試劑有限公司；RIPA裂解液（批號：P0013B）購自碧云天生物技術有限公司；羊抗兔一抗基質金屬蛋白酶13（MMP13）（批號：39012）、兔抗人一抗二型膠原（COL2a1）（批號：Ab34712）、兔抗人一抗聚集蛋白聚糖（ACAN）（批號：Ab194594）均購自美國Abcam公司；二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG（批號：7076S）、二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（批號：7074S）、兔抗人一抗GAPDH（批號：2118S）均購自美國Cell Signaling Technology公司；CCK8試劑盒（批號：C0042）購自中國碧云天生物技術有限公司。Multiskan酶標儀（賽默飛世爾科技公司）；電泳儀（上海伯樂生命醫(yī)學產品有限公司）、Real-Time PCR儀（Roche lightcycler 480）；培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）（中國賽默飛世爾科技有限公司）；化學發(fā)光儀（上海勤祥科學儀器有限公司）；倒置顯微鏡（德國徠卡生物系統(tǒng)有限公司）。

2 實驗方法

2.1 SW1353細胞培養(yǎng) 將SW1353細胞置于含10%胎牛血清及雙抗的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，并放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 Cy溶液配制 將Cy（20 mg）用1 mL培養(yǎng)基進行溶解，配置成20 mg/mL母濃縮液，放置于-20 ℃冰箱儲存，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.3 CCK-8檢測細胞毒性 取對數(shù)生長期的SW1353細胞接種于96孔板中，每孔加入1×105個細胞，當80%～90%細胞貼壁后給予0.1%二甲基亞砜（DMSO）及不同濃度（0、10、20、30、40、50μmol/mL）的Cy處理24 h。在每孔加入CCK-8試劑10 μL繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀測量450 nm波長的OD值。

2.4 實驗分組 確定Cy及IL-1β的干預濃度后，將SW1353細胞分為4組。（1）正常對照組：SW1353細胞不進行任何處理；（2）IL-1β組：采用10 ng/mL IL-1β處理SW1353細胞24 h；（3）木犀草苷低劑量組：采用10 ng/mL IL-1β+10 μmol/mL Cy處理SW1353細胞24 h；（4）木犀草苷高劑量組：采用10 ng/mL IL-1β+20 μmol/mL Cy處理SW1353細胞24 h。

2.5 RT-qPCR 檢測MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA、COL2a1 mRNA、ACAN mRNA、SNHG14 mRNA表達水平 取對數(shù)生長期SW1353細胞接種于6孔板中，按照“2.4”分組處理。收集各組細胞，采用Trizol法進行細胞總RNA的提取，以10 cm皿為例加入Trizol 1 mL孵育3～5 min；加入200 μL氯仿劇烈震蕩，充分混勻。采用Multiskan酶標儀檢測RNA的濃度及純度；使用Fastking RT kit（with gDNase）試劑盒將總RNA反轉錄合成cDNA；將合成的cDNA作為模板進行實時熒光定量，實時熒光定量PCR反應程序如下，95 ℃3 min，95 ℃10 s，60 ℃10 s，循環(huán)40次。將所得的結果采用2-ΔΔCt法進行分析。所使用的引物均由上海生物工程有限公司合成。目的基因引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

2.6 Western blotting檢測MMP-13、COL2a1、ACAN蛋白表達取對數(shù)生長期SW1353細胞接種于6孔板中，按照“2.4”分組處理。收集各組細胞，采用RIPA試劑將細胞進行裂解，BCA蛋白定量試劑盒進行定量，提取SW1353細胞的總蛋白，選取1.0 mm的孔進行加樣，每孔上樣量為10 μL，經SDS-PAGE電泳1.5 h，轉膜至甲醇浸泡過的PVDF膜，轉膜2.5 h，之后采用5%脫脂奶粉封閉1 h，敷單克隆兔抗人一抗（1∶1 000）4 ℃冰箱搖床過夜。T-BST洗膜30 min（3次），室溫加入辣根過氧化物標記的酶二抗孵育（1∶10 000）1 h，T-BST洗膜30 min（3次），化學發(fā)光成像顯影。將所得結果采取ImageJ進行分析整理。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料均符合正態(tài)分布且滿足方差齊性，計量資料采用“均數(shù)±標準差”（）表示，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同濃度的Cy對SW1353細胞活性的影響 與正常對照組比較，10、20 μmol/mL Cy處理24 h后SW1353細胞活性明顯增強（P＜0.05），50 μmol/mL Cy可明顯抑制細胞活性（P＜0.01）。所以后續(xù)實驗采用木犀草苷（Cy）濃度10、20 μmol/mL進行。（見圖1）

圖1 CCK-8 檢測不同濃度Cy 對SW1353 細胞活性的影響（，n=3）

3.2 各組SW1353細胞MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA、ACAN mRNA、COL2a1 mRNA相對表達量比較 IL-1β組MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA相對表達量高于正常對照組，ACAN mRNA、COL2a1 mRNA相對表達量低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；Cy低、高劑量組MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA相對表達量低于IL-1β組，ACAN mRNA、COL2a1 mRNA相對表達量高于IL-1β組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明IL-1β誘導處理SW1353細胞能提高MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA表達，抑制胞外基質ACAN mRNA、COL2a1 mRNA表達，且經Cy處理能逆轉這一現(xiàn)象。（見圖2）

圖2 各組SW1353 細胞MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA、ACAN mRNA、COL2a1 mRNA 相對表達量比較 （，n=3）

3.3 各組SW1353細胞lncRNA SNHG14 mRNA相對表達量比較 IL-1β組lncRNA SNHG14 mRNA表達水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；Cy低、高劑量組lncRNA SNHG14 mRNA表達水平低于IL-1β組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。表明IL-1β誘導處理SW1353細胞能提高lncRNA SNHG14 mRNA表達，且經Cy處理能逆轉這一現(xiàn)象。（見圖3）

圖3 各組SW1353 細胞lncRNA SNHG14 mRNA相對表達量比較 （，n=3）

3.4 各組SW1353細胞MMP-13蛋白相對表達量比較 IL-1β組MMP-13蛋白相對表達量高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Cy低、高劑量組MMP-13蛋白相對表達量低于IL-1β組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。表明經IL-1β誘導處理SW1353細胞能提高MMP-13蛋白表達水平，且經Cy處理能逆轉這一現(xiàn)象。（見圖4～5）

圖4 各組SW1353 細胞MMP-13、ACAN、COL2a1 蛋白表達Western blotting 圖

圖5 各組SW1353 細胞MMP-13、ACAN、COL2a1 蛋白相對表達量比較 （，n=3）

3.5 各組SW1353細胞外基質ACAN、COL2a1相對表達量比較 IL-1β組細胞外基質ACAN、COL2a1蛋白相對表達量低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Cy低、高劑量組細胞外基質ACAN、COL2a1蛋白相對表達量高于IL-1β組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。表明經IL-1β誘導處理SW1353細胞能降低細胞外基質ACAN、COL2a1蛋白表達水平，且經Cy處理能逆轉這一現(xiàn)象。（見圖4～5）

4 討論

Cy（木犀草素-7-0-葡萄糖苷）是廣泛存在于植物中的黃酮類化合物。Cy具有鄰二酚羥基的結構，使其能產生獨特的藥理作用[3]。Cy主要的功效包括抗炎、抗菌、清除自由基、抗氧化和抗腫瘤[10]。此外，研究[3]表明，較高濃度的Cy（25、50、75、100 μmol/mL）會對細胞產生一定的毒副作用，因此本研究采用CCK-8法檢測了不同濃度的Cy對SW1353細胞增殖的影響。實驗結果表明，Cy在30 μmol/mL時細胞活性有所下降，所以本研究選取10、20 μmol/mL的Cy作為后續(xù)實驗的處理濃度。

促炎因子的表達在骨關節(jié)炎中發(fā)揮著重要的作用，其中IL-1β是促炎性細胞因子，可以通過誘導軟骨基質降解酶[如基質金屬蛋白酶（MMPs）、血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶（ADAMTSs）]及其他分解代謝因子和前列腺素E2（PGE2）的上調而加速骨關節(jié)炎的發(fā)展[11-12]。本研究結果表明，經IL-1β誘導處理后，SW1353細胞MMP-13 mRNA、MMP-13蛋白及IL-6 mRNA表達水平顯著增高，但是在加入Cy后其表達水平明顯下降。結果表明，Cy可以抑制軟骨基質降解酶和相關炎癥因子的表達。

軟骨細胞外基質（ECM）的進行性和過度降解，是OA的主要特征之一[13-15]。其主要由Ⅱ型膠原（COL2a1）和蛋白聚糖（如聚集蛋白聚糖）組成；它們可為軟骨提供高度的結構完整性，并吸收壓縮力和沖擊力[16-17]。本研究結果表明，IL-1β誘導處理后，SW1353 細胞外基質COL2a1 mRNA、ACAN mRNA、COL2a1蛋白、ACAN蛋白表達水平顯著下調，但是在加入Cy后其表達量明顯上升。結果表明，Cy可以通過抑制軟骨細胞外基質的降解，發(fā)揮軟骨保護作用。

lncRNA是長度超過200個核苷酸的非編碼轉錄物，其異常表達與多種人類疾病有關。在骨關節(jié)炎的發(fā)展過程中，多種lncRNA參與了軟骨細胞外基質的降解和隨后的關節(jié)軟骨損傷[18]。lncRNA在調節(jié)OA的基因表達中具有重要作用[19]。研究表明，lncRNA SNHG14可通過靶向抑制miR-136-5p上調ROCK1表達[20-21]，從而促進MCAO/R誘導的神經損傷和炎癥反應[5]。lncRNA SNHG14在各種炎癥的發(fā)生發(fā)展中同樣有著重要的作用[22-24]。本研究結果表明，經IL-1β誘導處理后，SW1353細胞中l(wèi)ncRNA SNHG14的表達明顯上調，但經Cy處理后其lncRNA SNHG14的表達顯著下降。表明Cy可以通過抑制lncRNA SNHG14的表達來發(fā)揮減輕炎癥和軟骨保護的作用。

綜上所述，Cy能夠改善骨關節(jié)炎軟骨細胞的炎癥反應和細胞外基質降解，其作用機制可能是抑制lncRNA SNHG14表達。但本研究僅是體外細胞實驗，尚缺乏動物實驗的證據(jù)進行支持。這將是本研究下一步的研究方向，具體的作用機制也需要進一步的研究才能夠闡明。