■ 趙 娜 魏金濤 郭萬(wàn)正 樊啟文 黃 靜 陳 芳 金 楓 徐志宇

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)總站，北京 100125；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部資源循環(huán)利用技術(shù)與模式重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100125）

油菜（Brassica campestrisL.）是我國(guó)最主要的油料作物之一，但大量油菜秸稈作為農(nóng)業(yè)廢棄物被丟棄，既造成資源的浪費(fèi)也對(duì)環(huán)境產(chǎn)生壓力。油菜秸稈由于適口性差、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低、易霉變等原因，一直以來(lái)飼料化利用率低[1-4]。油菜秸稈中含有纖維素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等多種牛羊生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可部分替代常規(guī)粗飼料[5]，合理開(kāi)發(fā)利用油菜秸稈彌補(bǔ)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)飼草短缺的現(xiàn)狀是國(guó)情所需。目前，養(yǎng)殖業(yè)嘗試使用油菜秸稈作為飼料原料的改良途徑主要有發(fā)酵、青貯、氨化等，如王亮[6]用微生物處理油菜秸稈提高了錦江黃牛對(duì)其粗蛋白、能量和纖維的利用率。陳東等[7]將籽粒莧與油菜秸稈混合青貯，并加入糖蜜、乳酸菌、復(fù)合酶等，提高了其粗蛋白、可溶性碳水化合物含量及相對(duì)飼用價(jià)值。孟春花等[8]和張建麗等[9]采用氨化法降低油菜秸稈纖維含量、提高其粗蛋白質(zhì)含量及瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)氣量等，改善了湖羊?qū)τ筒私斩挼南寐?。王亦聞等[10]先進(jìn)行好氧發(fā)酵，再高溫蒸煮破壞油菜秸稈表皮纖維結(jié)構(gòu)，然后利用乳酸菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵微貯來(lái)提高油菜秸稈的飼用品質(zhì)。油菜秸稈發(fā)酵后營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)明顯改善，可部分替代玉米秸稈等粗飼料，提高動(dòng)物日增重和養(yǎng)分表觀消化率。但上述報(bào)道的經(jīng)處理后的油菜秸稈營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、動(dòng)物消化利用率差異較大。體外模擬瘤胃法通過(guò)模擬牛瘤胃消化環(huán)境、加入瘤胃液維持微生物多樣性等方式可達(dá)到還原瘤胃消化過(guò)程的目的，具有消除動(dòng)物個(gè)體間差異、成本低、高效率等優(yōu)點(diǎn)[11]。本試驗(yàn)采用高壓、酶菌協(xié)同發(fā)酵等不同處理方式提升油菜秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，采取體外模擬瘤胃法探究對(duì)其體外產(chǎn)氣、瘤胃發(fā)酵特性、瘤胃菌群結(jié)構(gòu)等的影響，評(píng)價(jià)其飼用價(jià)值，以期為油菜秸稈飼料化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

油菜秸稈：品種為中油雜11，籽實(shí)成熟期收獲，產(chǎn)地為湖北省咸寧市。

1.2 油菜秸稈的處理

粉碎油菜秸稈（A組）：油菜秸稈粉碎后過(guò)40目篩。

高壓處理油菜秸稈（B組）：將粉碎后過(guò)40目篩的油菜秸稈用BXM-60VE 立式高壓滅菌器在121 ℃0.22 MPa高壓處理30 min。

酶菌協(xié)同發(fā)酵油菜秸稈（C 組）：稱取粉碎后過(guò)40 目篩的油菜秸稈，加入0.5%糖蜜（廣西產(chǎn)甘蔗糖蜜）和4×106CFU/g 枯草芽孢桿菌（廣州市微元生物科技有限公司生產(chǎn)，下同）、4×104CFU/g 產(chǎn)阮假絲酵母，2×105CFU/g 地衣芽孢桿菌、4×105CFU/g 乳酸菌、2 000 U/g 纖維素酶（南寧龐博生物工程有限公司生產(chǎn)）；調(diào)節(jié)含水率為60%，混勻后用帶呼吸閥的PE 袋包裝，每袋裝500 g，室溫（28～32 ℃）堆放發(fā)酵，20 d采集樣品。

固態(tài)二次發(fā)酵油菜秸稈（D 組）：稱取粉碎后過(guò)40 目篩的油菜秸稈，加入0.2%米曲霉，調(diào)節(jié)含水率為60%并混勻后裝入玻璃瓶用報(bào)紙封口室溫放置5 d；之后加入0.5%糖蜜和4×106CFU/g 枯草芽孢桿菌、4×104CFU/g 酵母菌，2×105CFU/g 地衣芽孢桿菌、4×105CFU/g 乳酸菌；調(diào)節(jié)含水率為60%并混勻后用帶呼吸閥的PE袋包裝，每袋裝500 g，室溫（28～32 ℃）堆放發(fā)酵，15 d后采集樣品。

將采集的各組樣品經(jīng)65 ℃烘干、粉碎過(guò)40 目篩后按四分法取出約500 g樣品，裝入樣品袋中，密封干燥保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 體外產(chǎn)氣法評(píng)價(jià)不同加工處理油菜秸稈飼用價(jià)值

1.3.1 瘤胃液供體動(dòng)物

本試驗(yàn)的瘤胃液供體為3 頭裝有永久瘤胃瘺管、體重（600.0±25.0） kg 的成年黑安格斯閹牛，每日飼喂2 次，共計(jì)8 kg全混合日糧（日糧精粗比為5∶5，其中青貯玉米2.2 kg，麥秸1 kg，豆腐渣0.8 kg，混合精料4 kg），自由飲水。

1.3.2 體外發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作

按照隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將體外發(fā)酵試驗(yàn)分為5 組，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，其中空白組不添加底物，作為產(chǎn)氣量的校正；A、B、C、D 組分別以油菜秸稈、高壓處理油菜秸稈、酶菌協(xié)同發(fā)酵油菜秸稈、固態(tài)二次發(fā)酵油菜秸稈樣品為發(fā)酵底物。

瘤胃液于晨飼前1 h 內(nèi)采集，使用4 層紗布過(guò)濾混勻后39 ℃保溫。各組分別稱取粉碎過(guò)40目篩后的500 mg樣品裝于150 mL厭氧發(fā)酵瓶中，接種50 mL人工唾液[12]和25 mL瘤胃液，通入高純度氮?dú)夂罅⒓瓷w上膠塞，擰緊瓶蓋，連接“AGRS-Ⅲ型微生物發(fā)酵微量產(chǎn)氣全自動(dòng)記錄裝置與軟件系統(tǒng)”進(jìn)行39 ℃恒溫體外產(chǎn)氣培養(yǎng)，分別讀取發(fā)酵0、4、8、12、24、48、72 h氣體體積，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的體外產(chǎn)氣量，并計(jì)算累計(jì)凈產(chǎn)氣量。

體外發(fā)酵24、72 h 時(shí)采集發(fā)酵瓶中的發(fā)酵底物，測(cè)定發(fā)酵底物pH，然后將發(fā)酵瓶中的發(fā)酵底物離心，取1 mL 上清液加入1.5 mL 離心管中，用于測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸濃度；另取4 mL 上清液加入至5 mL 離心管中，用于測(cè)定氨態(tài)氮濃度。

采集發(fā)酵瓶中的72 h 發(fā)酵底物，采用16S 高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定發(fā)酵底物中菌群結(jié)構(gòu)。采用Illumina MiSeq 平臺(tái)，利用細(xì)菌16S rDNA 基因通用引物343F TACGGRAGGCAGCAG 和798R AGGGTATCTAATCCT，針對(duì)細(xì)菌16S rDNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行雙端測(cè)序。

另外同樣處理一批樣品，在體外培養(yǎng)48 h 后，將發(fā)酵瓶取出，迅速放入冰水浴中終止發(fā)酵，用氣密注射器抽取發(fā)酵瓶中的10 μL 氣體，立刻用氣相色譜儀檢測(cè)甲烷、氫氣、氧氮、二氧化碳等氣體成分；將發(fā)酵瓶中的消化殘?jiān)D(zhuǎn)入孔徑48 μm 的尼龍袋，封口、過(guò)濾并漂洗后置于65 ℃烘干，測(cè)定主要營(yíng)養(yǎng)成分的降解率。

1.3.3 體外產(chǎn)氣量及降解率計(jì)算

產(chǎn)氣量（mL）=某時(shí)間段內(nèi)瓶氣體產(chǎn)生量（mL）-對(duì)應(yīng)時(shí)間段內(nèi)空白瓶氣體產(chǎn)生量（mL）

累計(jì)凈產(chǎn)氣量（mL）=某時(shí)間段產(chǎn)氣量（mL）-對(duì)應(yīng)時(shí)間段3支空白瓶平均產(chǎn)氣量（mL）

產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算：

將不同樣品在不同時(shí)間點(diǎn)（發(fā)酵0、2、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、48、72 h）的產(chǎn)氣量帶入基于?rskov[13]產(chǎn)氣模型，根據(jù)非線性最小二乘法原理計(jì)算產(chǎn)氣參數(shù)a、b、c值。

式中：GP——t時(shí)刻的產(chǎn)氣量（mL）；

a——快速產(chǎn)氣部分（mL）；

b——慢速產(chǎn)氣部分（mL）；

c——慢速產(chǎn)氣部分的產(chǎn)氣速度（%/h）；

t——時(shí)間（h）。

某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體外降解率(%)=100×（底物質(zhì)量×某種營(yíng)養(yǎng)成分含量-殘?jiān)|(zhì)量×某種營(yíng)養(yǎng)成分含量）/（底物質(zhì)量×某種營(yíng)養(yǎng)成分含量）

1.4 檢測(cè)方法及飼用價(jià)值計(jì)算

干物質(zhì)含量的測(cè)定參照GB/T 6435—2014，粗灰分含量的測(cè)定參照GB/T 6438—2007，粗蛋白含量的測(cè)定參照GB/T 6432—2018，總能采用全自動(dòng)氧彈熱量計(jì)（Parr 6200，美國(guó)）測(cè)定，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維采用F-2000 全自動(dòng)纖維測(cè)定儀測(cè)定。發(fā)酵底物中氨態(tài)氮含量采用靛酚比色法；揮發(fā)性脂肪酸含量利用氣相色譜儀（Agilent 6890N GC system）測(cè)定；pH測(cè)定采用便攜式pH測(cè)量?jī)x。

油菜秸稈飼料分級(jí)指數(shù)（GI）參照以下公式[14]計(jì)算：

干物質(zhì)隨意采食量（DMI，%）=120/NDF

可消化干物質(zhì)（DDM，%）=88.9-0.779×ADF

總可消化養(yǎng)分（TDN，% DM）=-1.291×ADF+101.35

產(chǎn)乳凈能（NEL，MJ/kg）=[（1.044-0.011 9×ADF）/0.45]×4.184

飼料分級(jí)指數(shù)（GI，MJ/d）=NEL×DMI×CP/NDF

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.24軟件NLIN程序確定指數(shù)模型中a、b、c值等參數(shù)；試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016 初步整理后進(jìn)行單因素方差分析并采用鄧肯氏法里德多重比較。以P＜0.05為差異顯著性判斷的標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)油菜秸稈主要營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表1可知，油菜秸稈（A組）總能值為17.94 MJ/kg、粗蛋白含量5.30%、粗灰分含量7.06%、中性洗滌纖維含量73.36%、酸性洗滌纖維含量52.29%；與A 組相比，B 組總能、粗蛋白、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）；C 組和D 組的總能、粗蛋白均顯著提高（P＜0.05），中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量顯著下降（P＜0.05）；C 組和D 組間總能、粗蛋白含量差異不顯著（P＞0.05），D 組的中性洗滌纖維含量和酸性洗滌纖維含量顯著低于C 組（P＜0.05）；C、D 組飼草分級(jí)指數(shù)顯著高于A、B 組（P＜0.05），且D組顯著高于C組（P＜0.05）。

表1 不同處理的油菜秸稈主要營(yíng)養(yǎng)成分變化（絕干物質(zhì)基礎(chǔ)）

2.2 不同處理對(duì)油菜秸稈主要營(yíng)養(yǎng)成分體外降解率的影響

由表2 可知，與A 組相比，B 組酸性洗滌纖維體外降解率顯著提升（P＜0.05），干物質(zhì)、中性洗滌纖維體外降解率并未顯著提高（P＞0.05），但是B 組粗蛋白的體外降解率僅為25.34%，顯著低于其他組（P＜0.05）；C 組和D 組干物質(zhì)、粗蛋白、酸性洗滌纖維體外降解率顯著高于A 組和B 組（P＜0.05)，B、C、D 組中性洗滌纖維體外降解率顯著高于A 組（P＜0.05），其中C 組干物質(zhì)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維體外降解率分別比A 組提高了55.29%、43.20%、256.62%；D 組的粗蛋白體外降解率顯著高于C 組（P＜0.05），達(dá)到79.31%，干物質(zhì)的降解率低于C 組（P＜0.05）。

表2 不同處理油菜秸稈主要營(yíng)養(yǎng)成分的48 h體外降解率（%）

2.3 不同處理對(duì)油菜秸稈體外產(chǎn)氣和氣體成分的影響

由表3 可知，4 個(gè)處理組的油菜秸稈0～72 h 體外產(chǎn)氣過(guò)程中，產(chǎn)氣量變化趨勢(shì)基本相同，即隨著體外發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組產(chǎn)氣量逐漸上升，在48 h基本達(dá)到了產(chǎn)氣平衡狀態(tài)。其中D 組的12、24、36、48、72 h 體外累計(jì)產(chǎn)氣量顯著低于其他組（P＜0.05）；12～72 h 內(nèi)同一時(shí)間點(diǎn)，A、B、C 組的體外累計(jì)產(chǎn)氣量差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 不同處理油菜秸稈的體外累計(jì)產(chǎn)氣量（mL）

由表4 可知，4 組間快速產(chǎn)氣部分、產(chǎn)氣速度常數(shù)差異不顯著（P＞0.05）；A 組和B 組間快速產(chǎn)氣部分、慢速產(chǎn)氣部分、潛在總產(chǎn)氣量差異不顯著（P＞0.05）；C 組慢速產(chǎn)氣部分、潛在總產(chǎn)氣量高于其他組（P＜0.05），D 組慢速產(chǎn)氣部分、潛在總產(chǎn)氣量低于其他組（P＜0.05）。

表4 不同處理油菜秸稈的體外產(chǎn)氣參數(shù)

由表5 可知，體外發(fā)酵48 h C 組的甲烷含量高于其他組（P＜0.05），其他各組間差異不顯著（P＞0.05）；A組和C 組的體外產(chǎn)氣二氧化碳占比高于B 組和D 組（P＜0.05）；4 個(gè)處理組氧氮含量差異顯著（P＜0.05），且D組＞B組＞A組＞C組。

2.4 不同處理對(duì)油菜秸稈體外發(fā)酵參數(shù)的影響

由表6、表7 可知，不同處理油菜秸稈24 h 體外發(fā)酵底物總揮發(fā)性脂肪酸濃度為D 組＞B 組＞C 組＞A組，且4 組間差異顯著（P＜0.05）。72 h 體外發(fā)酵底物中總揮發(fā)性脂肪酸濃度表現(xiàn)A、B 組差異不顯著，但顯著高于C、D 組（P＜0.05）。4 個(gè)處理組油菜秸稈經(jīng)體外發(fā)酵24、72 h 后產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸主要為乙酸、丙酸，且乙酸/丙酸差異不顯著。不同處理油菜秸稈的體外發(fā)酵底物24、72 h pH 組間差異不顯著（P＞0.05），但72 h 時(shí)pH 均略微上升。不同處理油菜秸稈24 h 體外發(fā)酵底物D 組氨態(tài)氮濃度為25.17 mg/100 mL，顯著高于其他組（P＜0.05）；與24 h相比，72 h 體外發(fā)酵底物中氨態(tài)氮濃度除D 組外，均有所上升。

表6 不同處理油菜秸稈的24 h體外發(fā)酵參數(shù)

表7 不同處理油菜秸稈的72 h體外發(fā)酵參數(shù)

2.5 不同處理對(duì)油菜秸稈體外發(fā)酵底物中菌群結(jié)構(gòu)的影響

本試驗(yàn)采集了4個(gè)組的牛瘤胃體外發(fā)酵底物共計(jì)12個(gè)樣品。測(cè)序下機(jī)原始測(cè)序數(shù)據(jù)（raw reads）數(shù)據(jù)量分布范圍為79 063～81 787，在質(zhì)控之后的高質(zhì)量測(cè)序標(biāo)簽（clean tags）數(shù)據(jù)量分布范圍為32 986～50 949，clean tags經(jīng)過(guò)去除嵌合體得到valid tags（即最終用于分析的數(shù)據(jù)）數(shù)據(jù)量分布范圍為29 623～46 130，各樣本去噪擴(kuò)增單堿基精度的代表序列（ASV）個(gè)數(shù)分布范圍為503～932。

韋恩圖（見(jiàn)圖1）反映樣品之間共有、特有的ASVs數(shù)目，結(jié)合ASVs 所代表的物種，樣品進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)，采用ANOVA 算法計(jì)算出差異ASV 個(gè)數(shù)為97 個(gè)，差異門(mén)個(gè)數(shù)為3 個(gè)，差異屬個(gè)數(shù)為23 個(gè)。ASVs 數(shù)目順序?yàn)锳 組＞B 組＞D 組＞C 組，不同處理的油菜秸稈改變了瘤胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)。圖2 中樣品稀釋曲線中每條曲線代表一個(gè)樣本，在本試驗(yàn)的測(cè)序深度下，檢測(cè)到的ASVs 數(shù)目不再增加，可以覆蓋樣品中的大多數(shù)微生物。

圖1 不同處理組間瘤胃菌群ASVs 韋恩圖

圖2 樣品多樣性指數(shù)稀釋曲線

由表8 可知，A 組Chao1 指數(shù)顯著高于D 組（P＜0.05），其他組間差異不顯著（P＞0.05）；物種分布越均勻，香農(nóng)指數(shù)數(shù)值越大，A 組香農(nóng)指數(shù)顯著高于C 組（P＜0.05），A、B 組和D 組香農(nóng)指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），B、C 組和D 組香農(nóng)指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）；辛普森指數(shù)越高，表明群落多樣性越高，A、B 組和D組辛普森指數(shù)顯著高于C組（P＜0.05）。

表8 不同處理油菜秸稈瘤胃微生物菌群Alpha多樣性指數(shù)分析

采用主坐標(biāo)分析(PCoA)方法比較各組瘤胃微生物Beta 多樣性。圖3 為不同處理組瘤胃菌群樣本分別在坐標(biāo)系的不同空間區(qū)域分布，主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示，各組瘤胃微生物區(qū)系存在差異。

圖3 不同處理油菜秸稈瘤胃微生物菌群PCoA (2D)分析

門(mén)水平菌群組成和相對(duì)豐度見(jiàn)表9。不同處理油菜秸稈在牛瘤胃體外發(fā)酵底物樣品中共發(fā)現(xiàn)14 個(gè)菌門(mén)，其中擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)在各組中均為豐度最高的三大菌門(mén)，各組瘤胃液中三大菌門(mén)的相對(duì)豐度總和都超過(guò)94%。A 組擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度(45.60%)顯著高于其他組（P＜0.05），C 組擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度（34.77%）顯著低于其他組（P＜0.05）；A 組和D 組的厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度（34.99%、32.50%）顯著高于B、C 組（P＜0.05）；C 組變形菌門(mén)的相對(duì)豐度為38.51%，A 組（14.36%）最低，各組間差異顯著（P＜0.05）。與A 組相比，B 組及C 組牛瘤胃液中擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度顯著降低，變形菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著提高（P＜0.05）。可見(jiàn)，油菜秸稈經(jīng)處理后，可以顯著提高牛瘤胃液中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)變形菌門(mén)的相對(duì)豐度，顯著降低了擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度。

表9 不同處理油菜秸稈對(duì)牛瘤胃微生物門(mén)水平相對(duì)豐度的影響（%）

屬水平菌群組成和相對(duì)豐度見(jiàn)表10。不同處理油菜秸稈在牛瘤胃體外發(fā)酵底物中共發(fā)現(xiàn)199 個(gè)屬，其中相對(duì)豐度排名前10 的分別為理研菌科（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、氣單胞菌屬（Comamonas）、F082 屬、拉氏梭菌（Lachnoclostridium）、真桿菌-產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌（[Eubacterium]_coprostanoligenes_group）、克里斯滕森菌科_R-7 群（Hristensenellaceae_R-7_group）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、Muribaculaceae屬、纖維桿菌屬（Fibrobacter）、普氏菌屬（Prevotella）。A 組理研菌科（Rikenellaceae_RC9_gut_group）的豐度顯著高于C、D 組（P＜0.05），與B 組差異不顯著（P＞0.05）；A 組氣單胞菌屬豐度顯著低于其他組（P＜0.05）。

表10 不同處理油菜秸稈對(duì)牛瘤胃微生物屬水平相對(duì)豐度的影響（%）

3 討論

3.1 不同處理對(duì)油菜秸稈主要營(yíng)養(yǎng)成分及體外降解率的影響

本試驗(yàn)采用的油菜秸稈樣品與黎力之等[15]從江西、湖北采集的油菜秸稈總能、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗灰分含量基本接近。油菜秸稈的總能、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量高，粗蛋白含量低，其較高的木質(zhì)素、纖維素含量導(dǎo)致動(dòng)物及微生物難以直接有效利用。飼料中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維瘤胃降解率反映了粗飼料纖維在瘤胃內(nèi)消化的難易程度，本試驗(yàn)中油菜秸稈的干物質(zhì)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的體外降解率均為最低。

物理法、化學(xué)法以及生物處理等方法常被用來(lái)提高秸稈的適口性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和消化率[16]。本試驗(yàn)中，油菜秸稈經(jīng)高壓處理后主要成分含量沒(méi)有顯著變化；但高溫高壓可能改變了油菜秸稈的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的空間鏈接狀態(tài)[17]，使得其體外酸性洗滌纖維降解率顯著提升；同時(shí)高溫高壓條件可能使油菜秸稈的化學(xué)成分間發(fā)生了美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生難以消化的聚合物，導(dǎo)致其體外粗蛋白降解率較低。

學(xué)者們探索了多種微生物、酶等對(duì)秸稈的生物預(yù)處理效果。真菌菌絲體可破壞秸稈表層結(jié)構(gòu)中難降解的木質(zhì)素蠟質(zhì)層[18]，龔劍明等[19]采用不同真菌發(fā)酵油菜秸稈，纖維得到降解，但同時(shí)導(dǎo)致了有機(jī)物的浪費(fèi)。李立波等[20]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可以分泌纖維素胞外酶降解木質(zhì)纖維素、增加蛋白質(zhì)含量、提高秸稈的利用率。纖維素酶可增大木質(zhì)纖維素的孔隙，降低其聚合度，提高反芻動(dòng)物對(duì)粗飼料的消化率[21]?；炀l(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白、降解秸稈的效率高于單菌[22]。好氧固態(tài)發(fā)酵目前在秸稈品質(zhì)改良中占據(jù)主導(dǎo)地位。為提高秸稈飼料預(yù)處理效率，多種方法經(jīng)常聯(lián)用。本試驗(yàn)采用好氧、混菌等多方法聯(lián)用的酶菌協(xié)同發(fā)酵及固態(tài)二次發(fā)酵處理油菜秸稈。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，油菜秸稈經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵、固態(tài)二次發(fā)酵后粗蛋白含量均顯著提高，這一方面可能由于發(fā)酵過(guò)程中添加的產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌等微生物利用了發(fā)酵底物中的氮元素，產(chǎn)生了菌體蛋白[23-25]；另一方面可能是發(fā)酵過(guò)程微生物活動(dòng)消耗了部分有機(jī)物質(zhì)等造成發(fā)酵底物濃縮等原因?qū)е碌?。油菜秸稈?jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵、固態(tài)二次發(fā)酵后中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量顯著下降，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的體外降解率也得到大幅提升，且酶菌協(xié)同發(fā)酵法處理后的油菜秸稈主要營(yíng)養(yǎng)成分體外降解率較固態(tài)二次發(fā)酵法提高更為顯著，這說(shuō)明油菜秸稈經(jīng)酶解發(fā)酵處理后，纖維組成有所改變，更易為反芻動(dòng)物消化利用。

3.2 不同處理對(duì)油菜秸稈體外產(chǎn)氣量和氣體成分的影響

體外產(chǎn)氣法通過(guò)模擬反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行粗飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)，產(chǎn)氣量可以反映飼料原料被瘤胃微生物消化利用的情況[26]。?rskov[27]采用體外產(chǎn)氣技術(shù)研究不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃的降解時(shí)發(fā)現(xiàn)，體外產(chǎn)氣量與反芻動(dòng)物干物質(zhì)采食量、生長(zhǎng)速度高度相關(guān)。據(jù)馬紹楠等[28]報(bào)道，飼料在肉羊瘤胃中的干物質(zhì)降解率與體外產(chǎn)氣量之間存在一定的正相關(guān)。秸稈的木質(zhì)化程度較高、碳水化合物含量少，決定其產(chǎn)氣量整體偏低。本試驗(yàn)中，不同處理的油菜秸稈體外干物質(zhì)降解率不同，同時(shí)在相應(yīng)的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)氣量與產(chǎn)氣率也有差異；酶菌協(xié)同發(fā)酵處理組油菜秸稈的干物質(zhì)降解率和總產(chǎn)氣量均高于其他組；與上述前人研究結(jié)果不同的是，本試驗(yàn)中固態(tài)二次發(fā)酵組油菜秸稈的干物質(zhì)降解率比油菜秸稈、高壓油菜秸稈組高，但其體外累計(jì)產(chǎn)氣量和潛在總產(chǎn)氣量卻偏低，這可能因?yàn)楣虘B(tài)二次發(fā)酵過(guò)程微生物發(fā)酵利用了更多的碳水化合物，導(dǎo)致其在瘤胃消化時(shí)微生物活性降低，產(chǎn)氣量減少。

不同處理組油菜秸稈體外產(chǎn)氣氣體成分略有差異。二氧化碳是主要溫室氣體，甲烷是強(qiáng)效溫室氣體，油菜秸稈由于粗纖維含量高，瘤胃發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的二氧化碳、甲烷較多，且大部分通過(guò)噯氣排出體外，所以在使用油菜秸稈配制日糧時(shí)要營(yíng)養(yǎng)均衡，以降低溫室氣體的排放。

3.3 不同處理對(duì)油菜秸稈體外發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸主要由微生物發(fā)酵碳水化合物和氨基酸等產(chǎn)生，經(jīng)瘤胃上皮吸收后通過(guò)血液循環(huán)輸送至機(jī)體各部，可為反芻動(dòng)物提供70%～80%的總能量。瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸的含量和組成比例是分析瘤胃發(fā)酵模式的指標(biāo)，本試驗(yàn)中4 組油菜秸稈經(jīng)體外發(fā)酵后主要產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸均為乙酸和丙酸，且乙酸/丙酸差異不顯著，說(shuō)明4 種不同處理油菜秸稈在瘤胃中的發(fā)酵模式是基本一致的。

在瘤胃內(nèi)粗蛋白一部分可快速降解成氨基酸和小肽，另外在微生物作用下約有50%會(huì)降解為氨。氨是瘤胃內(nèi)重要的氮供體，可被瘤胃微生物直接利用，也可被瘤胃壁吸收[29]。最適合微生物生長(zhǎng)的瘤胃氨態(tài)氮臨界濃度6.0～30.0 mg/dL，瘤胃液內(nèi)氨態(tài)氮濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致瘤胃微生物生長(zhǎng)緩慢。本試驗(yàn)中，4 組油菜秸稈體外發(fā)酵底物中氨態(tài)氮含量雖有差異，但是均處于最適宜瘤胃微生物生長(zhǎng)的濃度；高壓油菜秸稈的粗蛋白體外降解率低，同時(shí)該組油菜秸稈體外發(fā)酵產(chǎn)生的氨態(tài)氮濃度也最低，這兩者之間可能存在關(guān)聯(lián)性。體外發(fā)酵底物中的氨態(tài)氮濃度24 h 時(shí)固態(tài)二次發(fā)酵組顯著高于其他組，72 h時(shí)除固態(tài)二次發(fā)酵組外均有所上升，這可能是瘤胃消化過(guò)程中微生物利用了固態(tài)二次發(fā)酵油菜秸稈組的大部分氨。

3.4 不同處理對(duì)油菜秸稈體外發(fā)酵底物中菌群結(jié)構(gòu)的影響

反芻動(dòng)物主要靠瘤胃中的細(xì)菌、真菌和原蟲(chóng)等分解利用纖維素物質(zhì)。本試驗(yàn)中牛瘤胃體外發(fā)酵底物中共發(fā)現(xiàn)14 個(gè)菌門(mén)，其中擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)在各組中均為豐度最高的三大菌門(mén)。吳瓊等[30]報(bào)道，安格斯牛瘤胃微生物以擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明體外模擬瘤胃系統(tǒng)內(nèi)的微生物群落維持了基本正常結(jié)構(gòu)。

日糧的營(yíng)養(yǎng)成分顯著影響瘤胃微生物數(shù)量。本試驗(yàn)中不同處理導(dǎo)致油菜秸稈中營(yíng)養(yǎng)成分改變，進(jìn)而引起牛瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。油菜秸稈組Alpha 多樣性指數(shù)Chao1 指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、Simpson 指數(shù)較高，說(shuō)明油菜秸稈經(jīng)高壓、酶菌協(xié)同發(fā)酵、固態(tài)二次發(fā)酵處理后可能會(huì)導(dǎo)致瘤胃微生物多樣性降低。在屬水平上，各組發(fā)酵底物菌群中均以理研菌科Rikenellaceae_RC9_gut_group 豐度最高。Cheng 等[31]報(bào)道，Rikenellaceae_RC9_gut_group 與丁酸、異丁酸等揮發(fā)性脂肪酸含量呈顯著正相關(guān)性，可能通過(guò)影響揮發(fā)性脂肪酸的濃度來(lái)調(diào)節(jié)灘羊肉脂肪沉積。但本試驗(yàn)中各組瘤胃發(fā)酵底物的Rikenellaceae_RC9_gut_group 相對(duì)豐度與丁酸、異丁酸含量并未呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)。叢毛單胞菌屬是各組瘤胃發(fā)酵底物相對(duì)豐度相對(duì)較高的微生物，叢毛單胞菌屬可利用木質(zhì)素[32]，但油菜秸稈組叢毛單胞菌屬豐度顯著低于其他組，可能與油菜秸稈中木質(zhì)素難以利用有關(guān)，其他組油菜秸稈的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)可能得到了改變，更容易被叢毛單胞菌屬分解利用，從而引起其豐度的增加。普雷沃氏菌屬等被認(rèn)為是瘤胃中非纖維性碳水化合物的主要降解者，本試驗(yàn)中發(fā)酵底物中非纖維碳水化合物含量低，這可能導(dǎo)致了各組發(fā)酵底物中普雷沃氏菌屬微生物豐度較低。

4 結(jié)論

酶菌協(xié)同發(fā)酵及固態(tài)二次發(fā)酵處理均能明顯改變油菜秸稈營(yíng)養(yǎng)成分，但酶菌協(xié)同發(fā)酵更能提升油菜秸稈的營(yíng)養(yǎng)成分體外降解率、體外累計(jì)產(chǎn)氣量等指標(biāo)，在牛瘤胃中發(fā)酵效果較好。