■ 寇宇寧 徐登輝 林瑞麒 童 陳 馮孟陽 李 蕊 張佳欣 于蕾妍

（青島農(nóng)業(yè)大學海都學院，山東萊陽 265200）

咳嗽是機體呼吸系統(tǒng)對抗有害物質(zhì)的一種自我防御機制[1]，當外界有害物質(zhì)刺激呼吸道黏膜的感覺神經(jīng)纖維末梢時，會引發(fā)咳嗽反射，將有害物質(zhì)排出體外?？人缘耐瑫r也會造成呼吸道損傷，積累活性氧和自由基[2]，從而引發(fā)炎癥反應[3]。中醫(yī)認為咳嗽的原因是外邪襲肺和內(nèi)邪干肺[4]。而梨膏在中醫(yī)上記載有清熱潤肺、養(yǎng)陰益胃之功效，常用于治療外邪襲肺導致的咳嗽[5]。

古法熬制萊陽梨膏可以最大程度保留其抗氧化成分，具有生津潤肺、化痰止咳的作用。梨膏的主要成分為原兒茶酸、綠原酸、熊果苷、阿魏酸、沒食子酸和兒茶素等6 種酚類化合物[6]。酚類化合物解離的氫離子易與自由基的電子結(jié)合，清除自由基，減少氧化應激[7]。此外，熊果苷還可以抑制炎性因子的生成[8]，從而實現(xiàn)抗炎作用。

多殺性巴氏桿菌是導致豬肺疫和豬萎縮性鼻炎等呼吸道疾病的主要病原體，對養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展構(gòu)成嚴重威脅。研究表明，萊陽梨膏的主要成分酚類化合物對多殺性巴氏桿菌表現(xiàn)出良好的抑菌活性[9]，將其添加于動物飼料中，可以通過抑菌及鎮(zhèn)咳作用來緩解癥狀，促進康復，達到替抗的效果。此外，天然植物制品還可以減少氧化應激、降低動物消化和生殖系統(tǒng)的疾病發(fā)病率[10]，改善動物機體因氧化應激導致的繁殖障礙和生長性能下降的問題[11]。將天然植物制品用于飼料添加劑，具有綠色、健康、無害的特點，可實現(xiàn)健康養(yǎng)殖。因此，試驗旨在探究不同劑量下萊陽梨膏對咳嗽模型鼠的改善作用效果，為養(yǎng)殖醫(yī)藥的健康發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

無特定疫?。⊿PF）昆明種小白鼠，體重36～40 g，雌雄各半，由青島大任富城畜牧有限公司提供，合格證號：syxk（魯）2020—0009。

1.1.2 試驗藥品

25%氨水（分析純，AR）、冰醋酸（分析純，AR）：萊陽市康德化工有限公司；生理鹽水，山東科倫藥業(yè)有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（A001-2-1）、過氧化物酶（POD）試劑盒（A084-1-1）、丙二醛（MDA）試 劑 盒（TBA 法）（A003-1-2）、谷 胱 甘 肽（GSH）試劑盒（A006-1-1），南京建成生物工程研究所有限公司；萊陽梨膏：市售。

1.1.3 試驗儀器

SQP 電子分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇科析儀器有限公司；TGM-16M 臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；超聲波霧化器，海爾集團公司；752 型紫外可見分光光度計，上海舜宇橫平科學儀器有限公司；旋渦混勻儀，湖南比克曼生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模（濃氨水引咳法）

小鼠禁食禁水8 h，置于玻璃鐘罩下，超聲波霧化器噴霧25%氨水15 s，立即取出小鼠。記錄2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)及潛伏期，2 min 內(nèi)咳嗽大于10 次者為合格[12]。造模后自由飲水采食，適應期2 d。

1.2.2 分組與給藥

選取小鼠50 只，隨機分為高劑量（12 g/kg 萊陽梨膏）、中劑量（6 g/kg 萊陽梨膏）組和低劑量（3 g/kg萊陽梨膏）組，枸櫞酸噴托維林陽性組（0.01 g/kg）以及空白對照組（生理鹽水），每組10 只。每日按0.2 mL/10 g分別灌胃給藥，連續(xù)給藥10 d。

1.2.3 敏感性測定

每日給藥前禁食禁水8 h。于末次給藥1 h后，按

1.2.1 所述造模方法引咳，記錄2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)及潛伏期（注：小鼠咳嗽的表現(xiàn)為頭向前伸，嘴長大，腹肌強烈收縮，可聽見輕微咳嗽聲；潛伏期是指從開始噴霧至產(chǎn)生咳嗽的時間[13]）。

1.2.4 小鼠血清SOD水平測定

稱取小鼠體重（g），清理小鼠眼球周圍毛發(fā)，采用無麻醉眼球取血法收集各組小鼠的全血，將收集好的血液樣本4 ℃冷藏靜置1 h 后，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，取血清進行SOD 水平測定。操作方法均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.5 小鼠肺臟組織丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量與過氧化物酶（POD）活性的測定

眼球取血完畢后，將小鼠浸泡消毒，無菌操作立即取出肺臟，切取適宜的重量，置玻璃組織勻漿器中，按1∶9 的比例加入9 倍體積的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.2）進行研磨，制成10%肺臟組織勻漿液。取勻漿液3 500 r/min 離心15 min，取上清液進行MDA、GSH 含量與POD 活性的測定。操作方法均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 小鼠脾臟指數(shù)測定

按照1.2.5 的操作取出脾臟，稱重（g），計算脾臟指數(shù)。

脾臟指數(shù)（SI）=脾臟重量（g）×1 000/體重（g）

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

試驗采用SPSS 27.0 進行單因素方差分析（oneway ANOVA），Duncan’s 法進行各組間差異的多重比較，采用Origin 2022 軟件繪圖（美國OriginLab 公司），計量資料以“平均值±標準差（）”表示。P＜0.05 為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 萊陽梨膏對濃氨水引咳模型小鼠的鎮(zhèn)咳作用

如圖1 所示，與空白對照組相比，高、中劑量組均可顯著延長小鼠的咳嗽潛伏期（P＜0.05），而低劑量組差異不顯著（P＞0.05）；與陽性對照組相比，高劑量組潛伏期較短，具有顯著性差異（P＜0.05）。

與空白對照組相比，高、中劑量組均可顯著減少小鼠2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)（P＜0.05），低劑量組有一定鎮(zhèn)咳作用，但不具有顯著差異（P＞0.05）。與陽性對照組相比較，高劑量組咳嗽次數(shù)相近，且無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 萊陽梨膏對小鼠血清SOD、肺臟組織POD 活性的影響

如圖2 所示，與空白對照組相比，高、中、低劑量組均可提高SOD、POD 活性，且高劑量組具有顯著差異（P＜0.05）。圖3、圖4 表明，高劑量組SOD、POD 提高率分別為45.36%、7.78%。

圖2 萊陽梨膏對小鼠血清SOD、肺臟組織POD活性的影響

圖3 萊陽梨膏對小鼠血清SOD的影響

圖4 萊陽梨膏對小鼠肺臟組織POD的影響

與陽性對照組相比，高劑量組POD 活性與其相近，SOD 活性表現(xiàn)出更優(yōu)異的效果，不具有顯著差異（P＞0.05）。

試驗表明適宜濃度的萊陽梨膏能提高SOD、POD活性，對修復細胞的損傷有一定的作用，且在提高SOD 活性方面表現(xiàn)出優(yōu)越性，具有超過陽性對照組的效果。

2.3 萊陽梨膏對小鼠肺臟組織MDA、GSH含量的影響

如圖5 所示，與空白對照組相比，高、中劑量組均可顯著提高小鼠肺臟組織GSH含量，高劑量組可顯著降低MDA 含量（P＜0.05）。低劑量組也具有相同效果，但與空白對照組相比，MDA、GSH含量無顯著差異（P＞0.05）。圖6、圖7 表明，高劑量組GSH 提高率、MDA降低率分別為120.62%、24.38%。

圖5 萊陽梨膏對小鼠肺臟組織MDA、GSH含量的影響

圖6 萊陽梨膏對小鼠肺臟組織GSH的影響

2.4 萊陽梨膏對小鼠脾臟指數(shù)的影響

高劑量組小鼠肺臟組織GSH 含量略低于陽性對照組，MDA 含量略高于陽性對照組，與鎮(zhèn)咳藥效果相近，且均無顯著差異（P＞0.05）。

試驗表明萊陽梨膏可提高GSH 含量，降低MDA含量，從而增強機體對氧化應激的抵抗能力并修復細胞損傷。

如圖8 所示，高、中、低劑量組脾臟指數(shù)均高于空白對照組，且與空白對照組相比，高劑量組具有顯著差異（P＜0.05），低、中劑量組不具有顯著差異（P＞0.05）。因此，適宜濃度的萊陽梨膏可促進小鼠脾臟的生長，提高小鼠的免疫能力。

3 討論

3.1 萊陽梨膏對咳嗽模型鼠鎮(zhèn)咳作用的影響

小鼠通過氨水引咳的方法造模，氨水經(jīng)超聲霧化后進入小鼠的呼吸道 ，對呼吸道痛覺神經(jīng)末梢產(chǎn)生刺激，刺激傳到咳嗽中樞引起咳嗽反應[14]，同時會對小鼠肺部造成急性損傷[15]。經(jīng)過10 d 的萊陽梨膏灌胃，與空白對照組比較，高、中、低劑量組均可使小鼠咳嗽次數(shù)減少、咳嗽潛伏期延長，且高劑量組差異顯著。同時在減少咳嗽次數(shù)方面，高劑量組與陽性對照組極為相近。目前市面上鎮(zhèn)咳藥物的種類繁多，但都存在著難以避免的副作用。例如，可待因、右美沙芬和氯哌斯汀等[16]，作為依賴性中樞鎮(zhèn)咳藥物，常常帶來成癮和神經(jīng)系統(tǒng)損害等副作用。

試驗發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的萊陽梨膏具有良好的鎮(zhèn)咳效果，萊陽梨膏的鎮(zhèn)咳效果與常用鎮(zhèn)咳藥物相似，且沒有鎮(zhèn)咳藥物的副作用。同時還具有滋陰潤肺、清熱瀉火功效。

Li 等[17]在古法熬制梨膏過程中產(chǎn)生了N-（1-脫氧-D-果糖-1-基）-天冬氨酸（Fru-ASP），發(fā)現(xiàn)Fru-ASP 可以通過下調(diào)炎性介質(zhì)，減輕肺水腫來緩解小鼠急性肺損傷，并減少小鼠咳嗽次數(shù)。另外，Alsharif等[18]發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸可以通過抑制高遷移率族蛋白B1（Hmg B1）依賴的NF-κB 信號通路抑制小鼠炎癥反應，從而減輕肺損傷。由此推斷，萊陽梨膏的鎮(zhèn)咳效果可能與Fru-ASP 及原兒茶酸均可緩解肺損傷的作用有關(guān)。

Ahmet 等[19]研究表明，富含酚酸、類黃酮等酚類化合物的天竺葵提取物能夠緩解犢牛因呼吸道疾病引起的咳嗽、發(fā)熱等癥狀。萊陽梨膏也是一種含有豐富酚類化合物的物質(zhì)，且在小鼠試驗中表現(xiàn)出鎮(zhèn)咳的效果。因此，萊陽梨膏在畜牧動物生產(chǎn)方面的潛在作用值得進一步研究探索。

3.2 萊陽梨膏對咳嗽模型鼠抗氧化能力的影響

自由基是一類含有自由電子的化學物質(zhì)，常見的自由基包括：超氧負離子（O2-·）、過氧化氫（H2O2）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）等。主要由機體氧化性損傷產(chǎn)生，自由基會攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA），不可逆地破壞生物膜[20]。另外，MDA 易進入組織與蛋白質(zhì)、核酸形成共價鍵，導致酶和多肽等以氨基酸為結(jié)構(gòu)基礎的活性物質(zhì)遭到破壞，改變細胞的結(jié)構(gòu)和功能[21]。故機體中MDA 含量可以側(cè)面反應過氧化物的含量和機體損傷程度[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，服用不同濃度梨膏后，小鼠肺臟組織MDA 含量顯著下降，這說明梨膏具有保護肺臟免受氨水誘導的氧化損傷的能力。為對抗自由基的攻擊，小鼠體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生SOD、POD 和GSH，分別能夠清除超氧負離子、催化H2O2的分解和作為自由基清除劑[23]，起到減輕機體氧化應激的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，服用不同濃度梨膏后，小鼠血清SOD 活性、肺臟組織POD、GSH 含量顯著上升。這可能與梨膏中的酚類化合物有關(guān)。POD 和SOD 還能通過協(xié)同作用[24]共同提高機體的抗氧化能力。

Keap1-Nrf2 與抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)綠原酸可以通過下調(diào)Keap1 的表達水平來激活Nrf2/ARE 信號通路，該信號通路會上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶（如SOD、GSH）的mRNA 的表達水平，從而抑制氧化應激。Lende 等[26]的研究表明，原兒茶酸對于卡拉膠引起小鼠水腫導致的氧化應激有良好的減緩效果，其中高劑量原兒茶酸可以使SOD、GSH 和過氧化氫酶（CAT）活性明顯上升。因梨膏的主要成分包含綠原酸和原兒茶酸等物質(zhì)，由此可推斷，萊陽梨膏的抗氧化能力可能是多種有效成分共同作用的結(jié)果。

3.3 萊陽梨膏對咳嗽模型鼠免疫能力的影響

脾臟是機體最大的免疫器官，淋巴細胞的增殖、免疫器官的增重都可以反應免疫能力[27]。Chen 等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，黃梨的提取物（多糖）對免疫抑制小鼠的免疫器官發(fā)育有促進作用，從而分泌更多的腫瘤壞死因子α（TNF-α）和γ干擾素（IFN-γ）等免疫因子，增強免疫能力。此外，李夢云等[29]研究表明，刺梨提取物（多酚、黃酮等）也可以達到提高脾臟指數(shù)的效果。本試驗顯示，服用萊陽梨膏的高劑量組小鼠脾臟指數(shù)相比空白對照組顯著升高，這表明梨膏具有一定的免疫刺激活性，可以提升免疫器官的功能，可能是梨屬植物共同的活性成分的作用（如多糖、多酚類、總?cè)频任镔|(zhì)）[30]。

4 結(jié)論

本研究探討了不同濃度梨膏對咳嗽小鼠的鎮(zhèn)咳效果及其抗氧化能力。結(jié)果顯示，梨膏能夠顯著降低小鼠咳嗽次數(shù)，延長咳嗽潛伏期，且與常用鎮(zhèn)咳藥相近。梨膏還能提高小鼠血漿SOD活性、肺臟組織POD活性和GSH 含量，降低肺臟組織MDA 的含量，表明梨膏具有抗氧化作用，能夠減輕氧化應激，還能增加小鼠脾臟指數(shù)。綜上所述，高劑量（12 g/kg）梨膏是一種具有潛力的醫(yī)藥健康用藥，值得深入探究其功效和機理。