徐 晨，白莉圓，趙 帥，孟勤燕，荊 雄，張永利，2*

（1.陜西西鳳酒股份有限公司，陜西寶雞 721000；2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069）

西鳳酒是鳳香型白酒的鼻祖，具有“醇香典雅、甘潤挺爽、諸味諧調(diào)、尾凈悠長”的香味特點和“多類型香氣、多層次風(fēng)味”的典型風(fēng)格，這與其秉持千年的獨特釀造工藝、獨特的酒海貯存和優(yōu)良的釀酒環(huán)境密不可分。鳳香型白酒的生產(chǎn)是開放式的多菌種發(fā)酵過程，在釀造過程中，長期的生產(chǎn)活動使得釀造環(huán)境形成了特定的微生態(tài)環(huán)境，長期的馴化形成了特有的釀造鳳香型白酒所必須的微生物菌群。懸浮在空氣中的微生物會通過自然接種附著在酒醅上參與發(fā)酵，在釀造過程中增殖和代謝，生成不同的香味物質(zhì)，直接影響鳳香型酒體風(fēng)味的形成。因此，系統(tǒng)地研究環(huán)境中真菌菌群結(jié)構(gòu)組成及其優(yōu)勢菌屬有助于揭示環(huán)境微生物在釀造過程中的重要作用，對深入認(rèn)識鳳香型白酒的釀造機(jī)制具有重要意義。

近年來，有關(guān)釀造環(huán)境微生態(tài)的研究日漸增多。王興初等[1]研究發(fā)現(xiàn)在茅臺酒廠的生產(chǎn)環(huán)境中，空氣中的細(xì)菌進(jìn)行了選擇性的富集，形成了菌體密度大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)菌區(qū)系；黎瑤依等[2]系統(tǒng)研究了茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒不同釀造輪次生產(chǎn)環(huán)境中的真菌菌群結(jié)構(gòu)及特征；符長彪等[3]對不同釀造方式下釀造車間不同環(huán)境區(qū)域的微生物群落結(jié)構(gòu)及分布特征進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)操作方式對于環(huán)境因子的改變以及微生物的相互作用等原因，導(dǎo)致了真菌類群在種類和相對豐度上具有一定差異。目前，鳳香型白酒釀造微生物的研究主要集中在大曲和酒醅微生物方面，對釀造環(huán)境中的微生物研究較少。因此，本實驗結(jié)合高通量測序法和數(shù)理統(tǒng)計方法對鳳香型白酒新老制酒車間空氣真菌群落結(jié)構(gòu)組成及差異性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，旨在揭示釀造環(huán)境微生物對鳳香型白酒制酒品質(zhì)的影響，為進(jìn)一步解析鳳香型白酒釀造環(huán)境微生物的真菌菌群結(jié)構(gòu)及釀造機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

空氣樣本：采樣見1.2。

試劑及耗材：氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；0.22 μm濾膜，海寧市德濾新材料科技有限公司；Q5?High-Fidelity DNA 聚合酶（M0491L），美國NEB 公司；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（P7589），美國Invitrogen 公司；Agarose（75510-019），美國Invitrogen 公司；Marker（DL15000 或DL2000），日本Takara 公司；TAE（AM9870），美國Invitrogen公司。

儀器設(shè)備：液體撞擊式微生物氣溶膠采樣器，遼陽市康潔儀器研究所；GM-0.33A 真空抽濾裝置，天津津騰實驗設(shè)備有限公司；DYY-6C 型電泳儀，北京六一儀器廠；BG-gdsAUTO(130)型凝膠成像系統(tǒng)，北京百晶生物技術(shù)有限公司；Nanodrop?NC2000 紫外定量設(shè)備，美國Thermo Scientific 公司；2720 型PCR 擴(kuò)增儀，美國ABI 公司；FLX800T型酶標(biāo)儀，美國BioTek 公司；MiSeq 測序儀，美國Illumina 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品及采集方法

空氣樣本，采集自鳳香型白酒企業(yè)新老兩個釀造車間（下文中O 代表老車間，N 代表新車間）環(huán)境區(qū)域的空氣。用液體撞擊式微生物氣溶膠采樣器（采樣液為PBS緩沖液）采樣，選取釀酒車間室內(nèi)距墻2 m 以外，高度距地面1.5 m 左右無人員流動的范圍為采樣點，每個樣品由5 個采樣點組成，采樣完畢，用濾膜和抽濾裝置對含有空氣微生物的吸附液進(jìn)行過濾，冷凍保存樣品并盡快送樣檢測。

1.2.2 基因組提取

提取步驟參見OMEGA Soil DNA Kit (M5635-02)的操作說明。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增引物：應(yīng)用ITS1F(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和ITS2R(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')對真菌ITS 基因V1 區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

擴(kuò)增體系(25 μL)：5 μL 5×reaction 緩沖液，5 μL 5×GC 緩沖液，2 μL dNTPs（2.5 mM），1 μL 上游引物（10 μM），1 μL 下游引物（10 μM），2 μL 模板DNA，ddH2O 8.75 μL，0.25 μL Q5 DNA 聚合酶。

擴(kuò)增參數(shù)：98 ℃預(yù)變性2 min，25～30 個循環(huán)（98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃穩(wěn)定延伸5 min，最后在10 ℃下直到反應(yīng)停止。

1.2.4 llumina Miseq測序

利用Illlumina NovaSeq 平臺進(jìn)行測序分析，上海派森諾生物技術(shù)有限公司。

1.2.5 序列分析

采用DADA2 和QIIME2 2019.4 (https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/)分析序列[4]。使用軟件對原始序列進(jìn)行預(yù)處理，按最小樣本序列數(shù)的97%抽平后，選取高質(zhì)量序列進(jìn)行分析。利用UNITE Release 8.0 真菌數(shù)據(jù)庫對擴(kuò)增子序列變異體（amplicon sequence varian，ASV）進(jìn)行分類注釋[5]。序列數(shù)據(jù)分析主要使用QIIME2和R包(v3.2.0)執(zhí)行。使用QIIME2 中的ASV 表計算ASV 水平的alpha 多樣性指數(shù)，計算Beta 多樣性Jaccard 指數(shù)、Bray-Curtis和UniFrac 距離矩陣，并對樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行非度量多維尺度(NMDS)和層次聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新老車間不同月份空氣真菌Alpha 多樣性分析

本研究通過高通量測序技術(shù)分析新老制酒車間空氣微生物多樣性，真菌ITS 基因V1 區(qū)測序共獲得3034106 條序列，其中高質(zhì)量序列有2663167條，每條序列的平均長度是225.26，平均每個樣品110965 條序列，其中最少59667 條，最多237060 條序列。經(jīng)抽平后得到2032 個真菌種群ASV，兩個車間真菌ASV 數(shù)量最少的均為4 月，新車間真菌ASV 最多的是5 月，老車間真菌ASV 最多的是12月（表1）。稀釋曲線是表征樣品測序結(jié)果是否能夠反映樣品實際生物信息的分析方式[6-7]。稀釋曲線分析顯示所有樣品真菌ITS 基因測序都達(dá)到或接近平臺期（圖1），說明本次測序可覆蓋樣本中絕大多數(shù)真菌種群信息。

圖1 真菌種群ITS基因測序稀釋曲線（97%相似度水平）

表1 高通量測序信息匯總

本研究通過豐富度指數(shù)（Chao1 和Observed species）、覆蓋度指數(shù)（Good’s coverage）和多樣性指數(shù)（Shannon 和Simpson）評價空氣樣品的真菌種群多樣性（圖2）。由圖2a 和2b 可以看出，1—9 月兩個車間空氣微生物的真菌豐富度變化趨勢基本一致，9 月—12 月變化趨勢不同且差異顯著，老車間空氣樣品的真菌豐富度是12 月最高，新車間是5月最高，兩個車間均為4 月最低。由圖2c 可以看出所有樣品的測序深度均大于0.99，表明測序深度基本覆蓋樣品中所有的物種。由Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)圖可以看出，兩個車間變化趨勢一致，但新車間的真菌多樣性波動幅度較大，表明老車間環(huán)境較為穩(wěn)定，新車間更易受季節(jié)影響。

圖2 真菌Alpha多樣性指數(shù)

2.2 新老車間不同月份空氣真菌種群結(jié)構(gòu)差異

所有空氣樣品中的真菌種群可歸屬于10 個門，老車間和新車間的樣品中均檢測到7 個真菌門。由圖3 可知，相對豐度較高且在所有樣品中均有分布的是子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota），每個樣品中這兩類菌的豐度和為91.48%～99.97%；樣品中占主導(dǎo)地位的真菌種群均為子囊菌門，相對豐度高達(dá)79.99 %～99.94%，其余菌門的占比都很小。相關(guān)研究表明，子囊菌門是鳳香型酒醅中的優(yōu)勢真菌種群[8-9]，同時也是鳳香型白酒制酒車間可培養(yǎng)空氣真菌的主要種群[10]。

圖3 新車間（A）和老車間（B）的空氣樣品在門水平的真菌種群結(jié)構(gòu)

新車間的空氣樣品中檢測到263 個真菌屬，通過篩選新車間空氣樣品的優(yōu)勢種群（平均相對豐度大于1 %的屬）得到屬水平下真菌種群結(jié)構(gòu)見圖4A。由圖4A 可知，新車間空氣樣品相對豐度大于1%的真菌屬有10 個，分別是熱子囊菌屬（Thermoascus）、Phialemoniopsis、鏈格孢屬（Alternaria）、畢赤酵母屬（Pichia）、曲霉屬（Aspergillus）、Neosetophoma、球腔菌屬（Mycosphaerella）、Cutaneotrichosporon、赤殼科未培養(yǎng)真菌屬（unclassified_Nectriaceae）、綠核菌屬（Ustilaginoidea）。結(jié)合各樣品相對豐度單獨排序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9 月、11 月和12 月的優(yōu)勢真菌屬均為熱子囊菌屬、曲霉屬和畢赤酵母屬。9月空氣樣品中這3 種菌的豐度為36.23%、13.38%、34.6 %；11 月為44.99 %、8.61 %、11.42 %；12 月為61.96%、13.8%、17.84%。以熱子囊菌屬為第一優(yōu)勢菌屬的還有1 月和2 月，豐度分別為48.84 %和48.38%，其中，1 月樣品的第二、第三優(yōu)勢菌屬為曲霉菌屬（8.34 %）和綠核菌屬（7.33 %），2 月樣品的第二、第三優(yōu)勢菌屬為畢赤酵母屬（33.73 %）和曲霉屬（6.9%）。主要真菌屬包括熱子囊菌屬但不是第一優(yōu)勢菌屬的樣品有3 月和5 月，3 月樣品的主要真菌屬有Phialemoniopsis（27.09%）、熱子囊菌屬（12.3%）和畢赤酵母屬（10.43%），5 月樣品的優(yōu)勢菌屬為球腔菌屬（20.37 %）、Cutaneotrichosporon（16.12 %）、熱子囊菌屬（15.86 %）、曲霉菌屬（15.35 %）和畢赤酵母屬（12.74 %）。10 月樣品的主要真菌屬為曲霉菌屬（26.61 %）和畢赤酵母屬（14.45 %）。值得注意的是，雖然樣品的優(yōu)勢菌屬都包括嗜熱子囊菌屬、曲霉菌屬、畢赤酵母屬，但豐度差異顯著，且個別樣品中存在豐度高于這3 種菌的特有菌屬，例如5 月樣品的第一優(yōu)勢細(xì)菌屬為球腔菌屬；4 月和6 月樣品的優(yōu)勢細(xì)菌屬均為Phialemoniopsis，其相對豐度分別為97.32 %、74.03 %；7月樣品的主要菌屬為鏈格孢屬（41.76%）和Neosetophoma（42.67 %）；8 月樣品的優(yōu)勢真菌屬為鏈格孢屬（90.9%）。3 月、10 月和11 月的樣品中均有占比很高的未知真菌屬。

圖4 新車間（A）和老車間（B）的空氣樣品在屬水平的真菌種群結(jié)構(gòu)

老車間的空氣樣品中檢測到277 個真菌屬，通過篩選各樣品的優(yōu)勢種群（平均相對豐度大于1 %）得到屬水平下真菌種群結(jié)構(gòu)見圖4B。由圖4B 可知，老車間空氣樣品相對豐度大于1%的真菌屬分別為熱子囊菌屬、鏈格孢屬、Phialemoniopsis、畢赤酵母屬、曲霉屬、籃狀菌屬（Talaromyces）、Neosetophoma、球腔菌屬。結(jié)合各樣品相對豐度單獨排序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 月、5 月、11 月和12 月樣品的優(yōu)勢真菌屬均為熱子囊菌屬、曲霉屬和畢赤酵母屬。1月樣品中這3 種菌屬的相對豐度分別為46.17 %、8.64 %、8.07 %；5 月樣品中為25.05 %、15.79 %、12.82%；11 月樣品中為48.07%、12.98%、11.62%；12 月樣品中為63.04%、10.6%、7.02%。以熱子囊菌屬為第一優(yōu)勢菌屬的還有3 月，其豐度為26.52%，該月樣品第二、第三優(yōu)勢菌屬為畢赤酵母屬（7.1 %）和Phialemoniopsis（3.95 %）。主要真菌屬包括熱子囊菌屬但不是第一優(yōu)勢菌屬的樣品有2月和10 月，2 月樣品中第一、第二優(yōu)勢真菌屬分別為籃狀菌屬（67.84%）和熱子囊菌屬（15.93%）；10月樣品的主要真菌屬有鏈格孢屬（23.26 %）、畢赤酵母屬（9.32%）和熱子囊菌屬（6.04%）。同樣，雖然樣品的優(yōu)勢菌屬都包括嗜熱子囊菌屬、曲霉菌屬、畢赤酵母屬這3 種菌，但豐度差異顯著，且個別樣品中存在豐度高于這3 種菌的特有菌屬，例如2月樣品的第一優(yōu)勢菌屬是籃狀菌屬；4 月和6 月的優(yōu)勢菌屬均為Phialemoniopsis，其相對豐度分別為96.46%、60.12%；7 月樣品的主要菌屬為鏈格孢屬（62.83 %）和Neosetophoma（18.77 %）；8 月樣品的優(yōu)勢真菌屬為鏈格孢屬（86.99%）；9 月樣品中畢赤酵母屬占據(jù)絕對優(yōu)勢，其相對豐度為65.04 %。3月、5月和10月中均有占比很高的未知真菌屬。

綜上可以看出每個月的真菌屬組成及豐度均存在顯著差異，表明空氣微生物組成受季節(jié)影響較大，差異顯著的原因也可能是不同月份所對應(yīng)的生產(chǎn)時期不同，其環(huán)境微生物組成發(fā)生了變化。雖然每個月差異很大，但整體來看，新老車間的優(yōu)勢真菌屬較為一致，優(yōu)勢真菌屬（平均相對豐度大于1 %）中有7 種為兩個車間共有，分別是熱子囊菌屬、Phialemoniopsis、鏈格孢屬、畢赤酵母屬、曲霉屬、Neosetophoma和球腔菌屬。老車間特有的優(yōu)勢真菌屬為籃狀菌屬，新車間特有的真菌屬有Cutaneotrichosporon、赤殼科未培養(yǎng)真菌屬（unclassified_Nectriaceae）、綠核菌屬。兩個車間的空氣樣品中檢測到352 個真菌屬，兩個車間共有的真菌屬有212 個，在所有樣品中都存在的只有7 個，按平均相對豐度高低依次是熱子囊菌屬（21.45 %）、鏈格孢屬（13.09 %）、畢赤酵母屬（11.82 %）、曲霉屬（7.67 %）、球腔菌屬（1.92 %）、unclassified_Fungi（0.86 %）和亞隔孢殼科未歸類真菌屬（unclassified_Didymellaceae，0.78%）。曹苗文等[11]在研究清香型大曲白酒釀造中發(fā)酵微生物的來源時發(fā)現(xiàn)發(fā)酵材料中的嗜熱子囊菌屬、曲霉屬在大曲中很少或幾乎沒有，但卻在環(huán)境中存在。嗜熱子囊菌屬具有良好的酶分泌特性，產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等酶類，并具有良好的熱穩(wěn)定性，能夠在白酒發(fā)酵過程中溫度較高的條件下保持穩(wěn)定的催化效率[12]；鏈格孢菌屬具有突出的產(chǎn)蛋白酶的能力[13]；畢赤酵母屬具有較強(qiáng)產(chǎn)酯功能，能夠利用發(fā)酵環(huán)境中的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)[14]；曲霉屬可以代謝產(chǎn)生多種蛋白酶和水解酶類[15]；Phialemoniopsis是濃香型大曲生產(chǎn)環(huán)境空氣中的優(yōu)勢真菌[16]；籃狀菌屬的有些種是條件致病菌，但其許多種是重要酶類的產(chǎn)生菌[17]，有產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶活性[18]；球腔菌屬是多種農(nóng)林植物的病原菌，該屬的不少種侵染植物后會引起植物組織壞死，產(chǎn)生病斑[19]，但該菌只在空氣中發(fā)現(xiàn)，在酒醅和大曲中并未發(fā)現(xiàn)。在釀酒區(qū)域空氣中的熱子囊菌屬、Phialemoniopsis、畢赤酵母屬、曲霉屬等是鳳香型白酒入池酒醅中的優(yōu)勢菌屬，表明環(huán)境中真菌種群結(jié)構(gòu)可能會影響釀酒過程中的真菌種群結(jié)構(gòu)。

2.3 新老車間空氣真菌Beta多樣性差異

通過對樣品真菌Beta 多樣性距離矩陣進(jìn)行層級聚類分析，構(gòu)建樣品層級聚類樹研究不同樣品的相似性和差異性。如圖5，空氣樣品可分為5 類，O1、O2、N1、N2、O3、N3、O5、N5、N9、O10、N10、O11、N11、O12、N12 的真菌屬聚為一類，O4、N4、O6 和N6 的真菌屬聚為一類，O7 和N7 的真菌屬聚為一類，O8 和N8 的真菌屬聚為一類，O9 的真菌屬單獨為一類，結(jié)果表明，新老車間的微生物并沒有明顯有規(guī)律的聚類。

圖5 真菌種群層次聚類分析（HCA）

3 結(jié)論

利用高通量測序技術(shù)對新老車間不同空氣樣品的真菌群落以及物種多樣性之間的差異進(jìn)行分析，共檢測出10 個真菌門和352 個真菌屬。老車間的樣品中檢測到7 個真菌門和277 個真菌屬，新車間的樣品中檢測到7 個真菌門和263 個真菌屬。兩個車間共有的真菌屬有212 個，至少在15 個樣品中都存在的真菌屬有41 個，在所有樣品中都存在的有7 個，老車間和新車間空氣樣品中相對豐度大于1%的真菌屬分別有9 和10 個，其中兩個車間共有的有7 個。根據(jù)各菌門、屬的相對豐度，子囊菌門是鳳香型白酒新老制酒車間所有空氣樣品的優(yōu)勢菌門，新老車間共有的優(yōu)勢真菌屬為熱子囊菌屬、Phialemoniopsis、鏈格孢屬、畢赤酵母屬、曲霉屬、Neosetophoma、球腔菌屬，老車間特有的有籃狀菌屬，新車間特有的為Cutaneotrichosporon、赤殼科未培養(yǎng)真菌屬和綠核菌屬。一年四季穩(wěn)定存在的真菌屬有熱子囊菌屬、鏈格孢屬、畢赤酵母屬、曲霉屬、球腔菌屬和兩種未歸類的真菌屬。通過對真菌屬水平分布差異分析，發(fā)現(xiàn)隨著季節(jié)的變化，新老車間不同月份的真菌屬組成差異較大，但全年共有的微生物數(shù)量較多，優(yōu)勢真菌屬組成相似，這表明車間投產(chǎn)時間長短雖然有差異，但同屬鳳香型白酒產(chǎn)區(qū)，空氣微生物差異不大。通過研究鳳香型白酒制酒車間空氣中真菌群落結(jié)構(gòu)特征及優(yōu)勢菌屬，為揭示鳳香型白酒釀造環(huán)境微生物與釀造過程中微生物間的關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)，從環(huán)境微生物角度為鳳香型白酒釀造的季節(jié)調(diào)控提供了科學(xué)依據(jù)。