張婷婷, 徐湘民

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院地中海貧血診治創(chuàng)新研究中心、南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室(廣東廣州 510515)

全球有5%～20%的人群攜帶α-地貧基因和1.5%的人群攜帶β-地貧基因,超過90%的患者分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。中國南方大部分省(自治區(qū))是地貧高發(fā)區(qū),我們的研究顯示中國南方人群α-地貧的平均攜帶率為16.77%,β-地貧的平均攜帶率為4.70%[2],該病高發(fā)地區(qū)的遺傳負(fù)荷已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1-2]。地貧發(fā)病機(jī)制及表型異質(zhì)性等方面的基礎(chǔ)研究進(jìn)展為該病預(yù)防、診治及其技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),地貧篩查技術(shù)、診斷方法和治療方案的進(jìn)步為降低地貧患兒出生率和改善患者的生活狀態(tài)提供了技術(shù)支撐[3-4]。同時(shí),技術(shù)的進(jìn)步促進(jìn)基礎(chǔ)研究的發(fā)展,二者相輔相成?；蛑委熜录夹g(shù)的發(fā)展和BCL11A等β-地貧表型重要修飾基因的發(fā)現(xiàn)為地貧患者提供了新的治療方案[5-6],同時(shí)也帶動(dòng)了β-地貧基因治療領(lǐng)域的臨床研究和治療實(shí)踐;近十多年來高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展推動(dòng)了該領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。包括地貧在內(nèi)的血紅蛋白病更多的遺傳突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn),為臨床精準(zhǔn)診斷和遺傳咨詢提供了保障[7];目前世界上3個(gè)血紅蛋白病專病數(shù)據(jù)庫:HbVar(http://globin.bx.psu.edu/hbvar)、IthaGenes(https://www.ithanet.eu/db/ithagenes)和本團(tuán)隊(duì)建立的Leiden開放變異-中國數(shù)據(jù)庫(Leiden Open Variation Database-China,LOVD-China,http://www.genomed.zju.edu.cn/LOVD3/genes)[8-10]。其中本團(tuán)隊(duì)建立的數(shù)據(jù)庫,全面系統(tǒng)記錄了中國人群α-和β-珠蛋白基因簇上的變異及每個(gè)變異的詳細(xì)信息,并首次創(chuàng)建了血紅蛋白病在線輔助精準(zhǔn)診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估系統(tǒng)[10]。

1 表型篩查技術(shù)及其應(yīng)用

通過在地貧高發(fā)區(qū)進(jìn)行公共衛(wèi)生教育、實(shí)施大規(guī)模的地貧人群篩查和產(chǎn)前診斷計(jì)劃,已有效減少了該病患兒的新生兒出生數(shù)量,針對(duì)地貧的成功實(shí)踐成為歷史上單基因病人群防控的典范[11]。大規(guī)模人群表型篩查是產(chǎn)前診斷的基本前提,傳統(tǒng)上,應(yīng)用血細(xì)胞自動(dòng)分析儀,首先通過全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(full blood counting,FBC)技術(shù),采用平均紅細(xì)胞體積(mean corpuscular volume,MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin,MCH),以及血紅蛋白A2(Hb A2)含量作為檢測指標(biāo),對(duì)婚前和孕早期育齡夫婦進(jìn)行常規(guī)篩查,當(dāng)受檢個(gè)體表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素貧血特征時(shí),即視為陽性地貧攜帶者,并通過Hb A2含量的改變初步區(qū)分為α-和β-地貧攜帶者[11-12]。表型篩查中,常應(yīng)用凝膠電泳、毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis,CE)或高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)等血紅蛋白檢測技術(shù),篩查異常血紅蛋白及各種血紅蛋白含量,用于輔助地貧類型的初步診斷[4,11]。表型篩查的目的是發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)夫婦,當(dāng)夫妻雙方經(jīng)基因診斷進(jìn)一步確診為同種地貧(夫妻同為α-或β-地貧)基因突變攜帶者時(shí),即被確定為產(chǎn)前診斷的適應(yīng)對(duì)象[11]。產(chǎn)前診斷應(yīng)用的主要技術(shù)手段以DNA診斷為基礎(chǔ),主要通過3種有創(chuàng)性取材方法:絨毛取樣、羊膜腔穿刺和臍帶穿刺,獲得足量的胎兒DNA樣本后,結(jié)合家系分析進(jìn)行基于胎兒地貧基因突變檢測的產(chǎn)前診斷,診斷為地貧患者的胎兒,可通過選擇性流產(chǎn)終止妊娠達(dá)到地貧預(yù)防的目的[11-12]。

上述傳統(tǒng)篩查所針對(duì)的血細(xì)胞和血紅蛋白檢測對(duì)象,在技術(shù)特異性上有明顯缺陷,且操作流程繁瑣,近幾十年來血紅蛋白病的高通量質(zhì)譜篩查新技術(shù)不斷發(fā)展[13],其中針對(duì)疾病發(fā)生特異性改變的珠蛋白肽鏈的質(zhì)譜檢測技術(shù)引人注目,如串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry,MS-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技術(shù)[14-15]。前者是在胰蛋白酶消化后基于α-珠蛋白鏈的蛋白特異性肽段靶分子分析策略,以穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的肽作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量進(jìn)而得到每個(gè)樣品中血紅蛋白的濃度。該方法能同時(shí)實(shí)現(xiàn)血紅蛋白變體的定性分析和血紅蛋白的定量檢測,可用于α-和β-地貧的篩查;后者是一種不需要酶解肽段步驟,即基于完整珠蛋白肽鏈進(jìn)行快速檢測的分析策略,直接準(zhǔn)確定性和定量不同珠蛋白鏈的豐度比。本團(tuán)隊(duì)已建立了用于β-地貧及異常血紅蛋白篩查的MALDI-TOF MS技術(shù)方案,并通過大規(guī)模人群樣本和臨床病例分組樣本的應(yīng)用評(píng)價(jià),證明該方法具有快速、簡便、準(zhǔn)確和低成本的性能優(yōu)勢,適用于大規(guī)模人群篩查,并可很好區(qū)分臨床上的中間型和重型β-地貧[15]。針對(duì)α-地貧新標(biāo)志物[16]的同類MS篩查技術(shù)正在研發(fā)中,基于珠蛋白全肽鏈的質(zhì)譜檢測新技術(shù),有望成為未來檢測血紅蛋白病的“一線篩查方法”(‘First Line Screening Assay’),從而改變傳統(tǒng)的地貧遺傳篩查操作流程。

2 分子診斷技術(shù)及其應(yīng)用

根據(jù)血液學(xué)表型篩查結(jié)果檢出陽性樣品后,需利用DNA檢測技術(shù)在分子水平上鑒定致病基因[β-珠蛋白基因(HBB)或α-珠蛋白基因(HBA)]的突變類型及基因型,這樣才能達(dá)到確診的目的。地貧的傳統(tǒng)分子診斷一般以PCR技術(shù)為基礎(chǔ),國內(nèi)外比較成熟的診斷缺失型α-地貧和δβ-地貧/HPFH大片段缺失,多采用跨越斷裂位點(diǎn)(Gap-PCR)和多重連接依賴探針擴(kuò)增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技術(shù)[4,11-12],前者應(yīng)用于檢測常見的缺失型α-地貧突變—-α3.7,-α4.2和--SEA等,后者用于檢測目標(biāo)序列的拷貝數(shù)異常以及大片段缺失,除驗(yàn)證已知缺失類型的突變外,通常也用于鑒定未知大片段缺失型的地貧樣本。檢測地貧基因點(diǎn)突變的技術(shù)有PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交(reverse dot blot,RDB)和分子信標(biāo)探針熔解曲線技術(shù)[17-18]等,這些技術(shù)均依據(jù)已知突變位點(diǎn)及序列設(shè)計(jì)探針,用于檢測α-或(和)β-地貧突變及其基因型。傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)均具有局限性,如Gap-PCR和PCR-RDB實(shí)驗(yàn)操作過程較繁瑣,檢測突變種類數(shù)少;MLPA分析則受限于其探針?biāo)采w范圍,且操作過程復(fù)雜、耗時(shí)長,不適用于大樣本檢測;熔解曲線技術(shù)突變圖譜復(fù)雜,結(jié)果判定需要足夠的經(jīng)驗(yàn),且受技術(shù)穩(wěn)定性影響等。

近10多年來,隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,使地貧的診斷更加全面與快捷。應(yīng)用于全基因組、外顯子組或靶向基因組的二代測序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)可快速高通量地全面檢測各種遺傳變異,不僅能檢測出整個(gè)珠蛋白基因編碼區(qū)及其關(guān)鍵調(diào)控區(qū)的遺傳變異,同時(shí)也能檢出該病的遺傳修飾基因突變,除有助于實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)診斷外,也為開展地貧的遺傳病理機(jī)制研究提供了有用的工具[2]?；陂L讀長的第三代測序技術(shù)(third-generation sequencing,TGS)在檢測大片段缺失以及拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV),尤其針對(duì)同源性高、GC含量豐富的DNA序列檢測上具有技術(shù)優(yōu)越性,能夠準(zhǔn)確區(qū)分HBA1和HBA2基因以及β-珠蛋白基因簇上有診斷價(jià)值的高度同源序列,正確辨別復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異和同源重組的真實(shí)遺傳攜帶者狀態(tài),已成為一種準(zhǔn)確高效的地貧檢測新方法,并在地貧的產(chǎn)前診斷應(yīng)用中被證明,TGS較基于PCR方法可以提供更多的遺傳檢測信息[7,19]。與傳統(tǒng)的基因分型方法相比,NGS和TGS方法可以滿足基因組水平廣泛遺傳變異的一次性分析,如α-和β-地貧的共遺傳,紅系先天性貧血多病共存,致病基因和遺傳修飾突變對(duì)表型的貢獻(xiàn),罕見突變的發(fā)現(xiàn)等,以及繪制準(zhǔn)確的α-和β-基因簇單倍型等。高通量測序技術(shù)代表了遺傳檢測的發(fā)展趨勢,該技術(shù)在血紅蛋白病領(lǐng)域的應(yīng)用我國處于領(lǐng)先水平,我們組織國內(nèi)團(tuán)隊(duì)與華大基因合作,推動(dòng)了NGS技術(shù)應(yīng)用于地貧遺傳檢測的發(fā)展[2],2022年華大基因研制的基于NGS的α-和β-地貧基因檢測試劑盒,已取得國家藥監(jiān)局的醫(yī)療器械注冊證。目前,包括我們團(tuán)隊(duì)在內(nèi),國內(nèi)外正致力于研發(fā)基于高通量測序的用于地貧無創(chuàng)產(chǎn)前診斷[20-21]和植入前診斷[22]的適宜技術(shù)。用于地貧“分子篩查”(‘Molecular Screening’)的高通量技術(shù)是未來可預(yù)期的發(fā)展方向。

3 遺傳治療技術(shù)及其應(yīng)用

長期規(guī)范性輸血結(jié)合鐵螯合劑祛鐵治療是臨床上治療重型β-地貧(輸血依賴性β-地貧,transfusion-dependent thalassemia,TDT)患者的常規(guī)手段,也是保障患者生命的維持療法。而造血干細(xì)胞骨髓移植(bone marrow transplantation,BMT)是能根治TDT患者的臨床治療手段。該療法將與患者人類白細(xì)胞抗原(HLA)匹配的供者的造血干細(xì)胞植入患者體內(nèi),即通過異基因造血干細(xì)胞移植達(dá)到根治目的。國內(nèi)外TDT造血干細(xì)胞治療都是從全相合骨髓移植開始,再發(fā)展為半相合骨髓移植,我國雖然這一領(lǐng)域的工作起步較晚,但經(jīng)過20多年的臨床實(shí)踐,我國的TDT半相合干細(xì)胞移植進(jìn)展迅速,治療成功率顯著提升,目前已達(dá)到國際領(lǐng)先水平。盡管如此,受移植配型供者來源匱乏,患者年齡及健康狀況指標(biāo)等因素制約,骨髓移植的受益者人數(shù)仍十分有限[1]。

隨著病毒載體和基因編輯技術(shù)的不斷成熟,近幾年來,針對(duì)TDT患者的基因治療臨床研究和應(yīng)用取得了重大突破,正在成為目前臨床上根治β-地貧的可選擇的新療法[1,5]。自體干細(xì)胞離體回輸(ex vivo)是目前TDT基因療法的主要策略,即從患者體內(nèi)獲取CD34+造血干細(xì)胞,離體細(xì)胞在體外進(jìn)行基因修飾,修飾的治療細(xì)胞再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。采用患者自體干細(xì)胞避免了移植免疫排斥風(fēng)險(xiǎn),這也是基因治療的技術(shù)優(yōu)勢,同時(shí),基因治療技術(shù)會(huì)給成人TDT患者帶來希望。BMT是基因治療的基礎(chǔ),移植前清髓預(yù)處理方案是保證基因治療成功的重要環(huán)節(jié)[23]。目前國內(nèi)外TDT基因治療有兩種技術(shù)方案:(1)攜帶β-珠蛋白基因(HBB)的慢病毒載體技術(shù),即在患者CD34+細(xì)胞中轉(zhuǎn)染經(jīng)修飾的HBB,替代體內(nèi)突變基因,恢復(fù)β-珠蛋白鏈的正常表達(dá);(2)采用基因編輯技術(shù)修飾患者CD34+細(xì)胞中抑制γ-珠蛋白基因(HBG)的轉(zhuǎn)錄因子BCL11A,或直接修飾HBG調(diào)控原件,使胎兒血紅蛋白(Hb F)重新激活,替代體內(nèi)缺失的成人血紅蛋白(HbA)。目前由藍(lán)鳥公司(Bluebird Bio)生產(chǎn),采用一次性給藥治療TDT患者的慢病毒載體制劑(Betibeglogene autotemcel,beti-cel)[24],已經(jīng)獲得歐洲和美國藥監(jiān)部門的批準(zhǔn),成為世界上首款上市的TDT基因療法新藥。此外,至少還有4款用于β-血紅蛋白病(TDT或鐮狀細(xì)胞貧血)治療的慢病毒載體或基因編輯制劑已經(jīng)取得了歐美的新藥臨床試驗(yàn)申請(qǐng)(investigational new drug,IND)批準(zhǔn)[25-28]。國內(nèi)的生物技術(shù)公司與高校和醫(yī)院合作,正在積極推進(jìn)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)TDT基因治療技術(shù)的臨床研究,目前已有3款用于治療TDT的基因編輯技術(shù)的IND申請(qǐng)獲國家藥監(jiān)局批準(zhǔn),正在開展新藥臨床試驗(yàn)[29-30];還有2款TDT慢病毒載體新藥正在開展研究者發(fā)起的臨床試驗(yàn),目前國內(nèi)已實(shí)施了30多例TDT基因治療。上述國內(nèi)外新藥已經(jīng)完成或正在開展的臨床試驗(yàn),多數(shù)取得了使TDT患者擺脫輸血依賴的令人欣喜的臨床療效。近期,國內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)采用慢病毒載體技術(shù)完成了世界首例輸血依賴型α-地貧患兒的基因治療,也取得“擺脫輸血”的臨床療效。

4 結(jié)語

綜上所述,近10多年來該領(lǐng)域在發(fā)展地貧預(yù)防和診療新技術(shù)上有了長足的進(jìn)步,基于珠蛋白肽鏈特異性分析的高通量質(zhì)譜新技術(shù)為全面快速篩查地貧提供了新的解決方案。高通量測序技術(shù)可高效檢出更廣泛和復(fù)雜的地貧遺傳變異,彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分子診斷的局限性,代表了未來地貧遺傳檢測的發(fā)展方向。我國β-地貧半相合骨髓移植先進(jìn)方案的應(yīng)用,以及國內(nèi)外β-地貧自體干細(xì)胞基因治療臨床試驗(yàn)所取得的顯著療效,為改善地貧患者生活質(zhì)量、減少疾病負(fù)擔(dān)帶來了新希望。

利益相關(guān)聲明:所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:張婷婷負(fù)責(zé)論文撰寫及修改,徐湘民負(fù)責(zé)論文指導(dǎo)及修改。