趙 媛, 劉 新, 張譯丹, 張 健, 劉 向, 楊國(guó)鋒*

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院老年病科, 河北 石家莊 050051; 2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科, 河北 石家莊 050051)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是最常見(jiàn)的、能夠引起老年人運(yùn)動(dòng)障礙的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其病因尚不明確。隨著人口的老齡化,PD在全球出現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì),隨之帶來(lái)一系列的家庭、醫(yī)學(xué)及社會(huì)問(wèn)題。PD主要病變?cè)诤谫|(zhì)致密帶、迷走神經(jīng)背核、藍(lán)斑等部位,其典型病理變化是α-突觸核蛋白(α-syn)的聚集及尾狀核、殼核中多巴胺含量的減少[1]。當(dāng)PD患者出現(xiàn)臨床癥狀時(shí),黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡比例至少為50%以上,紋狀體多巴胺含量減少80%以上[2]。由此可見(jiàn),PD患者具有臨床癥狀與神經(jīng)損傷的不平行性,神經(jīng)損傷早于臨床癥狀的出現(xiàn)。目前PD的臨床診斷仍以癥狀診斷為主,多數(shù)患者在確診時(shí)已出現(xiàn)較為明顯的運(yùn)動(dòng)障礙。因此,開(kāi)發(fā)PD的早期診斷標(biāo)志物對(duì)于開(kāi)展早期治療、改善病人預(yù)后等具有重要意義。

外泌體(exosomes)是一種直徑為50～200 nm且具有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡[2]。外泌體攜帶了大量來(lái)源細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核苷酸等生物分子,在細(xì)胞間通訊和免疫反應(yīng)等生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3-6]。外泌體參與多種神經(jīng)系統(tǒng)生理過(guò)程(包括物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、髓鞘形成和受損軸突的再生等),調(diào)節(jié)各種信號(hào)功能,并與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病相關(guān)[7-9]。血漿中存在多種細(xì)胞來(lái)源外泌體,其中包括神經(jīng)源性外泌體。研究表明,血漿外泌體攜帶了能夠反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的病理性生物分子[10]。目前,越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注PD的外泌體生物標(biāo)志物,例如通過(guò)血漿外泌體的微小核糖核酸(miRNA)逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,PD組外泌體中的miR331-5p水平明顯升高,而miR-505水平則明顯降低;且miR331-5p和miR-505具有較好的PD診斷價(jià)值及預(yù)測(cè)能力[11]。不僅如此,有研究表明,血漿外泌體的朊病毒蛋白質(zhì)水平上升與PD患者認(rèn)知能力下降顯著相關(guān)(統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P-value,P)<0.05)[12]。由此可見(jiàn),外泌體中可能承載了更多具有特異性的生物學(xué)信息,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病生物標(biāo)志物的良好載體。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

EASY-nLC 1200液相色譜系統(tǒng)、PepMap RSLC C18色譜柱(25 cm×75 μm, 2 μm)、Orbitrap Fusion Lumos融合熒光閃爍三合一質(zhì)譜儀、SPD120真空離心蒸發(fā)濃縮器(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司); optimal-90K超速離心機(jī)、70 Ti轉(zhuǎn)子(美國(guó)Beckman Coulter公司); Tecnai G2 20雙透射電鏡(200 kV,美國(guó)FEI公司);ZetaView PMX 110納米顆粒跟蹤分析儀(德國(guó)Particle Metrix公司)。

10標(biāo)TMT試劑、Pierce Bicinchoninic Acid蛋白質(zhì)試劑盒、色譜級(jí)乙腈和甲醇、Bradford蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)試劑盒、PierceTM比色法定量檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);高選擇性Top14高豐度蛋白損耗樹(shù)脂(Cat No. A36370,美國(guó)Sigma-Aldrich公司); 200目碳層銅網(wǎng)(北京中科科儀股份有限公司);色譜級(jí)甲酸(德國(guó)CNW公司); 0.22 μm孔徑過(guò)濾器、聚偏氟乙烯膜、化學(xué)發(fā)光辣根過(guò)氧化物酶(HRP)底物(美國(guó)Millipore公司); ALG-2相互作用蛋白X (Alix,貨號(hào)2171S)、鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,貨號(hào)12238T)一抗均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司;脂筏標(biāo)記蛋白(Flotillin-1,貨號(hào)610820)購(gòu)于美國(guó)BDBiosciences公司;二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G (貨號(hào)4050-05,美國(guó)Southern Biotech公司)。

1.2 血漿樣本采集

本研究選取2019年9月至2020年7月就診于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院老年病科的9名PD患者及9名HC為研究對(duì)象。PD患者的診斷均符合2016版中國(guó)帕金森病診斷和擬診標(biāo)準(zhǔn),病程達(dá)1年以上;臨床排除標(biāo)準(zhǔn):(1)繼發(fā)性帕金森綜合征患者,(2)帕金森疊加綜合征患者,(3)有嚴(yán)重心、肝、腎、胃腸道功能障礙者,(4)提供病史不詳細(xì)者,(5)近1個(gè)月內(nèi)有感染者,(6)患有免疫系統(tǒng)疾病者,(7)有慢性感染性疾病者,(8)近1個(gè)月內(nèi)使用過(guò)消炎藥、免疫調(diào)節(jié)藥者,(9)有惡性腫瘤病史者,(10)近期有外傷或頭顱手術(shù)者。樣本采集前,HC和PD患者均簽署了書(shū)面知情同意書(shū),受試者資料如表1所示。本研究已獲河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào):2022-R036)。

表1 受試者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)及臨床特征Table 1 Demographic and clinical characteristics of the subjects

1.3 血漿外泌體的分離

本實(shí)驗(yàn)采用超速差速離心法分離血漿外泌體[7,16],分離方法如下:將血漿在室溫下以3 000 g離心10 min,上清液用0.22 μm孔徑過(guò)濾器過(guò)濾,濾液用70 Ti轉(zhuǎn)子在4 ℃下以120 000 g離心3 h,棄去上清液,所得沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS, 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO3、0.44 g KH2PO3、1 L H2O, pH 7.4)重懸后再以120 000 g離心2 h,沉淀用PBS洗滌,最終得到血漿外泌體。

1.4 血漿高豐度蛋白質(zhì)去除

為了提高低豐度蛋白質(zhì)的檢出率,選用高選擇性Top14高豐度蛋白質(zhì)損耗樹(shù)脂來(lái)去除血漿中豐度最高的14種蛋白質(zhì)[14]。使用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后,向樣本中加入4倍體積且已在-20 ℃預(yù)冷的丙酮,靜置過(guò)夜;之后于4 ℃、12 000 g下離心10 min,收集沉淀,并在真空離心蒸發(fā)濃縮器中干燥。

1.5 外泌體的表征

1.5.1透射電鏡觀察外泌體形態(tài)

使用透射電鏡對(duì)外泌體的形態(tài)進(jìn)行觀察,用20 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl, pH 6.8)緩沖液將樣本稀釋至質(zhì)量濃度為0.1 μg/μL。在無(wú)菌濾紙上滴1滴醋酸鈾、2滴無(wú)菌水,將碳網(wǎng)蓋在樣本上靜置2 min,用濾紙吸取多余樣本,并于室溫下晾干。取10 μL醋酸鈾溶液負(fù)染1 min,用濾紙吸取多余染劑并在無(wú)菌水中清洗30 s,最后將樣本放置于顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)拍照。

首先，樹(shù)立全新的人才培養(yǎng)理念，突破傳統(tǒng)教育思路，重新認(rèn)識(shí)現(xiàn)代職業(yè)教育決策。國(guó)家打造的現(xiàn)代職業(yè)教育體系是高等教育體系的結(jié)構(gòu)性調(diào)整，是打造本科職業(yè)教育化，充分利用本科的教育資源培養(yǎng)高層次、高水平、高素養(yǎng)的適應(yīng)科技時(shí)代需求的新型技術(shù)工人。因此，打造以培養(yǎng)應(yīng)用型技術(shù)技能型人才為目標(biāo)的應(yīng)用技術(shù)型大學(xué)，獨(dú)立學(xué)院要優(yōu)化現(xiàn)有的人才培養(yǎng)方式，發(fā)揮辦學(xué)機(jī)制靈活的優(yōu)勢(shì)，將優(yōu)勢(shì)專業(yè)與產(chǎn)業(yè)相結(jié)合，培養(yǎng)特色專業(yè)背景強(qiáng)的、面向基層一線崗位的技術(shù)技能型人才，使人才培養(yǎng)方式更加符合現(xiàn)代職業(yè)教育改革的要求，更具科學(xué)性。

1.5.2蛋白免疫印跡分析檢測(cè)外泌體標(biāo)記蛋白質(zhì)

取10 μg已測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的樣本,與1%十二烷基硫酸鈉裂解液混合后進(jìn)行蛋白免疫印跡分析。在進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品電泳時(shí),先在100 V恒壓下電泳15 min,然后在200 V恒壓下電泳45 min,隨之結(jié)束電泳。將與十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳膠大小相近的纖維素膜預(yù)先在甲醇中浸泡搖晃約10 min,然后按照由上至下依次為濾紙、凝膠、纖維素膜、濾紙的順序放在轉(zhuǎn)膜儀上,轉(zhuǎn)膜條件設(shè)置為100 mA、10 V持續(xù)1 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,在室溫條件下使用PBS配制的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉來(lái)封閉纖維素膜1 h;隨后切下適當(dāng)分子質(zhì)量的樣本條帶,向其中加入相應(yīng)稀釋比例的一抗,在4 ℃搖床中孵育過(guò)夜;在室溫下使用PBS洗膜3次,每次洗滌10 min,之后向其中加入與一抗種屬相符的二抗,室溫下孵育1 h;再使用PBS洗膜3次,每次洗滌10 min,加入化學(xué)發(fā)光HRP底物反應(yīng)2 min,在暗室進(jìn)行曝光,使用Image J軟件對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化進(jìn)行灰度分析和比較。目的條帶的分子質(zhì)量:Calreticulin 55 kDa, Flotillin-1 48 kDa, Alix 96 kDa。

1.5.3納米粒子跟蹤分析(NTA)檢測(cè)外泌體樣本粒徑

將外泌體樣本用PBS以1∶1 000(v/v)的比例進(jìn)行稀釋,使用配備了405 nm激光的納米顆粒跟蹤分析儀來(lái)測(cè)定外泌體的粒徑和濃度,并記錄納米粒子在1 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡;之后用NTA軟件(version 8.02.28)對(duì)所記錄的視頻進(jìn)行分析,并提供粒子尺寸分布和粒子濃度數(shù)值。

1.6 樣本前處理

在每個(gè)樣品中均取40 μg蛋白質(zhì),并用8 mmol/L尿素溶液定容至60 μL,再向其中加入3 μL重組賴氨酰內(nèi)切酶(Lys-C),并于37 ℃下酶解2 h。用100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)將樣品稀釋4倍,再向其中加入2 μL胰蛋白酶(trypsin),用封口膜包住離心管,在37 ℃溫箱中酶解8～18 h。向樣本溶液中加入三氟乙酸(TFA)進(jìn)行酸化(加入后TFA的體積分?jǐn)?shù)為0.5%),選用搭載了C18的200 μL槍頭脫鹽柱進(jìn)行脫鹽,隨后在3 000 g下離心1 min,用200 μL乙腈(ACN)、200 μL 0.1%TFA水溶液-ACN(3∶7, v/v)潤(rùn)洗脫鹽柱,再用200 μL 0.1% TFA水溶液平衡脫鹽柱;之后緩慢加入樣品,在3 000 g下離心2 min,收集流出樣品,用200 μL 0.1%TFA水溶液進(jìn)行脫鹽;隨后使用200 μL 0.1%TFA水溶液-ACN(3∶7, v/v)對(duì)樣品進(jìn)行洗脫,收集洗脫液。對(duì)洗脫后的肽段樣本進(jìn)行液氮速凍處理,之后在真空旋轉(zhuǎn)干燥儀中完全干燥。用100 mmol/L四乙基溴化銨(TEAB)對(duì)已干燥的肽段進(jìn)行復(fù)溶,測(cè)定肽段濃度,每個(gè)樣品取等量的20 μg肽段用于標(biāo)記。使用10標(biāo)TMT進(jìn)行標(biāo)記,然后加入8 μL 5%羥胺(HDX),混勻后于室溫下放置15 min以終止反應(yīng)。將18個(gè)樣本分成兩批次進(jìn)行分析,每批次均設(shè)置一個(gè)含有等量各樣本組分的內(nèi)參。使用ACN和0.1%氨水配制梯度洗脫液(ACN的體積分?jǐn)?shù)依次為10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%和50%),用C18脫鹽柱對(duì)0.1%氨水溶解的TMT標(biāo)記肽段進(jìn)行脫鹽,再使用上述梯度洗脫液對(duì)樣本進(jìn)行分級(jí)洗脫,并將使用10%ACN及50%ACN洗脫液洗脫的樣本混合。最后將上述7個(gè)餾分進(jìn)行真空干燥,備用。

1.7 LC-MS/MS分析條件

1.7.1色譜條件

用0.1%甲酸水溶液將TMT標(biāo)記的多肽樣品復(fù)溶,之后以8 μL/min的速率通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入C18色譜柱(2 cm×75 μm, 3 μm)中,然后將C18柱切換到PepMap RSLC C18柱。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫程序:0～15 min, 2%B～25%B; 15～25 min, 25%B～50%B; 25～28 min, 50%B～98%B。流速300 nL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

1.7.2質(zhì)譜條件

離子化模式為正離子模式,掃描模式為全掃描(m/z300～1 500),掃描頻率為10 000 Da/s,數(shù)據(jù)采集模式為數(shù)據(jù)依賴型采集(data-dependent acquisition, DDA)。一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為m/z350～1 800,分辨率為120 000;選取一級(jí)質(zhì)譜圖中信號(hào)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行二級(jí)裂解,二級(jí)掃描的分辨率為50 000,碎裂模式為高能碰撞解離(HCD),歸一化碰撞能(NCE)設(shè)置為37%。

1.8 質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索分析

利用Proteome Discoverer 2.2軟件的SEQUEST搜索引擎功能對(duì)得到的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索,檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為UniProt人源數(shù)據(jù)庫(kù)Human. fasta(2017年10月下載)。檢索參數(shù)如下:胰酶特異性全酶切,允許兩個(gè)漏切;固定修飾包括半胱氨酸的烷基化、肽段N端或賴氨酸的TMT修飾;可變修飾為甲硫氨酸的氧化;母離子和碎片離子的質(zhì)量誤差分別為1×10-5Da和0.02 Da;蛋白質(zhì)和肽段譜圖鑒定的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)小于1%;對(duì)MS/MS掃描報(bào)告中不同離子通道的肽段豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[17]。蛋白質(zhì)鑒定要求每個(gè)蛋白質(zhì)組至少有一個(gè)唯一肽段,蛋白質(zhì)定量采用TMT報(bào)告離子定量,并利用內(nèi)參對(duì)不同TMT實(shí)驗(yàn)之間的報(bào)告離子強(qiáng)度進(jìn)行歸一化。

1.9 數(shù)據(jù)分析及生物信息學(xué)分析

蛋白質(zhì)組的所有統(tǒng)計(jì)分析均在RStudio環(huán)境(v1.0.143)中使用R(v3.6.3)進(jìn)行。使用log2變換后的雙尾t檢驗(yàn)來(lái)分析差異表達(dá)蛋白質(zhì),P采用多重檢驗(yàn)校正方法(benjaminiand Hochberg, BH)進(jìn)行調(diào)整[18]。在對(duì)熱圖進(jìn)行可視化分析之前,根據(jù)蛋白質(zhì)的Z評(píng)分(Z-score)對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行聚類分析。以P<0.05和差異倍數(shù)(fold change, FC)>1.2為條件,篩選HC和PD組之間的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。通過(guò)韋恩圖對(duì)鑒定到的血漿外泌體蛋白質(zhì)與ExoCarta外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.exocarta.org)進(jìn)行比較;使用MAGeCKFlute R包中的enrichment analyze函數(shù)進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)通路和基因本體論(GO)富集分析,并使用MAGeCKFlute中的函數(shù)對(duì)富集路徑進(jìn)行可視化[19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 血漿外泌體的表征與鑒定

在透射電鏡下可觀察到外泌體典型的雙側(cè)凹陷雙層膜結(jié)構(gòu),呈圓形或橢圓形囊泡狀,如圖1a和1b所示。囊泡可單一分布也可聚集成群疊加分布,尺寸約為100 nm,結(jié)構(gòu)完整。利用NTA軟件對(duì)外泌體樣本的粒徑及含量進(jìn)行分析,如圖1c所示,經(jīng)過(guò)1 000倍稀釋后,HC組與PD組的外泌體粒徑分別為107.96±1.57 nm和103.80±2.35 nm,均在外泌體的粒徑范圍之內(nèi),且兩組外泌體粒徑的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.35)。如圖1d所示,HC組與PD組外泌體的顆粒含量分別為9.29×109個(gè)/mL和9.51×109個(gè)/mL,兩組外泌體含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.16)。使用免疫印跡法檢測(cè)外泌體標(biāo)志性蛋白質(zhì)(即外泌體陽(yáng)性蛋白質(zhì))Alix、Flotillin-1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志性蛋白質(zhì)(即外泌體陰性蛋白質(zhì))Calreticulin的表達(dá)情況。如圖1e所示,通過(guò)差速超速離心法富集的人血漿外泌體中,Alix、Flotillin-1呈高表達(dá),而Calreticulin的表達(dá)量明顯減少,甚至消失。此外,將鑒定到的外泌體蛋白質(zhì)與ExoCarta外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析,大部分蛋白質(zhì)均可在外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到,如圖2所示。以上結(jié)果均驗(yàn)證了該外泌體富集方法的可靠性,同時(shí)證明了所獲得的外泌體具有較高的純度。

圖1 血漿外泌體表征Fig. 1 Characterizations of the plasma exosomes a and b. Plasma exosome morphologies visualized by TEM (scale bar 50 nm); c. size distributions of exosomes measured by NTA (n=9); d. exosome contents measured by NTA (n=9); e. Western blotting analysis of the plasma and exosomes. NS: no statistical significance.

2.2 PD患者與HC的血漿及血漿外泌體蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析

本研究通過(guò)LC-MS/MS技術(shù)對(duì)PD患者和HC的血漿及血漿外泌體進(jìn)行基于TMT的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并比較了血漿和血漿外泌體兩種樣本的蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖。在血漿和血漿外泌體樣本中分別鑒定到759和650個(gè)蛋白質(zhì),定量到724和611個(gè)蛋白質(zhì)。對(duì)定量到的蛋白質(zhì)表達(dá)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,標(biāo)準(zhǔn)化前后的比值分布以箱線圖表示。如圖3所示,標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)更趨近于中心位置,樣品間的強(qiáng)度分布差異更小,有利于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

基于PD組與HC組經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的蛋白質(zhì)豐度,做非配對(duì)t檢驗(yàn),并對(duì)t檢驗(yàn)所得到的P進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正。在血漿蛋白質(zhì)的鑒定中,由于血漿中存在大量高豐度蛋白質(zhì),導(dǎo)致血漿低豐度蛋白質(zhì)被掩蓋,降低了質(zhì)譜中可鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量。因此,本研究采用高豐度蛋白損耗樹(shù)脂來(lái)去除血漿中豐度最高的14種蛋白質(zhì)。同時(shí),在每批TMT實(shí)驗(yàn)中均設(shè)置了同質(zhì)量的內(nèi)參,以保證組間定量結(jié)果的可比性。以|log2FC|>0.26和P<0.05為篩選條件,在PD組與HC組血漿樣本中共篩選到11個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中5個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),6個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào);而在血漿外泌體樣本中共篩選到13個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中6個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),7個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)。由此可見(jiàn),血漿外泌體中可以篩選到更多的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。如表2所示,人血漿激肽釋放酶(KLKB1)、胞外5′-核苷酸酶(NT5E)、α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(NAGLU)、人前列腺轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGM4)、凝血因子Ⅷ (F8)、三磷酸腺苷酶蛋白酶體26S亞基4 (PSMC4)、脂多糖結(jié)合蛋白受體(CD14)、碳酸酐酶Ⅳ(CA4)、分泌型磷蛋白2 (SPP2)、脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)均可在外泌體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到。如圖4所示,與血漿蛋白質(zhì)分布相比,PD組與HC組血漿外泌體樣本的蛋白質(zhì)分布差異度更大。因此,對(duì)血漿外泌體樣本進(jìn)行高通量質(zhì)譜分析有助于發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的新蛋白質(zhì)。

據(jù)文獻(xiàn)[20-22]報(bào)道,NAGLU、NT5E等蛋白質(zhì)的差異表達(dá)不僅會(huì)增加PD的患病風(fēng)險(xiǎn),還會(huì)參與PD的病理過(guò)程,因此這些蛋白質(zhì)具有成為新型PD標(biāo)志物的潛力。NT5E是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)、損傷和疾病等過(guò)程的重要水解酶,其可催化磷酸腺苷(AMP)形成胞外腺苷[22-24]。在PD小鼠腦組織模型中,NT5E上調(diào)并激活腺苷2A(A2A)受體相關(guān)的腺苷通路;敲除NT5E能夠抑制PD模型中A2A受體的激活和上調(diào),并發(fā)揮保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元和減輕小鼠運(yùn)動(dòng)障礙的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),NT5E可促進(jìn)PD小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎癥因子的釋放[20]。NAGLU是一種降解硫酸肝素糖胺聚糖(GAGs)所需的溶酶體酶[25,26],從遺傳學(xué)角度來(lái)看,NAGLU的多態(tài)性(rs2071046)與PD的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。Winder-Rhodes等[27]對(duì)926名PD患者和2 308名對(duì)照者進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)C等位基因純合度的比值比為1.32。除此之外,Hamano等[21]發(fā)現(xiàn)ⅢB型黏多糖貯積病(MPSⅢB)患者的腦部區(qū)域內(nèi)存在大量磷酸化的α-syn,從病理角度說(shuō)明NAGLU可能與α-syn的生成、代謝及聚集密切相關(guān)。LBP是一種在肝臟中產(chǎn)生并可進(jìn)入血液循環(huán)的糖蛋白,它可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞與脂多糖的結(jié)合,導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子分泌增加[28]。已有研究表明,血漿中的LBP水平可以反映PD患者的患病風(fēng)險(xiǎn)、運(yùn)動(dòng)癥狀嚴(yán)重程度及疾病進(jìn)展[29]。

2.3 GO及KEGG通路富集分析

本研究以蛋白質(zhì)表達(dá)差異大小為基礎(chǔ)排序,采用基因集富集分析GSEA對(duì)定量到的所有差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能富集分析[30]。GSEA有助于了解所有差異基因的總體變化趨勢(shì),可以避免一些變化微弱卻具有效力的蛋白質(zhì)被過(guò)濾掉,發(fā)現(xiàn)更多與疾病相關(guān)的生物學(xué)通路。本研究對(duì)血漿和血漿外泌體樣本均進(jìn)行了基于GSEA的GO和KEGG分析。在GO分析中,依據(jù)P<0.05將基因本體論-生物學(xué)過(guò)程(GO-BP)、基因本體論-細(xì)胞組分(GO-CC)、基因本體論-細(xì)胞功能(GO-MF)中的前10名富集功能通路進(jìn)行展示,結(jié)果如圖5所示。依據(jù)GO-CC分析,血漿富集蛋白質(zhì)主要定位于細(xì)胞核,而血漿外泌體富集蛋白質(zhì)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。由于外泌體成分主要為各種細(xì)胞外分泌的產(chǎn)物,其內(nèi)含有大量細(xì)胞漿內(nèi)物質(zhì),這與GO分析中的細(xì)胞組成結(jié)果一致。GO-MF分析顯示,血漿差異表達(dá)蛋白質(zhì)的分子功能主要富集為RNA、DNA結(jié)合及補(bǔ)體結(jié)合等,而血漿外泌體差異表達(dá)蛋白質(zhì)的分子功能主要富集為抗氧化作用和氧化還原酶活性等。由此可見(jiàn),外泌體差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集到的分子功能更具有疾病特異性。研究表明,氧化應(yīng)激損傷在PD中可起到重要作用。多巴胺能神經(jīng)元有巨大、無(wú)髓鞘的軸突并可產(chǎn)生超過(guò)100萬(wàn)的突觸,其對(duì)能量的需求較其他神經(jīng)元更多。PD中多巴胺能神經(jīng)元的能量平衡被打破后,會(huì)導(dǎo)致其需氧量增加,而這種能量的不平衡又進(jìn)一步加重了氧化應(yīng)激損傷,致使黑質(zhì)紋狀體內(nèi)大量多巴胺能神經(jīng)元的死亡丟失[31,32]。

最后,對(duì)不同樣本差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG富集通路進(jìn)行分析(圖6)。血漿樣品富集通路有溶酶體途徑(lysosome)、細(xì)胞老化(cellular senescence)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)反應(yīng)(protein processing in endoplasmic reticulum)等,而血漿外泌體樣本差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要富集為細(xì)胞因子途徑(chemokine signaling pathway)和細(xì)胞因子受體間相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)等。溶酶體是自噬途徑的最終作用場(chǎng)所,負(fù)責(zé)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)及受損細(xì)胞器的清除。因此,溶酶體介導(dǎo)的自噬在PD病理過(guò)程中,尤其是維持黑質(zhì)神經(jīng)元功能中發(fā)揮重要作用[33]。研究表明,野生型α-syn可通過(guò)分子伴侶介導(dǎo)在熱激蛋白70(Hsc70)的協(xié)助下轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體并被降解,而構(gòu)象發(fā)生變化的病理性α-syn不能被降解,這是因?yàn)椴±硇驭?syn與溶酶體膜上的特異性受體有特別高的親和力,該類受體對(duì)自噬途徑具有調(diào)控作用。病理性α-syn與受體結(jié)合后可阻斷溶酶體攝入α-syn,并抑制其和其他底物的降解,造成胞內(nèi)蛋白質(zhì)的異常聚集[34,35]。此外,溶酶體三磷酸腺苷酶(ATPase, ATPl3A2)的突變也是引起PARK9相關(guān)帕金森病的主要原因。ATPl3A2是編碼溶酶體膜蛋白質(zhì)的主要基因,其突變可導(dǎo)致PD病人的自噬功能受損及α-syn在黑質(zhì)紋狀體中的聚集[36]。

與包含較多無(wú)關(guān)信息的血漿樣本相比,對(duì)特異性更強(qiáng)的血漿外泌體樣本進(jìn)行分析可以更加直觀地反映出機(jī)體和疾病的不同狀態(tài)。分析其原因可能是外泌體通過(guò)內(nèi)吞途徑起源于核內(nèi)體,而核內(nèi)體早期起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體等細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng),外泌體通過(guò)兩次質(zhì)膜內(nèi)陷從晚期核內(nèi)體中分離出來(lái),因此其攜帶了大量的母細(xì)胞信息,并通過(guò)融合、受體相互作用或內(nèi)吞作用等釋放至胞外[2]。在PD進(jìn)展過(guò)程中,外泌體不僅可以向遠(yuǎn)處播散α-syn,而且會(huì)通過(guò)分泌其他生物分子(如炎癥因子等)直接或間接地干擾鄰近神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞的病理、生理過(guò)程。因此,外泌體內(nèi)含有更多與PD相關(guān)的生物活性分子,對(duì)其進(jìn)行高通量組學(xué)分析更有利于發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)、病理機(jī)制以及新型疾病標(biāo)志物。

然而本研究也存在一定的局限性。首先樣本量較少,盡管發(fā)現(xiàn)了一些新型的、與PD相關(guān)的血漿及血漿外泌體蛋白質(zhì),但缺乏大樣本量的驗(yàn)證,不能很好地評(píng)價(jià)其對(duì)PD的診斷價(jià)值;其次,PD為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病,由于血腦屏障的存在,本研究中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)并不能完全反應(yīng)PD腦組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)差異,需要進(jìn)一步在動(dòng)物及細(xì)胞模型中進(jìn)行功能驗(yàn)證;最后,盡管本研究發(fā)現(xiàn)血漿外泌體蛋白質(zhì)富集通路或富集蛋白質(zhì)功能較血漿蛋白質(zhì)更具有疾病特異性,但與中樞神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)源外泌體相比,其特異性仍偏低,之后可以對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)源外泌體進(jìn)行高通量質(zhì)譜分析,以獲取更多與疾病相關(guān)性更強(qiáng)的生物學(xué)信息。

3 結(jié)論

本研究基于TMT的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)PD患者和HC的血漿及血漿外泌體樣本進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)篩選和GSEA生物學(xué)信息分析,研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步了解PD的疾病機(jī)制。盡管血漿蛋白質(zhì)和血漿外泌體蛋白質(zhì)均在PD中出現(xiàn)了明顯的差異表達(dá),但與血漿樣本蛋白質(zhì)組分析相比,血漿外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析可以獲得更多有價(jià)值的差異表達(dá)蛋白質(zhì)及生物學(xué)信息。因此,本研究不僅證實(shí)了外泌體是作為新型PD標(biāo)志物及診療靶點(diǎn)的良好研究載體,也論證了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在疾病標(biāo)志物研發(fā)中的重要作用。