米 琨, 章文天, 聞路紅,3, 王 進*

(1. 國際竹藤中心, 北京 100102; 2. 寧波華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司, 浙江 寧波 315200; 3. 寧波大學高等技術研究院, 浙江 寧波 315211)

苯丙胺類藥物是以苯丙胺(AM)為母體結構的一類化合物,具有成癮性和致幻性。目前,苯丙胺類藥物濫用問題嚴重,而現(xiàn)有的快速檢測手段存在不足,如檢測的廣譜性、快捷性和便攜性等。常規(guī)苯丙胺類藥物的檢測材料(如血液、尿液)僅適用于短期的人體內藥物鑒定。毛發(fā)是追溯長期藥物濫用史的重要樣本,具有易保存、穩(wěn)定、可檢測時限長的優(yōu)勢,彌補了體液檢測材料的不足[1],是重要的法庭證據(jù)。

目前,國內外有關苯丙胺類藥物的檢測方法包括氣相色譜-質譜聯(lián)用法、液相色譜-質譜聯(lián)用法、免疫分析法等。色譜-質譜聯(lián)用法是毒品檢測的金標準,韋棋等[2]用氣相色譜-質譜聯(lián)用法測定毛發(fā)中的6種苯丙胺類藥物,線性范圍為0.5～5.0 ng/mg。蘇佳麗等[3]用超高效液相色譜-質譜聯(lián)用法測定毛發(fā)中的常見毒品,其中苯丙胺類藥物的線性范圍為0.1～40 ng/mg。據(jù)廣西公安廳物證鑒定中心統(tǒng)計,苯丙胺類藥物濫用人員的陽性尿液中,苯丙胺類藥物的平均含量為29～13 530 ng/mL[4];據(jù)我國公安部統(tǒng)計,苯丙胺類藥物濫用人員的毛發(fā)中,苯丙胺類藥物的平均含量為1.98～15.09 ng/mg[5]。傳統(tǒng)的苯丙胺類藥物快速檢測技術主要以尿液為樣本,采用膠體金免疫檢測法[6]。Cheong等[7]使用熒光偏振免疫分析法測定頭發(fā)中的甲基苯丙胺(MA),對加標樣品(甲基苯丙胺含量0.5 ng/mg)的陽性檢出率可達100%,其檢測靈敏度與色譜儀器相當,但該方法的樣品前處理涉及長達4 h的酶消化過程。

敞開式質譜技術的出現(xiàn)促進了質譜方法在現(xiàn)場快速檢測中的應用。敞開式質譜技術的特點是在開放大氣壓環(huán)境下對待測物進行解吸和電離,待測物離子化后進入質譜儀分析;與傳統(tǒng)的色譜-質譜技術相比,敞開式質譜技術可以省略色譜分離環(huán)節(jié),且無需復雜的樣品前處理[8]。敞開式質譜的代表性技術包括解析電噴霧電離(desorption electrospray ionization, DESI)[9]、實時直接分析(direct analysis in real time, DART)[10]、紙噴霧電離(paper spray ionization, PSI)[11]等,敞開式質譜技術已廣泛應用于公共安全[12]、食品安全[13]等領域。Teunissen等[14]開發(fā)了基于紙噴霧電離的全血中苯丙胺快速定量方法,檢出限為15～50 ng/mL。熊士領等[15]利用探針直接電離實現(xiàn)了尿液中5種毒品的快速檢測,其中甲基苯丙胺的檢出限為0.5 ng/mL,可滿足尿液司法鑒定檢測標準要求(1 ng/mL)[16]。脈沖直流電噴霧電離(pulsed direct current electrospray ionization, Pulsed-DC-ESI)[17]作為一種新型敞開式直接電離技術,其電噴霧是通過在靠近待測溶液但不與待測溶液接觸的電極上施加高壓直流電產生的。與傳統(tǒng)質譜相比,Pulsed-DC-ESI質譜無需復雜的樣品前處理,樣品消耗少,無需載氣輔助,離子可直接進入質譜儀,大大提高了檢測效率[18]。

本研究將脈沖直流電噴霧與便攜式質譜儀聯(lián)用,通過優(yōu)化Pulsed-DC-ESI參數(shù),明確了影響Pulsed-DC-ESI穩(wěn)定性和離子化效率的關鍵因素,建立了一種人體毛發(fā)樣品中4種苯丙胺類藥物的快速檢測方法,并進行了方法學驗證,旨在為司法部門現(xiàn)場快速檢測苯丙胺類藥物提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

CRAIV-110便攜式質譜儀、PDESI-100脈沖直流電噴霧離子源(寧波華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司); B100-70-10微電極玻璃毛細管(美國Sutter公司); PC-100程控垂直拉制儀(日本Narishige公司); Vortes-5渦旋儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); Hico臺式高速微量離心機(生工生物工程(上海)股份有限公司); JXFSTPRP-CLN研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司); SECURA125-1CN電子天平(德國賽多利斯公司)。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯(HPLC級,美國TEDIA公司);AM、MA、3,4-亞甲基二氧基苯丙胺(MDA)和3,4-亞甲雙氧甲基苯丙胺(MDMA)標準品(上海刑事科學技術研究院,質量濃度1 mg/mL)。實驗所用空白毛發(fā)是經過Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色譜-Agilent 6470B三重四極桿質譜聯(lián)用儀檢驗后無毒的多地、多人毛發(fā)混合樣本,由寧創(chuàng)檢驗(寧波)有限公司提供。

1.2 標準溶液的配制

分別精確移取125 μL的4種標準品至1 mL樣品瓶中,以甲醇為溶劑配制成質量濃度為125 μg/mL的混合標準儲備液。取適量混合標準儲備液,用甲醇稀釋成系列質量濃度(0.5、1、2.5、5、25、50、100 μg/mL)的混合標準溶液。

1.3 樣品前處理

稱取25 mg毛發(fā)樣品(稱量精度0.1 mg),剪至長度小于1 cm的片段,放入研磨管中(含不銹鋼研磨珠),加入300 μL甲醇,在65 Hz條件下研磨6 min,然后將提取液在13 000 r/min下離心3 min;之后把毛細管尖端浸至提取液液面以下1 cm,利用毛細效應吸取提取液(約1 μL),進質譜檢測。

1.4 加標樣品的制備

按照1.3節(jié)方法對毛發(fā)樣品進行前處理后,加入適量的混合標準溶液,制備成不同含量(0.1、0.2、1、5、10、25、50、100、200 ng/mg)的加標樣品,備用。

1.5 儀器條件

質譜條件:錐口溫度200 ℃,離子通道內徑0.37 mm,采樣錐孔長度100 mm,噴霧電壓2 kV,正離子結合多反應監(jiān)測(MRM)模式采集數(shù)據(jù)。4種苯丙胺類化合物的質譜采集參數(shù)見表1。

表1 4種苯丙胺類化合物的質譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the four amphetamine-type compounds

脈沖直流電噴霧離子源:噴霧毛細管為硼硅酸鹽玻璃毛細管,外徑1 mm,內徑0.75 mm,長度55 mm;噴霧毛細管尖端內徑25 μm,尖端玻璃壁厚約12 μm。脈沖直流電噴霧離子源的裝置示意圖見圖1。

圖1 脈沖直流電噴霧離子源的裝置示意圖Fig. 1 Device diagram of pulsed direct current electrospray ion source DC: direct current.

2 結果與討論

2.1 離子源條件優(yōu)化

離子源條件是質譜信號穩(wěn)定、檢測靈敏度高的重要保障。為使Pulsed-DC-ESI-便攜式質譜儀達到最佳檢測狀態(tài),對脈沖直流電噴霧離子源的各組成部分進行單因素實驗。以4種苯丙胺類化合物的離子強度作為評價指標,考察噴霧毛細管尖端內徑(25、50 μm)、電極與待測溶液間距(d, 0～30 mm)以及噴霧電壓(1～5 kV)等因素對質譜穩(wěn)定性和離子化效率的影響,每個實驗重復6次,每次更換不同的噴霧毛細管。

2.1.1噴霧毛細管尖端內徑優(yōu)化

檢測靈敏度與毛細管尖端內徑有關,一般認為,毛細管尖端內徑越小,形成泰勒錐中單位體積的電荷密度越大,越有利于庫侖爆炸的形成。根據(jù)預實驗結果,比較了不同噴霧毛細管尖端內徑(25、50 μm)對離子化效率的影響。在噴霧電壓為2 kV、電極與待測溶液間距為20 mm的條件下,對4種苯丙胺類藥物混合標準溶液的質譜響應進行測試,結果見圖2。由圖2可知,當噴霧毛細管尖端內徑為25 μm時,4種苯丙胺類化合物均具有較好的質譜響應性和穩(wěn)定性;當噴霧毛細管尖端內徑為50 μm時,質譜響應的穩(wěn)定性較差。在預實驗中,當噴霧毛細管尖端內徑為10 μm時,因浸取的樣品量較少,會導致無法產生穩(wěn)定的質譜信號。因此,選擇噴霧毛細管尖端內徑為25 μm,有助于穩(wěn)定質譜響應信號。

圖2 噴霧毛細管尖端內徑對4種苯丙胺類化合物質譜響應的影響(n=6)Fig. 2 Effect of inner diameter of spray capillarytip on MS responses of the four amphetamine-type compounds (n=6)

2.1.2電極與待測溶液的間距優(yōu)化

Pulsed-DC-ESI的原理是電極尖端產生的感應電場誘導待測溶液極化[19],在正離子模式下,正離子向毛細管尖端遷移,積累到一定程度會產生電噴霧;同時,待測溶液中也會積累負離子,需通過氧化還原反應實現(xiàn)溶液的電中性,產生連續(xù)的電噴霧[20]。電極與待測溶液的間距決定了電極尖端產生的電場在待測溶液上的強度,實驗考察了電極與待測溶液間距對4種苯丙胺類藥物質譜響應的影響。在噴霧電壓為2 kV、噴霧毛細管尖端內徑為25 μm的條件下,對4種苯丙胺類藥物混合標準溶液進行測試,結果如圖3所示。由圖3可知,當電極與待測溶液間距為20 mm時,4種苯丙胺類藥物表現(xiàn)出較好的質譜響應。預實驗發(fā)現(xiàn),當電極直接接觸待測溶液時,會出現(xiàn)溶液瞬間大量噴出的現(xiàn)象,導致軟件無法采集完整的質譜信號,且待測溶液附著在電極表面,會對電極造成污染,需清洗電極才能重復使用。因此,本研究將電極與待測溶液的間距設置為20 mm。

圖3 電極與待測溶液間距對4種苯丙胺類化合物質譜響應的影響(n=6)Fig. 3 Effect of the distance between electrode and the solution to be measured (d) on the MS responses of the four amphetamine-type compounds (n=6)

2.1.3噴霧電壓優(yōu)化

適當?shù)膰婌F電壓有利于質譜信號的產生。在噴霧毛細管尖端內徑為25 μm、電極與待測溶液間距為20 mm的條件下,比較了不同噴霧電壓(1～5 kV)對4種苯丙胺類化合物信號強度的影響,結果見圖4。由圖4可知,當噴霧電壓為2 kV時,可產生強度較高且穩(wěn)定的質譜信號,隨著電壓增加,AM的質譜信號下降,電壓對電離過程并不表現(xiàn)為持續(xù)的促進作用。相同溶劑條件下,毛細管噴出帶電霧滴的大小與噴霧毛細管尖端的電場強度呈正相關[20],電場強度越大,噴霧液滴越大。當待測溶液體積不變時,帶電霧滴越大,電噴霧的持續(xù)時間越短。因此,用于計算離子有效強度對應的時長不足,質譜軟件無法采集足夠多的質譜信號。實驗過程發(fā)現(xiàn),當較高的電壓施加在電極上時,質譜響應信號存在不穩(wěn)定的現(xiàn)象。因此,確定噴霧電壓為2 kV。

2.2 樣品溶劑優(yōu)化

不同溶劑具有不同的理化性質,如黏度、表面張力等,這些性質會對樣品的離子化產生影響。本研究分別以3種不同溶劑(甲醇、乙腈和乙酸乙酯)溶解4種苯丙胺類化合物,比較了不同溶劑對苯丙胺類藥物質譜響應的影響。在噴霧電壓為2 kV、噴霧毛細管尖端內徑為25 μm、電極與待測溶液間距為20 mm的條件下進行測試。結果如圖5所示,4種苯丙胺類化合物在甲醇中均具有較好的質譜信號強度,但在乙腈和乙酸乙酯中,4種苯丙胺類化合物的質譜響應下降,這可能是因為乙腈的質子傳輸能力比甲醇低,導致苯丙胺類化合物的質譜響應較低;當乙酸乙酯作為溶劑時會產生質譜響應信號延遲和電噴霧不穩(wěn)定的現(xiàn)象,這可能是因為乙酸乙酯的極性較弱[21],需要較長時間的電場誘導才能極化,不利于電噴霧的產生。因此,本實驗最終選擇甲醇為樣品的溶解溶劑。在優(yōu)化的條件下,4種苯丙胺類化合物的質譜采集參數(shù)見表1,二級質譜圖見圖6。

圖5 不同溶解溶劑對4種苯丙胺類化合物質譜響應的影響(n=6)Fig. 5 Effect of different dissolving solvents on the MS responses of the four amphetamine-type compounds (n=6)

圖6 4種苯丙胺類化合物(0.1 μg/mL)的二級質譜圖Fig. 6 MS2 spectra of the four amphetamine-type compounds (0.1 μg/mL)

2.3 方法學考察

2.3.1基質效應考察

對空白毛發(fā)提取液直接添加苯丙胺類藥物混合標準溶液,測定其基質效應(ME)[22]?；|效應=空白毛發(fā)基質提取液加標離子響應強度/對應濃度混合標準溶液離子響應強度×100%。ME大于100%,表示存在基質增強效應;ME小于100%,表示存在基質抑制效應。本方法中4種苯丙胺類藥物的基質效應為93.2%～109.8%,結果表明,毛發(fā)基質對于目標化合物的檢測未產生明顯的基質增強或基質抑制效應。

2.3.2線性范圍、檢出限和定量限

在優(yōu)化的條件下,對制備的加標樣品(0.1、0.2、1、5、10、25、50、100、200 ng/mg)進樣測試。以4種苯丙胺類化合物的含量為橫坐標(x)、定量離子質譜信號強度為縱坐標(y),繪制標準曲線并計算線性回歸方程。4種苯丙胺類化合物的線性回歸方程和相關系數(shù)(R)等數(shù)據(jù)見表2。苯丙胺的線性范圍為1～25 ng/mg,甲基苯丙胺的線性范圍為1～100 ng/mg,其余兩種藥物的線性范圍為1～50 ng/mg,線性相關系數(shù)均大于0.99。以3倍信噪比計算檢出限(LOD)、10倍信噪比計算定量限(LOQ)。4種苯丙胺類化合物在毛發(fā)基質中的檢出限為0.1～0.2 ng/mg,定量限為1 ng/mg,均滿足司法鑒定規(guī)范[23]的檢出限閾值要求(0.2 ng/mg)。

表2 4種苯丙胺類化合物的線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients (R), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the four amphetamine-type compounds

2.3.3方法精密度

以4種苯丙胺類化合物的空白基質加標溶液(50 ng/mg)為樣品、質譜信號強度的相對標準偏差(RSD)為指標,考察方法的日內和日間精密度。供試樣品溶液在一日內連續(xù)重復進樣6次,測得日內精密度;連續(xù)3天,每天重復進樣6次,測得日間精密度,結果見表3。如表3所示,4種苯丙胺類藥物的日內精密度為4.14%～7.34%(n=6),日間精密度為3.71%～8.43%(n=6)。4種苯丙胺類化合物的日內精密度和日間精密度均在10%以內,表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。

表3 4種苯丙胺類化合物的日內和日間精密度(n=6)Table 3 Intra-day and inter-day precisions of the four amphetamine-type compounds (n=6)

2.3.4方法準確度

以加標回收率為指標考察實驗的準確度,準確稱量空白毛發(fā)樣品3份,分別加入低、中、高3個水平的苯丙胺混合標準溶液,測定4種苯丙胺類藥物的含量,計算加標回收率及其相對標準偏差,結果見表4。如表4所示,4種苯丙胺類化合物在毛發(fā)中的加標回收率為86.6%～114.7%,相對標準偏差為1.4%～10.8%,說明該方法的準確度能夠滿足苯丙胺類化合物的檢測要求?？瞻酌l(fā)加標(10 ng/mg)樣品的質譜圖見圖7。

圖7 4種苯丙胺類化合物加標(10 ng/mg)毛發(fā)樣品的一級和二級質譜圖Fig. 7 MS1 and MS2 spectra of the hair samples spiked with the four amphetamine-type compounds (10 ng/mg)

表4 4種苯丙胺類化合物在空白毛發(fā)基質中的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 4 Spiked recoveries and RSDs of the four amphetamine-type compounds in the blank hair matrix (n=6)

2.4 與其他方法的比較

司法鑒定規(guī)范(SF/Z JD0107025-2018)[23]的前處理方法如下:將毛發(fā)樣品依次用適量的水和丙酮振蕩洗滌兩次,晾干后剪成約1 mm的片段,置于冷凍研磨儀中粉碎,至呈粉末狀。稱取毛發(fā)粉末20 mg,加入1.0 mL甲醇,冰浴超聲30 min,離心后移取上清液,于60 ℃水浴空氣流下吹干,再用100 mL甲醇復溶,進儀器分析。與司法鑒定規(guī)范的樣品前處理相比,本方法省略了毛發(fā)樣品的干燥、超聲和濃縮等步驟,提高了檢測效率。司法鑒定規(guī)范的單一樣本處理時長約為1 h,本方法對單一樣品處理時間約為10 min,多樣品可批量處理操作,效率更高,檢測單一樣品用時小于20 s。傳統(tǒng)免疫膠體金法的靈敏度較低,甚至無法達到毛發(fā)中毒品檢測閾值的要求。因此,本方法具有操作簡便、快捷和準確的特點,能夠滿足4種苯丙胺類化合物的司法鑒定要求,有助于促進我國毒品快檢能力建設。

2.5 實際樣品檢測

用Pulsed-DC-ESI-便攜式質譜儀對來自浙江省某地公安局的實際毛發(fā)樣品進行檢測,以驗證本方法的適用性。在2 000份待測樣本中,檢出甲基苯丙胺陽性樣本5例,其余均為陰性樣本,本方法檢出的陽性樣本數(shù)與司法鑒定方法的檢測結果一致。此外,本方法未在甲基苯丙胺陽性樣本中檢測出甲基苯丙胺的代謝產物苯丙胺,這可能與甲基苯丙胺在毛發(fā)中主要以原藥形態(tài)存在有關,且苯丙胺在毛發(fā)中的含量較少,有研究[5]報道陽性樣本中苯丙胺與甲基苯丙胺含量的比率為0.015～0.384。

3 結論

本研究基于Pulsed-DC-ESI-便攜式質譜儀聯(lián)用平臺,優(yōu)化了Pulsed-DC-ESI離子源中電極與待測溶液的間距、噴霧電壓、樣品溶劑以及噴霧毛細管尖端內徑等參數(shù),開發(fā)了人體毛發(fā)中4種苯丙胺類藥物的快速檢測方法。經方法學驗證,該方法具有檢出限低、準確和快速等特點。在實際樣品檢測中,本方法無需復雜的前處理和色譜分離過程,適合于毛發(fā)中4種苯丙胺類藥物的快速檢測分析。針對大型質譜儀無法便攜移動、樣品前處理耗時長、傳統(tǒng)快檢方法定量能力不足等問題,本方法提供了有效的替代方案,能夠同時滿足快速檢測和定性、定量的需求,有助于提高一線緝毒現(xiàn)場對毒品的快速檢測能力。