吳麗娟, 楊麗莉, 胡恩宇, 王美飛, 楊 超, 尹明明

(1. 江蘇省南京環(huán)境監(jiān)測中心, 江蘇 南京 210041; 2. 江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心, 江蘇 南京 210041)

苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物均屬于芳香胺類化合物,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、樹脂、橡膠、塑料、清漆等藥物和工業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)過程,同時也是殺蟲劑、高分子材料、炸藥等重要化工產(chǎn)品的合成原料。近年來在大氣、地下水、河流、土壤和底泥中已發(fā)現(xiàn)苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物的殘留,這類污染物含量低、分布廣、毒性大,對環(huán)境和生物構(gòu)成極大危害。部分苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物被報道具有“三致”(致癌、致畸、致突變)效應(yīng),如苯胺和聯(lián)苯胺已被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)列為致癌物[1]。我國針對苯胺類及聯(lián)苯胺類化合物的控制主要集中于水質(zhì)和食品等,目前僅在《土壤環(huán)境質(zhì)量 建設(shè)用地土壤污染風(fēng)險管控標準(試行)》(GB 36600-2018)[2]中規(guī)定了土壤中苯胺和3,3′-二氯聯(lián)苯胺的篩選值與管制值。

苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物分子中的氨基含有孤對電子,其反應(yīng)活性較高[3],在復(fù)雜的土壤基質(zhì)中檢測難度較大?，F(xiàn)行的《土壤和沉積物 13種苯胺類和2種聯(lián)苯胺類化合物的測定 液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法》(HJ 1210-2021)采用內(nèi)標校正法進行結(jié)果計算,該方法所選擇的內(nèi)標指示物需要與目標化合物相匹配,并具有相近的加標回收率,否則會直接影響定量結(jié)果[4]。文獻方法大多采用經(jīng)典的索氏提取、加速溶劑提取(ASE)等液固提取方法[5-10],檢測手段有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等[11-16]。苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物容易被氧化,采樣后的保存問題對其后期的提取與測定有著明顯的影響,但目前在土壤介質(zhì)中多種苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物的分析中未見提及。

本文通過直接將土壤樣品保存于還原性鹽水溶液中,全部用于后期提取,再將目標化合物從固相轉(zhuǎn)移至水相再轉(zhuǎn)移至有機相中,一并解決了樣品的保存、抗氧化、土壤含水率影響等難題。該方法樣品保存效果好,操作簡單,精密度和回收率能夠滿足實際樣品的測定要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國安捷倫科技公司),配備電子轟擊(EI)電離源;頻率可調(diào)的ZP-500水平振蕩裝置(上海華鄰實業(yè)有限公司); TGL16M臺式離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司); AutoVap S8 Plus氮吹濃縮儀(美國ATR公司); XW-80A渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇(色譜純,德國Merck公司),弗羅里硅土固相凈化柱(1 g/6 mL,美國Supelco公司),實驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備,其余試劑均為市售分析純。

苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物單標溶液,包括苯胺、4-甲基苯胺、2-甲基苯胺、3-甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、2,6-二甲基苯胺、2-甲氧基苯胺、3-氯苯胺、4-氯苯胺、3-硝基苯胺、2-萘胺、4-硝基苯胺、聯(lián)苯胺、3,3′-二氯聯(lián)苯胺共14種組分,5 000 mg/L,購自北京曼哈格生物科技有限公司;用甲醇將以上單標溶液配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的混合標準工作溶液。內(nèi)標苯胺-d5和苊-d10(2 000 mg/L),購自美國Accustandard公司;用甲醇將兩種內(nèi)標配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的混合內(nèi)標標準溶液。替代物4-氯苯胺-d2,購自加拿大CDN Isotopes公司;在精確稱量后用甲醇溶解,并配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的替代物標準溶液。所有標準溶液在4 ℃下密閉避光保存。

1.2 工作溶液的配制

移取適量的14種苯胺類和聯(lián)苯胺類混合標準工作溶液及替代物標準溶液,用乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶4, v/v)配制成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0、10、50、100 mg/L的系列混合標準溶液。向系列混合標準溶液中分別加入適量混合內(nèi)標標準溶液,配制成內(nèi)標化合物質(zhì)量濃度為10 mg/L的系列工作溶液。

1.3 樣品采集和前處理

1.3.1樣品采集

在40 mL棕色具塞玻璃樣品瓶中預(yù)先加入20 mL 5%亞硫酸鈉水溶液,采集約10 g土壤樣品裝入瓶中,蓋緊蓋子,上下振蕩使溶液覆蓋所有樣品,并于4 ℃以下密閉避光保存。

1.3.2樣品提取

將樣品瓶在渦旋振蕩器上進行渦旋分散,直至樣品在5%亞硫酸鈉水溶液中呈泥漿狀,之后將樣品全部轉(zhuǎn)移至錐形瓶中;用10 mL 3 mol/L的氫氧化鈉溶液分兩次蕩洗樣品瓶,將蕩洗溶液合并至錐形瓶中;在錐形瓶中加入10 μL替代物標準溶液和2 g氯化鈉,再加入30 mL乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶4, v/v),置于水平振蕩裝置中,振蕩頻率保持在250 r/min以上,以保證三相能夠完全均勻分散;振蕩20 min后再全部轉(zhuǎn)移至100 mL離心管中,以3 000 r/min離心10 min,將液相部分全部轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,并分離出有機相;向分液漏斗中加入30 mL乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶4, v/v)再進行一次提取,合并有機相,并用無水硫酸鈉脫水后,將提取液濃縮至約1 mL,加入5 mL正己烷,待凈化。

1.3.3樣品凈化

將弗羅里硅土固相凈化柱分別用5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷沖洗、平衡,待凈化柱充滿正己烷后關(guān)閉流速控制閥,浸潤5 min,緩慢打開控制閥,棄去流出液。待正己烷流至近干時,將待凈化的提取液轉(zhuǎn)移至凈化柱內(nèi),棄去濾液,用10 mL乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶4, v/v)洗脫,接收洗脫液并濃縮至約1 mL,加入混合內(nèi)標標準溶液,使內(nèi)標質(zhì)量濃度為10 mg/L,再用乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶4, v/v)定容至1 mL,待測定。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

Agilent DB-35MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);柱溫60 ℃,保持2 min,以5 ℃/min升溫至130 ℃,然后以30 ℃/min升溫至300 ℃,保持4 min;進樣口溫度250 ℃;載氣為高純氦氣(99.999%),柱內(nèi)流量采用恒流控制,流速1.0 mL/min;分流進樣,分流比5∶1,進樣量1 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:EI源;離子源溫度:300 ℃;離子化能量:70 eV;接口溫度:300 ℃;四極桿溫度:150 ℃;質(zhì)譜掃描范圍m/z45～550;溶劑延遲時間:5 min;數(shù)據(jù)采集模式:全掃描(Scan)。14種目標化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 14種目標化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the 14 target compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

由于苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物具有一定的極性,兩對同分異構(gòu)體(2-甲基苯胺和4-甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺和2,6-二甲基苯胺)在弱極性的毛細管柱上無法分開,且其余組分的峰形存在拖尾現(xiàn)象。選擇中等極性色譜柱,在優(yōu)化的柱溫條件下,14種目標化合物可以得到良好的分離,且峰形更加對稱和尖銳。14種苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 14種苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物、替代物及內(nèi)標的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the 14 aniline and benzidine compounds, alternative and internal standards Peak identifications: 1. aniline-d5; 2. aniline; 3. p-toluidine; 4. o-toluidine; 5. m-toluidine; 6. 2,4-xylidine; 7. 2,6-xylidine; 8. o-anisidine; 9. m-chloroaniline; 10. p-chloroaniline-d2; 11. p-chloroaniline; 12. acenaphthene-d10; 13. m-nitroaniline; 14. 2-naphthalenamine; 15. p-nitroaniline; 16. benzidine; 17. 3,3′-dichlorobenzidine.

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1樣品提取方法的選擇

土壤中有機污染物常用的提取方法有索氏提取、微波提取、加速溶劑提取、超聲波提取等,這些方法都是利用有機溶劑對目標物的溶解進行提取。為了消除土壤基質(zhì)中水分的影響,常用風(fēng)干法或化學(xué)試劑干燥法對土壤樣品進行脫水。由于苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物的分子結(jié)構(gòu)中存在氨基,增大了目標物的極性和不穩(wěn)定性,常用的提取方法在干燥和提取操作過程中受水分含量、氧化降解的影響較大,提取效率不高。

近年來,加速溶劑提取是土壤中有機污染物提取應(yīng)用較多的方式,其具有快速、高效的優(yōu)勢,在很多研究和標準方法中都有著廣泛的應(yīng)用[17,18]。實驗比較了各目標化合物采用不同提取溶劑經(jīng)ASE提取后的回收率,結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用二氯甲烷、甲醇、四氫呋喃、乙酸乙酯及丙酮的提取效果均不理想。分析其原因,一方面,土壤基質(zhì)對苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物有著較強的吸附能力,僅使用常用的有機溶劑進行提取時效果均不理想;另一方面,苯胺類化合物在空氣中容易被氧化,在提取過程中會發(fā)生降解,因而導(dǎo)致回收率偏低。為了解決以上兩個問題,在土壤樣品中同時加入堿性水相和提取有機相,通過激烈振蕩使得三相充分分散混勻,將土壤中所含苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物從水相轉(zhuǎn)移至有機相中,14種目標化合物均獲得了較好的提取效果,不同提取方式下14種目標化合物的回收率結(jié)果見表2。此外,實驗比較了硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉和抗壞血酸的抗氧化效果,加入硫代硫酸鈉和抗壞血酸后,目標化合物的回收率分別為66.2%～86.5%和69.6%～92.0%,加入亞硫酸鈉后目標化合物的回收率為80.5%～90.5%,可見在提取的同時加入抗氧化劑能夠有效防止目標化合物的氧化降解。

表2 不同提取方式下14種目標化合物的回收率Table 2 Recoveries of the 14 target compounds under different extraction methods

2.2.2樣品采集和保存方法的優(yōu)化

苯胺類化合物具有易氧化的特性,因此樣品在采集后需要合適的保存方式來抑制目標化合物的氧化。一般密閉冷藏保存的氧化抑制效果較差,HJ 1210-2021中提到,在4 ℃以下冷藏保存,大部分化合物可延長保存期限至24 h,冷凍保存化合物可延長保存期限至4～28 d。雖然冷凍保存可延長保存期限,但對于現(xiàn)場采樣后需要立即冷凍的要求,操作上非常不便,所以保存方法優(yōu)化實驗均在4 ℃以下冷藏進行。實驗首先考察了樣品直接冷藏、加入固體亞硫酸鈉攪拌后冷藏及利用純水隔絕空氣后冷藏的保存效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),利用純水隔絕空氣的方式進行冷藏保存時,樣品的抗氧化效果較好,明顯優(yōu)于直接冷藏或加入固體亞硫酸鈉攪拌后冷藏。但這3種條件在冷藏保存了24 h及96 h內(nèi),仍然存在部分組分回收率過低的情況。在提取過程的優(yōu)化中,加入亞硫酸鈉的抗氧化效果最佳,因此在隔絕空氣的基礎(chǔ)上,考察了20%和5%亞硫酸鈉水溶液作為保存劑時對14種目標化合物回收率的影響。結(jié)果表明,二者抗氧化效果相當,但由于20%亞硫酸鈉水溶液為近飽和溶液,其溶解度受溫度影響較大且需超聲溶解,最終采用5%亞硫酸鈉水溶液直接在采樣現(xiàn)場加入的方式,保存期限可達7天,可以一并解決保存和后續(xù)的提取問題。不同保存方式下14種目標化合物和替代物的回收率見表3。在此實驗基礎(chǔ)上,以40 mL棕色具塞玻璃樣品瓶作為容器,加入20 mL 5%亞硫酸鈉水溶液,現(xiàn)場采集約10 g樣品加入其中,在低于4 ℃的條件下進行運輸和冷藏保存,在樣品提取時全部轉(zhuǎn)移至提取容器中。

表3 不同保存方式下14種目標化合物和替代物的回收率Table 3 Recoveries of the 14 target compounds and the alternative under different storage methods

2.2.3提取溶劑及相比的選擇

苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物多為弱堿性物質(zhì),在堿性條件下萃取效率較高,因此提取時需保證水相部分pH>12。土壤基質(zhì)中含有各種鹽類,具有一定的緩沖能力,通過試驗加入堿性溶液的體積和濃度,最后確定加入10 mL 3 mol/L的NaOH溶液,有利于將苯胺類化合物分配轉(zhuǎn)移至有機相中。實驗還考察了二氯甲烷和不同體積比的乙酸乙酯-二氯甲烷(2∶1、1∶4, v/v)對14種目標化合物的提取效果。結(jié)果表明,乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶4, v/v)的提取效果最佳,不僅提取效率高,且易于分離和濃縮。由于采樣環(huán)節(jié)包含了20 mL的水相部分,為了保證有機相的萃取效果和分離的方便性,應(yīng)盡量控制兩相的比例和總體積。因此,最終確定加入30 mL乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶4, v/v),其與水相的體積比約為1∶1,用100 mL離心管分離。由于不同目標化合物在相與相之間的分配系數(shù)存在差異,實驗發(fā)現(xiàn)個別極性較強的化合物經(jīng)一次提取后的回收率較低,為了簡化操作步驟,僅增加對水相的二次萃取,可使各目標化合物的回收率達到70%以上。

2.2.4鹽析作用的影響

由于土壤含有一定的有機質(zhì)和緩沖鹽,在堿性條件下分散提取時可能產(chǎn)生乳化現(xiàn)象,加入氯化鈉可增加水相溶液的離子強度,通過鹽析作用降低目標物的溶解度,從而使14種目標化合物的回收率得到明顯提高。實驗結(jié)果表明,加入2 g以上的氯化鈉能達到較好的鹽析效果,離心分離棄去土壤固相后,剩余的水相和有機相分層更加明顯,14種目標化合物和替代物的回收率結(jié)果見表4。

表4 鹽析對14種目標化合物和替代物回收率的影響Table 4 Effects of salting-out on the recoveries of the 14 target compounds and the alternative

2.2.5樣品凈化方式的選擇

本方法采用在堿性條件下進行樣品萃取的方式,以實現(xiàn)目標化合物的選擇性萃取,并起到一定的凈化作用。萃取所得到的濃縮液顏色明顯比ASE萃取濃縮液淺,通過比較全掃描質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn),雜質(zhì)出峰數(shù)量也明顯減少,基線響應(yīng)低。雖然土壤基質(zhì)復(fù)雜,采用質(zhì)譜檢測器選擇定量離子進行積分仍然可以較好地實現(xiàn)目標化合物的定性和定量,但對于有機質(zhì)含量特別高的土壤,連續(xù)地對其進行進樣分析,萃取液中的高沸點雜質(zhì)可能會影響色譜柱性能,特別是影響極性較大的目標物的峰形,進而干擾測定。針對上述問題,選擇固相凈化小柱對萃取液進行凈化[19,20],通過篩選C18、弗羅里硅土、HLB等常用凈化柱發(fā)現(xiàn),C18與HLB柱對部分目標化合物的保留效果較差,最終確定先在萃取濃縮液中加入正己烷調(diào)節(jié)極性,之后利用弗羅里硅土凈化柱對萃取液進行凈化。實驗比較了乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶4, v/v)、二氯甲烷、甲醇等洗脫溶劑對14種目標化合物回收率的影響,最終選擇乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶4, v/v)作為洗脫溶劑,以避免進樣溶劑歧視效應(yīng),凈化后14種目標化合物的回收率為88.3%～99.5%。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1校準曲線、方法檢出限和定量限

采用優(yōu)化的方法分析系列質(zhì)量濃度的工作溶液,繪制校準曲線。按照目標化合物總離子流色譜圖的出峰順序,苊-d10之前出峰的目標物以苯胺-d5為內(nèi)標,苊-d10之后出峰的目標物以苊-d10為內(nèi)標。

參照《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168-2020)[21]確定方法檢出限(MDL)和定量限(LOQ),在10 g空白石英砂中加入苯胺類和聯(lián)苯胺類混合標準工作溶液,使目標物的含量為0.1～0.2 mg/kg。按照樣品分析步驟,進行7次空白加標平行試驗,并對結(jié)果進行統(tǒng)計計算。結(jié)果顯示,在0.5～100 mg/L內(nèi)各目標化合物的線性相關(guān)系數(shù)(R)均>0.999, MDL為0.02～0.07 mg/kg, LOQ為0.08～0.28 mg/kg,其中LOQ約為MDL的4倍,相關(guān)結(jié)果見表5。

表5 14種目標化合物及替代物的校準曲線、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限Table 5 Calibration curves, correlation coefficients (R), method detection limits (MDLs) and limits of quantification (LOQs) of the 14 target compounds and the alternative

2.3.2回收率和精密度

在陰性黃壤土和稻田土實際樣品中分別添加含量為1 mg/kg和10 mg/kg的14種目標化合物,進行加標回收試驗。稻田土加標前后的總離子流色譜圖見圖2。重復(fù)6次實驗,計算加標回收率和相對標準偏差(RSD)。實際樣品中苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物的平均加標回收率為62.9%～101.0%,對應(yīng)的RSD為3.8%～10.3%,相關(guān)結(jié)果見表6。在相同加標水平下,將本方法與HJ 1210-2021進行比對。根據(jù)計算結(jié)果,雙側(cè)檢驗統(tǒng)計概率值(Pvalue)>顯著性水平(α)=0.05,表明本方法與HJ 1210-2021無顯著性差異(P>0.05),精密度和回收率均較好,能夠滿足土壤中苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物的分析要求。

圖2 稻田土樣品在(a)加標前和(b)加標后的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatograms of paddy soil samples (a) before and (b) after spiking the standards Peak Nos. were the same as those in Fig. 1.

表6 實際土壤樣品中14種目標化合物及替代物的回收率和精密度(n=6)Table 6 Recoveries and precisions of the 14 target compounds and the alternative in actual soil samples (n=6)

2.4 實際樣品分析

利用本文所建立方法對江蘇某工業(yè)企業(yè)疑似苯胺污染地塊土壤進行了檢測,共檢出苯胺及2-甲基苯胺兩種化合物,含量分別為1.14 mg/kg和1.27 mg/kg,每個樣品重復(fù)測定兩次,相對偏差(RD)分別為4.4%和5.2%,檢出結(jié)果與生產(chǎn)調(diào)研情況吻合。從現(xiàn)場采樣到實驗室分析都表明,本方法具有實用、操作易行等特點,能夠滿足我國土壤中苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物監(jiān)測分析的要求。

3 結(jié)論

本文建立了氣相色譜-質(zhì)譜測定土壤中14種苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物的分析方法,優(yōu)化了樣品提取方式、保存及凈化方法,評估了方法學(xué)指標,并成功應(yīng)用于實際樣品的測定。本方法利用加入抗氧化劑的方式簡單、有效地抑制了苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物的氧化,回收率高,穩(wěn)定性好,操作簡便且易于推廣,可滿足土壤中苯胺類和聯(lián)苯胺類化合物的測定需求,并為現(xiàn)階段土壤中該類污染物的調(diào)查研究提供了技術(shù)支撐。