趙倩茹, 劉 驊, 孟雅萍, 李 翔, 高瑞芳, 李祥勝

(安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 安徽 合肥 230051)

糖皮質(zhì)激素為一類由腎上腺皮質(zhì)中束狀帶分泌的甾體激素,具有抗炎作用,是皮膚科的常用藥物[1]。長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素可能導(dǎo)致激素依賴性皮炎、柯興綜合征等不良反應(yīng),甚至引起高血壓、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥等嚴(yán)重?fù)p傷[2-4]。我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)[5]及歐盟《化妝品法規(guī)1223/2009》[6]等都將糖皮質(zhì)激素列為禁用原料,某些商家為了牟利在化妝品中非法添加糖皮質(zhì)激素,以期快速實(shí)現(xiàn)美白、祛斑、消炎等效果,因此導(dǎo)致“激素臉”、“大頭娃娃”等惡性事件的發(fā)生[7,8]。更為嚴(yán)重的是,不法商家為了逃避監(jiān)管往往非法添加法定檢驗(yàn)方法以外的激素,為了更好地保障消費(fèi)者權(quán)益,亟需建立種類更加全面的激素檢測(cè)方法,為監(jiān)管部門提供技術(shù)支撐。

近年來關(guān)于化妝品中糖皮質(zhì)激素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[9]、超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(UPLC-HRMS)[10-12]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[13-23]等。HPLC普及率高,但靈敏度不夠且無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量的篩查,已經(jīng)較少用于化妝品中禁用成分的檢測(cè)。UPLC-HRMS分辨率高,但儀器昂貴,數(shù)據(jù)分析復(fù)雜,推廣仍有難度[24,25]。UPLC-MS/MS靈敏度高,專屬性強(qiáng),且適用于高通量分析,是目前糖皮質(zhì)激素檢測(cè)的主流方法。目前報(bào)道的化妝品中糖皮質(zhì)激素的前處理方法有固相萃取法[13,14,16,20-22]、QuEChERS法[15,19]、溶劑分散提取法[5,10-12,17,18,23]等,前兩種方法可以在一定程度上減少化妝品復(fù)雜基質(zhì)帶來的干擾,但吸附劑在吸附雜質(zhì)的同時(shí)也會(huì)吸附待測(cè)物,尤其當(dāng)待測(cè)組分較多時(shí),難以滿足所有化合物的回收率要求,并且前處理復(fù)雜、耗時(shí),檢測(cè)效率低下。

現(xiàn)行已出臺(tái)的化妝品中糖皮質(zhì)激素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法中,GB/T 24800.2-2009[20]包括41種糖皮質(zhì)激素,SN/T 2533-2010[21]包括17種糖皮質(zhì)激素,SN/T 4504-2016[22]包括3種糖皮質(zhì)激素,已納入《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)[5]的國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2019年第66號(hào)通告包括50種糖皮質(zhì)激素,GB/T 40145-2021[23]包括11種糖皮質(zhì)激素。為了保障用妝安全,日常監(jiān)督檢驗(yàn)中需要對(duì)化妝品進(jìn)行多種糖皮質(zhì)激素的篩查,但上述各標(biāo)準(zhǔn)的前處理方法各異,樣品需要處理多次再分別上機(jī)分析,耗時(shí)耗力,嚴(yán)重制約工作效率。本研究工作在前期調(diào)研的基礎(chǔ)上,增加了部分現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍外的糖皮質(zhì)激素,并對(duì)前處理方法、質(zhì)譜條件及色譜分離條件等進(jìn)行優(yōu)化,建立了UPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)化妝品中83種糖皮質(zhì)激素的高通量檢測(cè)方法,與現(xiàn)行檢測(cè)方法相比,靈敏度更高,檢測(cè)范圍更廣,且前處理更簡(jiǎn)單方便,有利于提高大批量篩查的工作效率,提高問題產(chǎn)品的發(fā)現(xiàn)率,更好地保障消費(fèi)者的用妝安全,為化妝品日常監(jiān)督提供可靠的技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜和Xevo TQ-S質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司); XP205電子分析天平(瑞士Mettler公司); Milli-Q全自動(dòng)純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司);渦旋儀(德國(guó)IKA公司); TGL-20000cR高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠); P180H超聲儀(德國(guó)Elma公司)。

83種糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品,純度均大于96%,分別購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院、美國(guó)藥典委員會(huì)、德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司和加拿大TRC公司。乙腈、乙酸(色譜純,美國(guó)ThermoFisher公司);實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q全自動(dòng)純水機(jī)制備的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取83種糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品適量(精確到0.01 mg),用乙腈溶解并定容至刻度,配制成1 000 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,保存于-20 ℃冰箱。

分別精密吸取單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液;精密吸取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用基質(zhì)空白提取溶液定容,配制2～200 μg/L的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品處理

1.3.1樣品前處理

精密稱取0.2 g(精確到0.01 mg)均勻試樣于10 mL聚丙烯離心管中,加入少量乙腈,于渦旋混合器上渦旋30 s使樣品分散均勻,再加入乙腈至近刻度,超聲提取20 min,靜置至室溫,用乙腈定容至刻度,搖勻,以10 000 r/min離心5 min,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,濾液作為樣品溶液。

1.3.2基質(zhì)空白提取溶液

精密稱取0.2 g(精確到0.01 mg)空白試樣于10 mL聚丙烯離心管中,按照1.3.1節(jié)操作處理,即得基質(zhì)空白提取溶液,用于配制系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 分析條件

色譜柱:Thermo Accucore PFP色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);流動(dòng)相A: 0.1%(v/v)乙酸乙腈,流動(dòng)相B: 0.1%(v/v)乙酸水溶液;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣體積:1 μL;柱溫:30 ℃;梯度洗脫程序:0～8 min, 26%A; 8～13 min, 26%A～28%A; 13～17 min, 28%A～30%A; 17～20 min, 30%A～38%A; 20～22 min, 38%A～42%A; 22～24 min, 42%A～55%A; 24～26 min, 55%A; 26～28 min, 55%A～80%A; 28～30 min, 80%A; 30～30.1, 80%A～26%A; 30.1～35 min, 26%A。

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描;檢測(cè)模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;毛細(xì)管電壓:2.5 kV;脫溶劑氣流速:800 L/h;脫溶劑氣溫度:600 ℃;進(jìn)樣錐氣體流速:100 L/h;離子源溫度:150 ℃。其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 83種糖皮質(zhì)激素的保留時(shí)間、質(zhì)譜參數(shù)和lg Kow值Table 1 Retention times, MS parameters and lg Kow of the 83 glucocorticoids

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源下,分別灌注100 μg/L的激素標(biāo)準(zhǔn)溶液,用正、負(fù)離子模式分別掃描,發(fā)現(xiàn)83種糖皮質(zhì)激素均在正離子模式下響應(yīng)較高。在正離子模式下,對(duì)待測(cè)物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描,83種糖皮質(zhì)激素的基峰離子均為準(zhǔn)分子離子[M+H]+,再對(duì)待測(cè)物進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,選擇兩個(gè)特征碎片,并且優(yōu)化碰撞能量,確定83種糖皮質(zhì)激素的MRM參數(shù),選擇響應(yīng)最大的碎片離子為定量離子,次級(jí)響應(yīng)碎片離子為定性離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

糖皮質(zhì)激素是以環(huán)戊多氫菲為母核的一系列化合物,83種待測(cè)化合物中有12組共32個(gè)化合物的相對(duì)分子質(zhì)量相同,其中27個(gè)為同分異構(gòu)體,母離子和子離子的質(zhì)荷比(m/z)完全相同,單憑質(zhì)譜不能實(shí)現(xiàn)定性判斷,因此實(shí)現(xiàn)色譜分離是解決同分異構(gòu)體準(zhǔn)確定性并定量問題的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)分別考察了Waters BEH C18(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Waters CSH C18(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Thermo Accucore PFP(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)3種色譜柱對(duì)分離的影響。前兩種色譜柱對(duì)待測(cè)物均有較好的保留,但難以實(shí)現(xiàn)倍他米松、地塞米松等差向異構(gòu)體的基線分離。Thermo Accucore PFP色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)是以五氟苯基為固定相的色譜柱,苯環(huán)上的氟原子可以增強(qiáng)鍵合相和分析物之間的π-π相互作用、偶極-偶極作用及電荷轉(zhuǎn)移作用,從而提高對(duì)待測(cè)物的保留和選擇性,尤其對(duì)同分異構(gòu)體有優(yōu)異的選擇性。結(jié)果顯示,相較于前兩種色譜柱,Thermo Accucore PFP色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)可以明顯提高同分異構(gòu)體的分離度,因此本次實(shí)驗(yàn)選用Thermo Accucore PFP色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)為分析柱。

在電噴霧正離子模式下,酸性環(huán)境可以提高待測(cè)物的質(zhì)子化效率,從而提高響應(yīng),故在選定的色譜柱條件下,考察了0.1%(v/v)乙酸水溶液-乙腈、0.1%(v/v)乙酸水溶液-0.1%(v/v)乙酸乙腈、0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈、0.1%(v/v)甲酸水溶液-0.1%(v/v)甲酸乙腈4種流動(dòng)相體系,結(jié)果表明,0.1%(v/v)乙酸水溶液-0.1%(v/v)乙酸乙腈流動(dòng)相體系下83種糖皮質(zhì)激素均能獲得較好的響應(yīng)和峰形。通過對(duì)梯度洗脫程序的優(yōu)化,可以實(shí)現(xiàn)所有同分異構(gòu)體的基線分離,83種糖皮質(zhì)激素的分布較為均勻。12組具有相同相對(duì)分子質(zhì)量的糖皮質(zhì)激素分離情況見圖1。

圖1 具有相同相對(duì)分子質(zhì)量的12組糖皮質(zhì)激素的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the 12 groups of glucocorticoids with same relative molecular massesFor peak Nos., see Table 1.

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

目前化妝品中糖皮質(zhì)激素的提取方法主要有超聲提取法[5,10-13,16-19,21-23]和溶劑萃取法[12,14,15,20],提取溶劑普遍采用乙腈、甲醇等極性較強(qiáng)的溶劑,但本研究中涉及的糖皮質(zhì)激素種類較多,83種糖皮質(zhì)激素的lgKow值為0.83～4.86(具體見表1),范圍較寬,單一溶劑能否將所有組分提取完全有待考察。本實(shí)驗(yàn)以基質(zhì)最復(fù)雜的膏霜(o/w型)為對(duì)象,將83種糖皮質(zhì)激素以lgKow=4為界限分成兩組,分別比較了乙腈超聲提取、丙酮超聲提取、乙酸乙酯超聲提取、飽和氯化鈉分散后經(jīng)乙腈提取、飽和氯化鈉分散后經(jīng)丙酮提取、飽和氯化鈉分散后經(jīng)乙酸乙酯提取6種不同提取溶劑對(duì)回收率的影響,結(jié)果顯示對(duì)于lgKow值小于4的糖皮質(zhì)激素,乙腈為提取溶劑的峰形最好,隨著提取溶劑的極性減弱,與流動(dòng)相的相容性變差,曲安西龍、潑尼松龍等的溶劑效應(yīng)嚴(yán)重;對(duì)于lgKow值大于4的糖皮質(zhì)激素,隨著提取溶劑的極性減弱,少部分待測(cè)物的回收率略有提高,乙酸乙酯提取的回收率為70.4%～101.6%,丙酮提取的回收率為68.1%～101.2%,乙腈提取的回收率為77.1%～102.6%。綜合考慮,最終選用乙腈超聲提取83種糖皮質(zhì)激素,樣品只需前處理一次,節(jié)省溶劑且省時(shí)省力,更適合大批量樣品的篩查。圖2給出了lgKow值大于4的16個(gè)待測(cè)物的提取回收率差異。

圖2 不同提取溶劑對(duì)16種lg Kow值大于4的糖皮質(zhì)激素回收率的影響(n=6)Fig. 2 Effect of different extraction solvents on the recoveries of the 16 glucocorticoids with lg Kow greater than 4 (n=6)

前期查閱文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn),目前化妝品中激素的檢測(cè)方法大多采用對(duì)樣品進(jìn)行提取后再凈化的前處理方式[13-16,19-22],以減少化妝品復(fù)雜基質(zhì)帶來的干擾,但當(dāng)待測(cè)組分較多時(shí),凈化難免會(huì)損失待測(cè)組分。為探索最佳的前處理方式,本實(shí)驗(yàn)以基質(zhì)最復(fù)雜的膏霜(o/w型)為對(duì)象,在添加水平為0.2 μg/g的條件下,同時(shí)考察了固相萃取法(Oasis HLB固相萃取柱,3 mL/60 mg)、QuEChERS法(900 mg MgSO4+150 mg PSA+150 mg C18)和乙腈直接提取3種方式的提取回收率,結(jié)果表明,采用Oasis HLB固相萃取柱凈化時(shí),新戊酸氯可托龍、環(huán)索奈德、氫化可的松環(huán)戊丙酸酯的回收率較低,分別為42.3%、26.0%、47.0%,分析發(fā)現(xiàn),洗脫溶液甲醇未能將這3種組分完全洗脫,究其原因,這3種糖皮質(zhì)激素的極性較弱,甲醇的極性較強(qiáng),無(wú)法將其完全洗脫,造成了回收率偏低;進(jìn)一步比較了乙腈、甲醇、乙腈-甲醇(1∶1, v/v)3種洗脫液,結(jié)果無(wú)明顯差異,表明固相萃取法不適用本法的樣品凈化;采用QuEChERS法處理樣品時(shí),氫化可的松半琥酯、琥珀酸甲潑尼龍的回收率較低,分別為22.9%、24.1%,經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氫化可的松半琥酯、琥珀酸甲潑尼龍均含有羧基結(jié)構(gòu),為酸性化合物,PSA對(duì)其有吸附作用,而MgSO4在吸附水分的同時(shí)對(duì)這兩種組分也有極強(qiáng)的吸附作用,造成回收率偏低,表明QuEChERS法也不適用本法的樣品凈化;采用乙腈直接提取的樣品回收率為74.5%～112.4%,可以滿足83種糖皮質(zhì)激素的回收率要求。圖3給出了10種典型糖皮質(zhì)激素的提取回收率差異,綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈直接提取為樣品的處理方式,既保證了提取回收率又簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過程,且檢測(cè)成本較低。

圖3 不同前處理方式對(duì)10種典型糖皮質(zhì)激素回收率的影響(n=6)Fig. 3 Effect of different pretreatment methods on the recoveries of 10 typical glucocorticoids (n=6)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)(ME)評(píng)價(jià)

采用LC-MS/MS尤其是電噴霧模式分析時(shí),待測(cè)物的離子化效率會(huì)受樣品基質(zhì)類型、前處理方法、儀器條件等因素的影響,因此使用LC-MS/MS須對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià),并采取適當(dāng)?shù)姆绞浇档突蛘哐a(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響。本實(shí)驗(yàn)以基質(zhì)最復(fù)雜的膏霜(o/w型)為考察對(duì)象,按照ME=(1-空白基質(zhì)溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值/純?nèi)軇┲写郎y(cè)物的響應(yīng)值)×100%計(jì)算ME。當(dāng)|ME|>50%時(shí),表示存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng),當(dāng)20%<|ME|≤50%時(shí),表示基質(zhì)效應(yīng)中等,當(dāng)|ME|≤20%時(shí),表示基質(zhì)效應(yīng)較弱[26]。結(jié)果表明,40.96%(34/83)的糖皮質(zhì)激素存在中等強(qiáng)度的基質(zhì)效應(yīng)。目前常用同位素內(nèi)標(biāo)、減少進(jìn)樣量、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線等方法來降低樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響,實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的定性定量分析。其中基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法效果良好,且操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用[27]。因此本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1線性范圍、檢出限和定量限

在優(yōu)化的色譜、質(zhì)譜條件下,對(duì)系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,以定量離子峰面積為縱坐標(biāo),相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明,83種糖皮質(zhì)激素在2～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.995。逐級(jí)稀釋系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以S/N≥3和S/N≥10確定83種糖皮質(zhì)激素的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.001～0.023 μg/g和0.002～0.076 μg/g。結(jié)果見表2。

表2 83種糖皮質(zhì)激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率、精密度和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equations, correlation coefficients (r), LODs, LOQs, recoveries, precisions and matrix effects (MEs) of the 83 glucocorticoids

2.5.2回收率和精密度

取0.2 g空白樣品,在低、中、高(分別為0.1、0.2、1 μg/g)3個(gè)添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)水平平行測(cè)定6次,計(jì)算得到平均回收率為74.5%～112.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～9.9%(n=6)。具體結(jié)果見表2。

2.5.3實(shí)際樣品測(cè)定

采用本法對(duì)41批市售化妝品進(jìn)行83種糖皮質(zhì)激素的篩查,結(jié)果共檢出4批陽(yáng)性樣品,檢出率達(dá)9.76%。其中1批檢出氟輕松,含量為6.54 μg/g; 1批檢出倍氯米松雙丙酸酯,含量為1.74 μg/g; 2批檢出醋酸地索奈德和地索奈德,醋酸地索奈德含量為0.53 μg/g和0.61 μg/g,地索奈德含量為560.85 μg/g和634.27 μg/g。本次檢出的氟輕松、倍氯米松雙丙酸酯及地索奈德在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)中的檢出限均為0.03 μg/g,本次檢出含量均高于檢出限,可判定為非法添加禁用組分,但醋酸地索奈德尚未列入法定檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),表明非法添加法定檢測(cè)方法外的糖皮質(zhì)激素的現(xiàn)象仍然存在,亟需制定篩查范圍更廣的標(biāo)準(zhǔn),保障消費(fèi)者的用妝安全。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中83種糖皮質(zhì)激素的高通量方法。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了色譜、質(zhì)譜參數(shù),實(shí)現(xiàn)了多組同分異構(gòu)體的基線分離。采用乙腈直接提取的前處理方式,簡(jiǎn)單高效,大大提高了監(jiān)督檢驗(yàn)的工作效率,該方法可用于水、乳、膏霜(o/w型)基質(zhì)化妝品中83種糖皮質(zhì)激素的篩查確證和定量分析,是對(duì)現(xiàn)行《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中激素檢測(cè)方法的補(bǔ)充,可為化妝品的日常監(jiān)管提供快速、高效、靈敏可靠的高通量檢測(cè)方法。