郝樹芹，張芙蓉，趙 凱，付 蕾，李 悅，張?zhí)鹛?/p>

（山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100）

丹參(Salvia miltiorrhiza)是唇形科鼠尾草屬中的多年生草本植物，又稱紅根、大紅袍，丹參偏好溫暖氣候，適宜栽種在土質(zhì)肥沃的砂質(zhì)土壤中[1]。丹參是《中國(guó)藥典》收載的法定藥物，為稀有名貴中藥材[2]。

傳統(tǒng)的丹參種植以無性根條繁殖技術(shù)為主，不僅繁殖系數(shù)低，而且種苗帶毒量高，同時(shí)有繁殖速度慢、產(chǎn)出數(shù)量少、品質(zhì)差的劣勢(shì)[3]。長(zhǎng)期以來丹參人工栽培生產(chǎn)只專注于栽培，不重視良種選育，使得品種質(zhì)量退化，品種混雜嚴(yán)重，藥材產(chǎn)量和質(zhì)量下降。臨床上應(yīng)用的丹參大都來源于人工種植，人工種植過程中高產(chǎn)栽培措施的應(yīng)用導(dǎo)致了丹參藥用成分下降，病毒侵染以及不可控的異花授粉也加重了丹參藥用成分含量的下降。丹參組織培養(yǎng)技術(shù)可以有效解決丹參快繁和種苗脫毒中面臨的問題[4]。

根據(jù)植物細(xì)胞全能型，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，以丹參根、莖、葉等器官為外植體，在一定條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分化為再生植株，可以快速有效獲得大量的丹參植株[5]。近年來，人們將植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用到丹參的外植體誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)中，為丹參優(yōu)質(zhì)品種推廣和擴(kuò)繁提供了種苗保障。申順先等[6]以丹參春生幼嫩枝條為外植體，得出最適的消毒方案是用75%乙醇處理30 s，0.1%升汞處理 8 min，與房師梅等[7]得出0.1%的升汞滅菌10 min效果最佳的結(jié)果有吻合。韋獻(xiàn)雅等[8]和張凱[9]發(fā)現(xiàn)，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L可以作為誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基配方。Shimomura K等[10]研究得出在培養(yǎng)基中添加吲哚-3-丁酸得出最高丹參酮產(chǎn)量，Miyagka H等[11]利用組織培養(yǎng)技術(shù)設(shè)計(jì)了一種用于生產(chǎn)隱丹參酮的改良培養(yǎng)基，都說明了丹參組織培養(yǎng)的重要性?？傮w來說，不同配比的激素對(duì)外植體離體分化起著關(guān)鍵的作用。想要將丹參快速繁殖應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，最重要一步在于生產(chǎn)品質(zhì)好、成本低的生產(chǎn)苗，這些關(guān)于丹參組培技術(shù)的研究,為丹參的快繁技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)[12]。

本研究以丹參帶節(jié)莖段為外植體，通過研究莖段消毒時(shí)間及不同濃度的植物生長(zhǎng)激素的配比對(duì)丹參誘導(dǎo)過程、擴(kuò)繁過程和生根過程的影響，選擇出最適宜的培養(yǎng)基配方，為丹參的組織培養(yǎng)提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為山東臨沂丹參種苗，試驗(yàn)于2023年2月至2023年5月在濟(jì)南普朗特農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

研究在不同消毒時(shí)間下，0.1%升汞對(duì)丹參外植體污染率的影響。選擇丹參幼嫩莖段節(jié)為外植體，用毛刷刷掉莖段表面灰塵，修剪成4.0 cm帶莖節(jié)的小段，分別用 1 min、5 min、10 min、15 min的0.1%升汞消毒（表1）。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，每個(gè)處理3次重復(fù)，20 d后記錄并統(tǒng)計(jì)丹參莖段的污染率和褐化率。

表1 丹參莖段消毒不同時(shí)間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 初代培養(yǎng)

誘導(dǎo)丹參腋芽培養(yǎng)：以MS為基本培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)基中添加不同濃度的NAA(0.1、0.3、0.5 mg/L)和 6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)，篩選出適合丹參莖段誘導(dǎo)腋芽的培養(yǎng)基配方，具體配方見表2。將消毒后的丹參有節(jié)莖段修剪成1.5 cm-2 cm，接種于已標(biāo)記序號(hào)的初代培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，每個(gè)處理3次重復(fù)。40 d后觀察并記錄出芽狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算誘導(dǎo)率。

表2 不同處理莖段誘導(dǎo)腋芽試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 繼代培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)基中添加不同濃度的 NAA(0.2、0.4、0.6 mg/L) 和 6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)，具體配方見表 3，篩選出適合丹參莖段繼代的培養(yǎng)基配方。選用初代培養(yǎng)中幼嫩、質(zhì)地顏色相近的帶節(jié)莖段，修剪成1.5 cm-2 cm，接種于已標(biāo)記序號(hào)的繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，每個(gè)處理3次重復(fù)。放置于培養(yǎng)架上，40 d后記錄叢生芽的生長(zhǎng)狀況和葉片狀況,統(tǒng)計(jì)并分析增殖系數(shù)。

表3 不同處理的繼代培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5 生根培養(yǎng)

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的 NAA（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L），具體配方見表4，篩選出適合誘導(dǎo)丹參生根的培養(yǎng)基配方。在繼代培養(yǎng)獲得的試管苗中，挑選莖干粗壯、葉色濃綠的高約3.0 cm的丹參幼苗，修剪黃葉，保留完整地上部，接種于已標(biāo)記序號(hào)的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種2株幼苗，每個(gè)處理3次重復(fù)，35 d后觀察丹參生長(zhǎng)狀況，記錄最早生根時(shí)間，統(tǒng)計(jì)并分析生根率、平均根長(zhǎng)、平均生根數(shù)。

表4 不同處理的生根培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Excel 2022記錄、整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，運(yùn)用LSD分析法，對(duì)各個(gè)處理間差異進(jìn)行顯著性分析。

污染率 （%）=（污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)）×100；

褐化率 （%）=（褐化外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)）×100；

誘導(dǎo)率 （%）=（成功莖段總數(shù)/接種的外植體總數(shù)）×100；

增值系數(shù)=增殖后的莖段數(shù)/接種莖段數(shù)；

生根率（%）=（生根總植株數(shù)/總接種數(shù)）×100；

平均生根數(shù)（%）=（總生根條數(shù)/總生根苗數(shù)）×100；

平均根長(zhǎng)（cm）=總根長(zhǎng)/總根數(shù)。

1.7 培養(yǎng)條件

光照強(qiáng)度為1500-2000 lx，光照時(shí)間為15 h/d，濕度為 80%，溫度為（25±2） ℃，瓊脂濃度 7 mg/L，pH 5.7。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒處理

由表5可見，在不同消毒時(shí)間下，對(duì)外植體的污染率、褐化率及生長(zhǎng)情況影響不同?？傮w來看，隨著升汞消毒處理變長(zhǎng)，丹參莖段的污染率先下降又上升，但褐化率上升后又下降。處理L3與處理L1和L2差異顯著，L3（10 min）處理污染率最低，為00.000%，培養(yǎng)基內(nèi)沒有雜菌菌落，外植體保持綠色；L1（1 min）處理污染率最高，為33.333%，培養(yǎng)基內(nèi)附著白色絨毛狀菌落，少數(shù)外植體變褐死亡。處理L4的污染率（7.407%）顯著低于處理L1，相比于處理L1，只有少數(shù)外植體上附著白色菌落。

表5 不同的消毒時(shí)間處理的影響

可見，消毒處理的時(shí)間不同消毒效果有差異。綜合外植體污染率與褐化率，準(zhǔn)確把握酒精和升汞處理時(shí)間，對(duì)外植體消毒過程至關(guān)重要。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹參莖段最佳消毒方案為75%乙醇消毒 30 s，0.1%HgCl2消毒 10 min。

2.2 初代培養(yǎng)基

根據(jù)表6、圖1所示，在不同濃度配比下的NAA與6-BA，對(duì)丹參莖段腋芽誘導(dǎo)率有影響。培養(yǎng)3 d后，處理M2和處理M5處理最早出嫩黃色芽；6 d后有各處理均有出芽；30 d后各個(gè)處理中腋芽生長(zhǎng)狀況有差異。在9個(gè)處理中，處理M2中芽體長(zhǎng)勢(shì)好，芽體壯為綠色，葉大，腋芽誘導(dǎo)率最高為 94.44%，且與處理 M3、M4、M5、M7、M8差異顯著。處理M6、M9腋芽誘導(dǎo)率分別為88.89%和83.33%，兩者差異不顯著，芽體長(zhǎng)勢(shì)較好。處理M8腋芽誘導(dǎo)率最低為39.90%，長(zhǎng)勢(shì)差，芽體弱為黃白色。

表6 不同濃度的激素配比對(duì)丹參莖段誘導(dǎo)的影響

圖1 不同濃度激素的配比對(duì)誘導(dǎo)腋芽的影響

綜合認(rèn)為，在初代培養(yǎng)階段，不同濃度的激素之間保持合理的配比才能有利于丹參腋芽誘導(dǎo)，激素配比不適宜會(huì)影響丹參莖段腋芽誘導(dǎo)率。試驗(yàn)結(jié)果表明，丹參莖段的初代培養(yǎng)基的最佳配方是MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，此時(shí)芽體長(zhǎng)勢(shì)好，芽體壯為綠色，葉大。

根據(jù)表7、圖2所示，不同濃度NAA與6-BA，對(duì)丹參繼代培養(yǎng)有影響，適宜濃度的6-BA、NAA有助于莖段的分化、增殖。在繼代9個(gè)處理中，處理N4的繼代苗生長(zhǎng)狀況表現(xiàn)為葉大，棕綠色，莖干粗，長(zhǎng)勢(shì)好，叢生芽數(shù)量多，增殖系數(shù)最高為12.83，與其他處理差異顯著。其次，處理N1和處理N2增殖系數(shù)均大于11.20，增殖苗長(zhǎng)勢(shì)較好，莖干較粗。 處理 N3、N5、N6、N7、N9 間不存在顯著差異，處理N3和N9增殖系數(shù)最低為8.56。

表7 不同濃度激素配比對(duì)丹參莖段繼代培養(yǎng)的影響

圖2 不同濃度激素配比對(duì)丹參繼代培養(yǎng)的影響

總體來看，當(dāng)6-BA濃度固定時(shí)，隨著NAA濃度增加，增值系數(shù)先上升后下降；當(dāng)NAA濃度固定時(shí)，隨著6-BA濃度增加，增值系數(shù)下降。綜合認(rèn)為，在繼代培養(yǎng)階段，不同濃度的激素之間保持合理的配比才能有利于丹參增殖苗生長(zhǎng)，激素配比不適宜都會(huì)導(dǎo)致繼代增殖緩慢。試驗(yàn)結(jié)果表明，丹參莖段的繼代培養(yǎng)基的最佳配方是MS+1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA，此時(shí)幼苗葉大，呈棕綠色，莖干粗，長(zhǎng)勢(shì)好，叢生芽多。

2.3 生根培養(yǎng)基

根據(jù)表8、圖3所示，不同濃度的NAA對(duì)丹參健壯芽苗的生根有不同影響。最早生根時(shí)間為8天，此時(shí)NAA濃度為0.2 mg/L；最晚生根時(shí)間為15天，此時(shí)NAA濃度為0.8 mg/L，可見高濃度NAA會(huì)延遲生根。處理S1的平均生根率是100.00%，平均根數(shù)為5.33，兩者顯著高于處理S2、S3、S4，植株生長(zhǎng)非常良好，根系多，粗長(zhǎng)，并且有次生根。處理S1平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)為0.64 cm，其次為處理S2，再次是處理S3，最后是處理S4，根長(zhǎng)為0.12 cm，與其他處理差異顯著。

表8 不同濃度激素對(duì)丹參生根的影響

圖3 不同濃度激素對(duì)丹參生根的影響

總體來看，隨著NAA濃度的提高，生根率、平均生根數(shù)和平均根長(zhǎng)都在下降，說明低濃度NAA對(duì)丹參芽苗生根有顯著影響，高濃度NAA對(duì)丹參芽苗生根有阻礙作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，丹參芽苗生根培養(yǎng)基的最佳配方是1/2 MS+0.2 mg/L NAA，此時(shí)根系粗長(zhǎng)，根系多，有次生根。

3 討論與結(jié)論

人工種植過程中高產(chǎn)栽培措施的應(yīng)用導(dǎo)致了丹參藥用成分下降，病毒侵染以及不可控的異花授粉也加重了丹參藥用成分含量的下降，因此，培育出高質(zhì)高量的丹參種苗，進(jìn)行丹參組織培養(yǎng)技術(shù)研究十分有必要。

在研究丹參組織培養(yǎng)技術(shù)過程中，獲得無菌外植體、控制雜菌污染是初代培養(yǎng)的關(guān)鍵所在。本試驗(yàn)得出最佳消毒處理的方案為75%乙醇消毒30 s，再用0.1%升貢溶液消毒10 min，與董靜靜[13]等的結(jié)論有吻合。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在0.1%升汞中消毒時(shí)間達(dá)到15 min，莖段長(zhǎng)勢(shì)較弱，可能是因?yàn)槁然谶M(jìn)入切口內(nèi)組織，且無菌水無法將其表面滅菌劑沖洗干凈，致使植物材料生長(zhǎng)受到影響。所以用升汞處理的時(shí)間過長(zhǎng)和過短都不適宜，時(shí)間過長(zhǎng)易造成外植體細(xì)胞死亡，時(shí)間過短消毒效果差。

在莖段腋芽誘導(dǎo)過程中，在培養(yǎng)基中添加了激素NAA與6-BA，結(jié)果表明，丹參莖段誘導(dǎo)腋芽培養(yǎng)基的最佳配方為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，但與田宇紅[14]等發(fā)現(xiàn)的結(jié)論，誘導(dǎo)叢生芽的最佳培養(yǎng)基配方是MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L有所差異，原因可能有：接種時(shí)采用的外植體大小、幼嫩程度不同；丹參產(chǎn)地和品種的不同；培養(yǎng)的時(shí)間和溫度導(dǎo)致誘導(dǎo)率不同。

繼代培養(yǎng)階段是對(duì)初代培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)材料進(jìn)行增殖，不斷分化形成新的完整植株、叢生苗，是丹參快繁的重要階段，通過“芽生芽”的方式進(jìn)行增殖，增值系數(shù)高，繁殖速度快。單芽苗、叢生苗多是從外植體的頂芽或腋芽直接萌發(fā)而來，芽苗變異小，性狀均一穩(wěn)定，用于丹參良種快繁十分有利。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，最佳的丹參繼代培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L，此時(shí)幼苗葉大，呈棕綠色，莖干粗，叢生芽多，生長(zhǎng)旺盛。試驗(yàn)表明，6-BA和NAA配合使用對(duì)叢生芽的生長(zhǎng)、莖段的增殖有影響，適宜濃度的配比有促進(jìn)作用。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，丹參幼苗生根培養(yǎng)基的最佳配方是1/2 MS+0.2 mg/L NAA，與梁宏偉[15]等發(fā)現(xiàn)結(jié)論一致。在此濃度下，植株根系粗長(zhǎng)，根系多，有次生根。試驗(yàn)表明，適宜濃度度NAA對(duì)丹參生根有顯著影響，高濃度NAA對(duì)丹參生根有阻礙作用。

以丹參具節(jié)莖段作為外植體，研究發(fā)現(xiàn)，最佳消毒方案為75%乙醇消毒30 s與0.1%升汞溶液消毒10 min。丹參莖段誘導(dǎo)腋芽的最佳方案為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L。丹參繼代培養(yǎng)的最佳配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L。丹參生根培養(yǎng)的最佳配方是1/2 MS+0.2 mg/L NAA。本研究以“芽生芽”的微體快繁技術(shù)提升丹參繁殖速度，獲得的種苗繁殖速度快、形狀優(yōu)良，保證了優(yōu)良種質(zhì)資源快速供應(yīng)。