柯慧 顏禮征 張宇 毛記龍 姚宇飛

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院海南省人類生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院海南省地方病（地中海貧血）臨床醫(yī)學(xué)研究中心，海南醫(yī)學(xué)院生殖健康與相關(guān)疾病研究與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院?？谑腥祟愡z傳資源保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（?？?570102）

卵巢低反應(yīng)（poor ovarian response，POR）是卵巢對(duì)促性腺激素反應(yīng)不良的病理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為促排卵周期發(fā)育的卵泡數(shù)量少、雌激素峰值低、促性腺激素用量多、周期取消率高、獲卵數(shù)少及妊娠率低。卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎的發(fā)育具有重要作用。顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)控卵泡的發(fā)育和閉鎖，此外，顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡受到多種細(xì)胞因子和蛋白的調(diào)控［1］。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的抑制因子，通過(guò)調(diào)控多種代謝、內(nèi)分泌信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子，去乙?；{(diào)節(jié)多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡［2］。SIRT1可抑制動(dòng)物始基卵泡發(fā)育的啟動(dòng)，減少始基卵泡向初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)化并抑制始基卵泡凋亡，有助于保留卵巢儲(chǔ)備功能，并且可以通過(guò)調(diào)控動(dòng)物顆粒細(xì)胞凋亡和類固醇激素合成關(guān)鍵酶的表達(dá)，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量。然而，目前這些研究大多數(shù)為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，SIRT1是否調(diào)控POR女性的卵巢顆粒細(xì)胞，影響卵子數(shù)量和質(zhì)量，進(jìn)而導(dǎo)致女性不孕仍未得到證實(shí)。

因此，探索SIRT1在POR發(fā)生中的分子機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)POR新的病因，有利于尋找新的診斷和治療策略，解決臨床治療中的難題。

白藜蘆醇（resveratrol，RESV）是目前活性最強(qiáng)的特異性SIRT1激動(dòng)劑，主要作用機(jī)制為RESV增加SIRT1對(duì)NAD+和乙?；孜锏挠H和力，增強(qiáng)乙?；孜锏娜ヒ阴；?，從而增強(qiáng)SIRT1活性［3-6］。EX527是目前活性最強(qiáng)的特異性吲哚類SIRT1抑制劑，主要作用機(jī)制為NAD+脫離后，EX527快速與SIRT1結(jié)合，抑制去乙?；孜锏慕怆x，有效抑制SIRT1的去乙?；富钚裕?-10］。因此，本研究分別選擇RESV和EX527作為SIRT1的特異性激活劑和抑制劑。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象本研究納入2021年10月至2022年3月于海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF/ICSI-ET助孕的女性共60例，其中卵巢低反應(yīng)（POR）組和卵巢正常反應(yīng)（normal ovarian response，NOR）組各30例，兩組女性年齡均分別一致。本課題已獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［批件號(hào)：2021（科研）第（86）號(hào)］，所有納入女性均已簽署書(shū)面的知情同意書(shū)。POR組和NOR組女性的基本情況見(jiàn)表1。

表1 POR組和NOR組女性的基本情況Tab.1 Characteristics of females in POR group and NOR group ±s

表1 POR組和NOR組女性的基本情況Tab.1 Characteristics of females in POR group and NOR group ±s

注：HCG示人絨毛膜促性腺激素；E2示雌二醇

項(xiàng)目年齡（歲）體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）HCG日E2水平（pmol/L）獲卵數(shù)P值-0.258＜0.001＜0.001 POR組32.26 ± 1.87 20.66 ± 0.89 2 370 ± 539 2.73 ± 0.45 NOR組32.26 ± 1.87 20.36 ± 1.11 11 502 ± 2 527 10.33 ± 1.88 t值-1.143-19.352-21.517

1.2 POR組納入和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡20～35歲；（2）竇卵泡數(shù)（antral follicle count，AFC） ≤ 5個(gè)或抗苗勒管激素（anti-Müllerian Hor-mone，AMH）＜1.1 ng/mL；（3）常規(guī)促排卵方案獲卵數(shù)≤ 3個(gè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有內(nèi)分泌疾病。

1.3 NOR組納入和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡20～35歲；（2）AFC 7～15個(gè)并且AMH 1.1～3.5 ng/mL；（3）月經(jīng)規(guī)律，周期25～35 d；（4）獲卵數(shù)7～15個(gè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有內(nèi)分泌疾病。

1.4 促排卵方案本研究納入的均為常規(guī)促排卵方案，NOR組均采用長(zhǎng)方案、POR組均采用拮抗劑方案。當(dāng)至少2個(gè)卵泡直徑達(dá)到18 mm時(shí)，給予人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）注射。注射后36 h在陰道超聲引導(dǎo)下行經(jīng)陰道穿刺取卵，并收集撿卵后剩余的卵泡液。

1.5 卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)和收集采用密度梯度離心法分離純化卵泡液中的顆粒細(xì)胞。收集撿卵后剩余卵泡液，室溫200 ×g，離心5 min。棄上清后加入含有0.2%透明質(zhì)酸酶的PBS，室溫消化30 min。將細(xì)胞懸液緩緩鋪在細(xì)胞分離液Ficoll -Paque表面，室溫150 ×g，離心20 min，吸取中間的白色顆粒細(xì)胞層，PBS洗滌。加入含有10%牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h后換液，去除未貼壁的顆粒細(xì)胞和血細(xì)胞［11］。

分別加入含100 μmol/L RESV或EX527的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后使用胰酶消化細(xì)胞，收集顆粒細(xì)胞。由于RESV和EX527粉末均選用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配置，因此對(duì)照組的培養(yǎng)液中同樣加入與藥物組等量的DMSO。

1.6 主要試劑和儀器DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，RESV和EX527、4，6-二氨基-2-苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）購(gòu)自Sigma公司，淋巴細(xì)胞分離液（FicollPaque PREMIUM）購(gòu)自Pharmacia公司，Trizol購(gòu)自Ambion公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購(gòu)自Takara公司，所有qPCR引物均由金唯智生物科技有限公司合成。蛋白Marker購(gòu)自Thermo公司，抗體購(gòu)自Abcam公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）試劑購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，雌二醇測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自SANYO公司，離心機(jī)和PCR儀（反轉(zhuǎn)錄）購(gòu)自Eppendorf公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)寶特公司，SDS-PAGE垂直電泳槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，核酸蛋白質(zhì)分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，蛋白質(zhì)濃縮儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)GE公司，熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.7 qPCR檢測(cè)mRNA水平顆粒細(xì)胞樣品中加入Trizol提取RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，依照qPCR試劑盒使用說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)SIRT1、StAR、CYP19、CYP17、β-actin基因的mRNA水平，每例樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。檢測(cè)基因的引物序列見(jiàn)表2。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)水平的差異。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白水平將顆粒細(xì)胞裂解液離心后收集上清液，測(cè)定蛋白濃度。將蛋白進(jìn)行凝膠電泳，80 V電泳50 min，120 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)剛出膠底部止。取出凝膠，100 V恒壓60～120 min轉(zhuǎn)膜。室溫下封閉1 h或4 ℃過(guò)夜，加入一抗稀釋液，4 ℃過(guò)夜或37 ℃孵育2 h，充分洗滌后，加入相應(yīng)的二抗稀釋液，37 ℃孵育1 h，充分洗滌后，將化學(xué)熒光發(fā)光底物均勻加到膜的表面，放至暗盒，顯影。掃描圖像，用Image J圖像分析系統(tǒng)分析蛋白條灰度值。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.9 TUNEL法檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡率于4孔板中培養(yǎng)顆粒細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌1次，加入含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min。PBS洗滌后加入TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育1 h。孵育結(jié)束后再用PBS洗滌3次，加入適量DAPI染色液，室溫放置5 min，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.10 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)培養(yǎng)液中雌二醇水平收集卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)液1 mL。采用雌二醇測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）處理培養(yǎng)液，檢測(cè)培養(yǎng)液中雌二醇水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組樣本間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 POR女性顆粒細(xì)胞SIRT1表達(dá)將卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行分離純化后進(jìn)行檢測(cè)，POR組和NOR組各檢測(cè)30例。qPCR結(jié)果表明POR組顆粒細(xì)胞SIRT1 mRNA水平顯著低于NOR組（圖1）。Western blotting結(jié)果同樣表明POR組SIRT1蛋白水平顯著低于NOR組（圖2）。

圖1 顆粒細(xì)胞中SIRT1 mRNA的表達(dá)水平Fig.1 The expression level of SIRT1 mRNA in granulosa cell

圖2 顆粒細(xì)胞中SIRT1蛋白的表達(dá)水平Fig.2 The expression level of SIRT1 protein in granulosa cell

2.2 RESV和EX527對(duì)POR女性顆粒細(xì)胞SIRT1表達(dá)的影響使用RESV或EX527分別處理30例POR組顆粒細(xì)胞，作用48 h后收集細(xì)胞，對(duì)照組為不使用藥物處理的顆粒細(xì)胞。qPCR結(jié)果表明RESV顯著上調(diào)顆粒細(xì)胞SIRT1 mRNA水平，EX527顯著下調(diào)SIRT1 mRNA水平（圖3）。Western blot結(jié)果同樣表明RESV顯著上調(diào)SIRT1蛋白水平，EX527顯著下調(diào)SIRT1蛋白水平（圖4）。

圖3 白藜蘆醇或EX527處理48 h后POR女性顆粒細(xì)胞SIRT1 mRNA的表達(dá)水平Fig.3 The expression level of SIRT1 mRNA to POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

圖4 白藜蘆醇或EX527處理48 h后POR女性顆粒細(xì)胞SIRT1蛋白的表達(dá)水平Fig.4 The expression level of SIRT1 protein in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

2.3 RESV和EX527對(duì)顆粒細(xì)胞類固醇激素合成關(guān)鍵酶表達(dá)的影響使用RESV或EX527分別處理30例POR組顆粒細(xì)胞，作用48 h后收集細(xì)胞，對(duì)照組為不使用藥物處理的顆粒細(xì)胞。qPCR結(jié)果表明RESV顯著上調(diào)顆粒細(xì)胞中類固醇激素合成關(guān)鍵酶（StAR、CYP19、CYP17）mRNA水平，EX527顯著下調(diào)類固醇激素合成關(guān)鍵酶mRNA水平（圖5-7）。Western blot結(jié)果同樣表明RESV顯著上調(diào)類固醇激素合成關(guān)鍵酶蛋白水平，EX527顯著下調(diào)類固醇激素合成關(guān)鍵酶蛋白水平（圖8-10）。

圖5 白藜蘆醇或EX527處理48 h后POR女性顆粒細(xì)胞StAR mRNA的表達(dá)水平Fig.5 The expression level of StAR mRNA in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

圖6 白藜蘆醇或EX527處理48 h后POR女性顆粒細(xì)胞CYP19 mRNA的表達(dá)水平Fig.6 The expression level of CYP19 mRNA in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

圖7 白藜蘆醇或EX527處理48 h后POR女性顆粒細(xì)胞CYP17 mRNA的表達(dá)水平Fig.7 The expression level of CYP17 mRNA in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

圖8 白藜蘆醇或EX527處理48 h后POR女性顆粒細(xì)胞StAR蛋白的表達(dá)水平Fig.8 The expression level of StAR protein in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

圖9 白藜蘆醇或EX527處理48 h后POR女性顆粒細(xì)胞CYP19蛋白的表達(dá)水平Fig.9 The expression level of CYP19 protein in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

圖10 白藜蘆醇或EX527處理48 h后POR女性顆粒細(xì)胞CYP17蛋白的表達(dá)水平Fig.10 The expression level of CYP17 protein in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

2.4 RESV和EX527影響SIRT1對(duì)POR女性顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控使用RESV或EX527分別處理30例POR組顆粒細(xì)胞，作用48 h后收集細(xì)胞，對(duì)照組為不使用藥物處理的顆粒細(xì)胞。采用TUNEL法檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞核用DAPI染色（藍(lán)色），TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核被染成綠色。細(xì)胞凋亡率為平均每個(gè)視野中TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)占細(xì)胞核總數(shù)的百分比。在每例樣本中隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。此外，采用Western blot檢測(cè)顆粒細(xì)胞中抑制凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Caspase-3水平。結(jié)果表明使用RESV處理后，顆粒細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著上升，Caspase-3蛋白水平顯著下降；使用EX527處理后，顆粒細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著下降，Caspase-3蛋白水平顯著上升（圖11-14）。

圖11 TUNEL法檢測(cè)白藜蘆醇組、對(duì)照組、EX527組顆粒細(xì)胞的凋亡情況（× 100）Fig.11 Granulosa cell appotosis in RESV group，control group and EX527 group was detected by TUNEL method（× 100）

圖12 TUNEL法檢測(cè)白藜蘆醇或EX527處理48 h后POR女性顆粒細(xì)胞的凋亡率Fig.12 The apoptotic rate of granulosa cells in ROR female treated with 48 h resveratrol or EX527 was detected by TUNEL method

圖13 白藜蘆醇或EX527處理48 h后POR女性顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平Fig.13 The expression level of Bcl-2 protein in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

圖14 白藜蘆醇或EX527處理48 h后POR女性顆粒細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)水平Fig.14 The expression level of Caspase-3 protein in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

2.5 RESV和EX527影響POR女性顆粒細(xì)胞合成雌二醇使用RESV或EX527分別處理30例POR組顆粒細(xì)胞，作用48h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)照組為不使用藥物處理的顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液。檢測(cè)顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)液中雌二醇水平?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果顯示使用RESV作用后培養(yǎng)液中雌二醇水平顯著增加，使用EX527作用后培養(yǎng)液中雌二醇水平顯著下降（圖15）。

3 討論

不孕癥的發(fā)病率在逐年升高，當(dāng)前不孕癥的全球發(fā)病率為15%～20%。不孕癥將成為繼心血管疾病、腫瘤之后危害人類健康的第三大疾病。自輔助生育技術(shù)逐漸開(kāi)展至今，POR是生殖科的常見(jiàn)病，研究［12］發(fā)現(xiàn)促排卵周期中9%～24%女性會(huì)發(fā)生POR，而＞40歲的婦女中POR的發(fā)生率約為50%。本研究也表明年齡≥ 40歲且AFC＜5的患者在首次促排卵IVF/ICSI周期中POR的發(fā)生率為98.7%［13］，而POR患者的年齡是預(yù)測(cè)IVF/ICSI-ET周期臨床妊娠的最佳指標(biāo)［14］。POR會(huì)導(dǎo)致獲卵數(shù)減少、卵子成熟率、受精率、卵裂率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均較低，促排卵周期取消率增高，可移植胚胎數(shù)減少，胚胎著床率下降，導(dǎo)致患者不能獲得妊娠。POR是困擾生殖醫(yī)學(xué)科臨床醫(yī)生的重大難題之一。

SIRT1是NAD + （煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）依賴的蛋白去乙酰酶，位于人類染色體10q21.3，是細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)的重要分子之一，具有高度保守性。SIRT1主要從能量代謝、氧化應(yīng)激、基因調(diào)控等方面抑制細(xì)胞的凋亡。此外，SIRT1通過(guò)調(diào)控炎癥狀態(tài)從而延緩細(xì)胞衰老，通過(guò)某些關(guān)鍵因子調(diào)控細(xì)胞周期及機(jī)體代謝，如抑制凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Caspase-3、FOXO、P53、核因子NF-κB、過(guò)氧化物酶體增殖物受體協(xié)同刺激因子la（PGCL-a）、KUTO以及轉(zhuǎn)錄因子E2F1。SIRT1也參與調(diào)控卵巢功能，雷帕霉素及其靶向因子（mammalian target of rapamycin，mTOR）通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1，起到抑制卵泡發(fā)育的作用，從而保留小鼠的卵巢儲(chǔ)備功能［15-16］。SIRT1的減少會(huì)加速卵母細(xì)胞老化［17］。

卵泡的發(fā)育過(guò)程中顆粒細(xì)胞的不斷分化。顆粒細(xì)胞圍繞在卵母細(xì)胞周圍，與卵母細(xì)胞關(guān)系密切，顆粒細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和凋亡的過(guò)程，從而影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量［18］。顆粒細(xì)胞包裹著卵泡構(gòu)成微環(huán)境，其將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子等運(yùn)輸至卵母細(xì)胞，為卵母細(xì)胞的發(fā)育提供能量。此外，顆粒細(xì)胞通過(guò)貯存和釋放分子信號(hào)以激活始基卵泡、選擇優(yōu)勢(shì)卵泡及調(diào)控卵母細(xì)胞成熟。本研究發(fā)現(xiàn)POR女性卵巢顆粒細(xì)胞中SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于NOR女性。同樣有研究［19］表明POR女性的顆粒細(xì)胞SIRT1蛋白水平顯著低于NOR女性（每組僅有7例）。

RESV是最早被發(fā)現(xiàn)的SIRT1激動(dòng)劑，是一種從紅葡萄皮、酒和花生中發(fā)現(xiàn)的植物類抗毒素。RESV具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和維持能量平衡等多種生物學(xué)功能［20-23］，其中抗氧化作用對(duì)人體維持正常狀態(tài)、延緩多種疾病、生殖系統(tǒng)疾病至關(guān)重要［24］。此外，RESV能夠改善促性腺激素濃度、優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞率和優(yōu)質(zhì)胚胎率［25］。RESV能競(jìng)爭(zhēng)性抑制降解cAMP的磷酸二酯酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，激活cAMP的效應(yīng)蛋白Epac1，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高，從而通過(guò)磷脂酶C和蘭尼堿受體的鈣釋放通道激活CaMKKβ-AMPK途徑，導(dǎo)致NAD+水平增加，增強(qiáng)SIRT1的活性，起到延緩衰老的作用［26］。RESV可促進(jìn)SIRT1表達(dá)水平增加，并且呈劑量依賴性［27］。IVF助孕的女性中，RESV能夠促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)，SIRT1減少過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷，從而保護(hù)黃素化顆粒細(xì)胞［28］。本研究同樣表明RESV能夠促進(jìn)POR女性卵巢顆粒細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)RESV通過(guò)增加POR女性顆粒細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)，從而增加顆粒細(xì)胞中類固醇激素合成關(guān)鍵酶（StAR、CYP19、CYP17）的表達(dá)。類固醇激素包括雌激素、孕激素和雄激素等，其合成需要多種酶的參與，發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶有類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）、芳香化酶（CYP19）、17α-羥化酶（CYP17）等。StAR主要位于線粒體膜上，促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)類固醇激素合成的基本原料膽固醇。CYP19、CYP17均為P450家族。SIRT1參與調(diào)控類固醇激素合成關(guān)鍵酶的表達(dá)。SIRT1可增加乳腺癌相關(guān)基因CYP19表達(dá)，抑制SIRT1表達(dá)導(dǎo)致促進(jìn)CYP19的轉(zhuǎn)錄因子ERa乙?；鰪?qiáng)，從而抑制CYP19的表達(dá)［29］。RESV促進(jìn)女性黃素化顆粒細(xì)胞SIRT1、StAR和P450arom的表達(dá)［30］。

抑制SIRT1表達(dá)會(huì)增加大鼠顆粒細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備功能下降［31］，相反，激活SIRT1可抑制豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡［32］。SIRT1調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，通過(guò)Bcl-2家族發(fā)揮作用可能是其通路之一。抑制凋亡蛋白Bcl-2參與調(diào)控線粒體凋亡，抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制細(xì)胞凋亡［33］。抑制miR-138-5p之后，其靶基因之一SIRT1mRNA表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)增加，從而抑制雞的顆粒細(xì)胞凋亡［34］。H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激通過(guò)抑制SIRT1，上調(diào)p53活性，引起顆粒細(xì)胞COV434凋亡［35-36］。RESV通過(guò)SIRT1/Nrf2/ARE信號(hào)通路減少氧化應(yīng)激，防止H2O2誘導(dǎo)的大鼠卵巢黃素化顆粒細(xì)胞損傷和凋亡［37］。通過(guò)激活A(yù)MPK/SIRT1信號(hào)通路可以抑制大鼠肝細(xì)胞凋亡［38］。RESV可促進(jìn)脊髓損傷大鼠組織中SIRT1、P-AMPK、Bcl-1、Bcl-2、Bcl-3的表達(dá)，而抑制Caspase-3、Caspase-9、Bax的表達(dá)，通過(guò)SIRT1/AMPK通路抑制細(xì)胞凋亡［39］。IVF助孕的女性中，RESV能夠促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞中抑制凋亡蛋白的表達(dá)，而抑制促凋亡Caspase-3蛋白的表達(dá)［28，40］。SIRT1通過(guò)激活ERK通路和抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，從而抑制顆粒細(xì)胞凋亡，并且顆粒細(xì)胞中SIRT1促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制Caspase-3的表達(dá)［19］。這與本研究結(jié)果是一致的。因此，RESV可能成為改善POR女性的卵巢反應(yīng)性，增加獲卵數(shù)的治療藥物。

本研究發(fā)現(xiàn)SIRT1能夠促進(jìn)POR女性卵巢顆粒細(xì)胞中雌二醇的合成。超促排卵最終需要扳機(jī)，注射HCG后會(huì)引起顆粒細(xì)胞發(fā)生黃素化，孕酮濃度明顯升高。因此，本研究中僅測(cè)定培養(yǎng)液中雌二醇水平，未測(cè)定孕酮水平。SIRT1調(diào)控雌激素的合成，雌激素對(duì)卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖有重要影響。小鼠敲除SIRT1基因后，雌激素受體α（ERα）表達(dá)降低，ERα調(diào)控的雌激素相關(guān)基因表達(dá)降低，導(dǎo)致雌激素分泌減少［41］。SIRT1通過(guò)FOXO1來(lái)調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞中雌激素的分泌［42］。通過(guò)SIRT1/Nrf2/ARE信號(hào)通路可以調(diào)控大鼠卵巢黃素化顆粒細(xì)胞中雌激素的分泌［38］。

綜上所述，POR女性卵巢顆粒細(xì)胞SIRT1水平低于NOR女性。POR女性中，SIRT1激活劑RESV上調(diào)顆粒細(xì)胞SIRT1水平。SIRT1抑制顆粒細(xì)胞凋亡，增加顆粒細(xì)胞中類固醇激素合成關(guān)鍵酶水平，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞合成雌二醇。因此，SIRT1激活劑如RESV可能成為改善POR女性卵巢反應(yīng)性，增加獲卵數(shù)的治療藥物。