王寧寧 劉亞平 陳曉利 王世銘 蘇迎春

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（鄭州 450052）

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing，PGT）主要包括PGT-A、胚胎植入前染色體結(jié)構(gòu)重排檢測和胚胎植入前單基因遺傳病的檢測［1］。PGT-A是對胚胎進行染色體非整倍體的篩查，主要用于高齡、反復(fù)種植失敗、反復(fù)自然流產(chǎn)等患者改善妊娠結(jié)局。

近年來，凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET）廣泛應(yīng)用于臨床，常規(guī)的子宮內(nèi)膜準備方案對妊娠結(jié)局的潛在影響是至關(guān)重要的。內(nèi)膜準備方案大致可分為自然周期（natural cycle，NC）和激素替代周期（hormone replacement therapy，HRT）［2］。目前，許多研究比較了FET的子宮內(nèi)膜準備方案對妊娠結(jié)局的影響，但結(jié)論仍存在爭議。一項高質(zhì)量的系統(tǒng)評價［3］表明，激素替代方案和自然周期方案具有相似的妊娠結(jié)局。然而，有研究［4-5］認為，自然周期方案的臨床妊娠率和活產(chǎn)率高于激素替代方案。另有研究［6-7］提示與自然周期相比，激素替代周期顯示出更好的臨床妊娠率和活產(chǎn)率。就產(chǎn)科結(jié)局方面，結(jié)論同樣存在爭議。有文獻［5，8］報道激素替代周期與自然周期有相似的產(chǎn)科結(jié)局。另有研究［9］表明激素替代周期方案胚胎移植后巨大兒的風(fēng)險和剖宮產(chǎn)率顯著高于自然周期。

本研究通過分析PGT-A助孕后整倍體單囊胚解凍移植周期不同內(nèi)膜準備方案的結(jié)局，了解排除遺傳因素影響后內(nèi)膜準備方案對凍融胚胎移植周期妊娠結(jié)局及產(chǎn)科結(jié)局的影響，并首次在PGT-A患者中探究不同年齡組的最佳內(nèi)膜準備方案。

1 資料與方法

1.1 研究對象回顧性分析2015年9月至2021年7月期間于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行PGT-A助孕后首次整倍體單囊胚移植治療的339個周期的臨床資料。納入標準：因女方高齡、反復(fù)種植失敗、反復(fù)流產(chǎn)等行PGT-A助孕治療周期；首次行整倍體單囊胚凍融周期。排除標準：子宮解剖結(jié)構(gòu)異常、宮腔粘連、輸卵管積水；夫婦一方或雙方染色體異常或單基因??；贈卵/供精周期。本研究獲河南省鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院機構(gòu)倫理委員會批準（編號：2023-KY-0128），由于為回顧性研究，故免除了知情同意。

1.2 分組根據(jù)內(nèi)膜準備方案分為自然周期組（NC組，n=80）和激素替代組（HRT組，n=259），既往陰道超聲監(jiān)測中被證實有排卵的患者或不愿服藥的患者被分配到自然周期組。路途遠、就診不便或不排卵的患者被分配到HRT組。根據(jù)年齡分組，分為低齡組（＜35歲，n=231）和高齡組（≥ 35歲，n=108）。

1.3 研究方法

1.3.1 囊胚活檢、遺傳學(xué)分析及保存PGT-A患者取卵日采用卵胞漿內(nèi)單精子注射，受精后第5日或第6日，胚胎學(xué)家對可移植囊胚的滋養(yǎng)外胚層（trophoblastic ectoderm，TE）進行活檢，再進行單細胞全基因組擴增，具體步驟已在我們先前的研究中描述［10］，使用單核苷酸多態(tài)性（single mucleotide polymorphism，SNP）微陣列或高通量測序?qū)U增產(chǎn)物進行分析。活檢后進行玻璃化冷凍并保存在液氮中。

1.3.2 子宮內(nèi)膜準備方案按本中心常規(guī)進行［11-12］：（1）自然周期：從月經(jīng)周期的第8～9天起，定期超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育和子宮內(nèi)膜情況，排卵日起肌肉注射黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，排卵后第6天進行囊胚移植。（2）激素替代周期：患者從月經(jīng)來潮的第2～3天開始口服補佳樂（拜耳，德國）2 mg/qd。根據(jù)超聲檢測的子宮內(nèi)膜厚度，適時調(diào)整用藥劑量。12～14 d后，進行經(jīng)陰道超聲檢查，并測定血清孕酮的濃度。若無優(yōu)勢卵泡，則注射黃體酮60 mg和口服地屈孕酮10 mg（該劑量2 d后改為20 mg），5 d后進行囊胚移植。

1.3.3 凍融囊胚移植胚胎培養(yǎng)和囊胚解凍均按本中心常規(guī)進行［13］。根據(jù)Gardner的評分標準對囊胚進行評分，胚胎評分≥ 3 BB為優(yōu)質(zhì)胚胎，移植過程在B超引導(dǎo)下進行。

1.4 觀察指標（1）臨床妊娠率：臨床妊娠定義為移植后35 d行B超檢查宮腔內(nèi)可見孕囊；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)× 100%。（2）活產(chǎn)率：活產(chǎn)定義為妊娠28周后生產(chǎn)活嬰；活產(chǎn)率=活胎分娩周期數(shù)/移植周期數(shù)× 100%。（3）流產(chǎn)率：流產(chǎn)定義為妊娠28周前的妊娠丟失；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)× 100%。（4）剖宮產(chǎn)率：剖宮產(chǎn)定義為經(jīng)腹切開子宮取出胎兒的手術(shù)；剖宮產(chǎn)率=剖宮產(chǎn)周期數(shù)/活產(chǎn)周期數(shù)× 100%。（5）巨大兒發(fā)生率：巨大兒定義為出生體重≥ 4 000 g；巨大兒發(fā)生率=巨大兒周期數(shù)/活產(chǎn)周期數(shù)× 100%。（6）低體重兒率：低體重兒定義為出生體重＜2 500 g；低體重兒率=低出生兒周期數(shù)/活產(chǎn)周期數(shù)× 100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料為正態(tài)分布或偏正態(tài)分布用均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗；偏態(tài)分布用中位數(shù)（P25，P75）表示，采用非參數(shù)檢驗（Wilcoxon檢驗）；計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗。多因素logistic回歸分析探究影響PGT-A整倍體單囊胚移植妊娠結(jié)局及產(chǎn)科結(jié)局的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況共納入339個移植周期，其中自然周期組80個周期、激素替代組259個周期。兩組間女方年齡、不孕年限、不孕類型、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、基礎(chǔ)卵泡刺激素（basal follicle stimulating hormone，bFSH）、基礎(chǔ)黃體生成素（basal luteinizing hormone，bLH）、反復(fù)流產(chǎn)史、反復(fù)種植失敗史比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者基本資料的描述Tab.1 Basic data description between the two groups ±s，M（P25，P75）

項目周期數(shù)（個）女方年齡［n（%）］＜35歲≥35歲不孕年限（年）BMI（kg/m2）bFSH（IU/L）bLH（IU/L）既往妊娠次數(shù)（次）既往流產(chǎn)次數(shù)（次）反復(fù)流產(chǎn)史［n（%）］有無反復(fù)種植失敗史［n（%）］有無不孕類型［n（%）］原發(fā)不孕繼發(fā)不孕NC組80 HRT組259 t/z/χ2值P值3.197 0.074 48（60.0）32（40.0）3.05 ± 2.72 23.06 ± 2.83 6.07 ± 1.80 3.82（2.37，6.21）2.39 ± 1.38 1.95 ± 1.14 183（70.7）76（29.3）2.64 ± 2.86 23.51 ± 2.97 6.04 ± 1.96 4.84（2.92，7.74）2.67 ± 1.56 2.15 ± 1.40 1.135 1.174 0.117 1.639 1.439 1.305 0.037 0.257 0.241 0.907 0.101 0.151 0.194 0.847 55（68.8）25（31.2）181（69.9）78（30.1）1.525 0.217 3（3.7）77（96.3）20（7.7）239（92.3）0.527 0.468 4（5.0）76（95.0）19（7.3）240（92.7）

2.2 內(nèi)膜及胚胎移植情況激素替代組的優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著高于自然周期組（67.2%vs.50.0%，P＜0.05）；兩組患者移植日子宮內(nèi)膜厚度和囊胚發(fā)育天數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組患者內(nèi)膜及胚胎移植情況比較Tab.2 Comparison of endometrium and embryo transfer between the two groups ±s

表2 兩組患者內(nèi)膜及胚胎移植情況比較Tab.2 Comparison of endometrium and embryo transfer between the two groups ±s

項目周期數(shù)（個）移植日內(nèi)膜厚度（mm）囊胚質(zhì)量［n（%）］優(yōu)質(zhì)非優(yōu)質(zhì)囊胚發(fā)育天數(shù)［n（%）］D5囊胚D6囊胚NC組80 9.90 ± 2.17 HRT組259 9.03 ± 1.53 t /χ2值P值2.006 7.752 0.051 0.005 40（50.0）40（50.0）174（67.2）85（32.8）0.488 0.485 51（63.7）29（36.3）176（68.0）83（32.0）

2.3 妊娠結(jié)局及產(chǎn)科結(jié)局與自然周期組相比，激素替代組的活產(chǎn)率顯著降低（40.2%vs.53.8%，P=0.032），流產(chǎn)率顯著升高（25.4%vs.8.3%，P=0.013），而兩組臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（54.8%vs.60.0%，P=0.442）。激素替代組的剖宮產(chǎn)率、巨大兒發(fā)生率均高于自然周期組（79.8%vs.72.1%，P=0.308；14.4%vs.7.0%，P=0.210），低體重兒率低于自然周期組（7.7%vs.11.6%，P=0.656），但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 兩組妊娠及產(chǎn)科結(jié)局的比較Tab.3 Comparison of pregnancy and obstetrical outcomes between the two groups

2.4 妊娠結(jié)局及產(chǎn)科結(jié)局的影響因素分析行l(wèi)ogistic回歸分析探究影響PGT-A患者整倍體單囊胚移植妊娠結(jié)局的影響因素，結(jié)果顯示：女方年齡是影響流產(chǎn)率的獨立因素（OR=0.172，95%CI：0.044～0.676，P=0.012）；女方年齡和囊胚發(fā)育天數(shù)是影響活產(chǎn)率的因素（OR=4.972，95%CI：1.810～13.659，P=0.002；OR=2.845，95%CI：1.008～8.033，P=0.048）；內(nèi)膜準備方案不影響PGT-A患者的流產(chǎn)率和活產(chǎn)率。見表4。進一步探究影響PGT-A患者整倍體單囊胚移植產(chǎn)科結(jié)局的影響因素，結(jié)果顯示：女方年齡、移植日內(nèi)膜厚度、囊胚質(zhì)量、囊胚發(fā)育天數(shù)和內(nèi)膜準備方案均不是PGT-A患者剖宮產(chǎn)率和巨大兒發(fā)生率的影響因素。見表5。

表4 影響妊娠結(jié)局的二元logistic回歸分析Tab.4 Binary Logistic regression analysis affecting pregnancy outcomes

表5 影響產(chǎn)科結(jié)局的二元logistic回歸分析Tab.5 Binary Logistic regression analysis affecting obstetrical outcomes

2.5 低齡組和高齡組中不同內(nèi)膜方案的妊娠結(jié)局對年齡分層進行分析：低齡組中，其中自然周期組48個周期，激素替代周期組183個周期。結(jié)果顯示：自然周期組和激素替代組的臨床妊娠率、活產(chǎn)率和流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。高齡組中，其中自然周期組32個周期，激素替代組76個周期。結(jié)果顯示：自然周期組的活產(chǎn)率顯著高于激素替代組（50.0%vs.28.9%，P=0.036），流產(chǎn)率顯著低于激素替代組（10.5%vs.36.1%，P=0.043），兩組間臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表6。

表6 不同年齡組內(nèi)膜準備方案妊娠結(jié)局的比較Tab.6 Comparison of pregnancy outcomes of endometrial preparation programs in different age groups

3 討論

隨著玻璃化冷凍技術(shù)的進步，F(xiàn)ET的應(yīng)用在全球范圍內(nèi)急劇增加。研究［14］表明，與新鮮胚胎移植相比，F(xiàn)ET不僅可以降低促排卵周期卵巢過度刺激綜合征的風(fēng)險以及相關(guān)產(chǎn)科并發(fā)癥（如早產(chǎn)、低出生體重兒和圍產(chǎn)兒死亡）的潛在發(fā)生率，還可用于女性生育力的保存［15］。PGT技術(shù)對于有嚴重遺傳疾病風(fēng)險但希望擁有健康家庭的夫婦來說是一種重要的選擇。通過對植入子宮前的胚胎進行遺傳學(xué)檢測，排除了胚胎因素導(dǎo)致的植入失敗并阻斷了遺傳性疾病傳遞給子代。PGT-A助孕技術(shù)篩選的整倍體胚胎可排除胚胎異常因素對妊娠結(jié)局的影響。對于高齡、反復(fù)流產(chǎn)、反復(fù)種植失敗患者主要行PGT-A助孕。有研究［16-17］表明，高齡和反復(fù)種植失敗患者囊胚移植的臨床妊娠率明顯高于卵裂期胚胎，因此越來越多的中心選擇囊胚移植。

凍融胚胎移植能否成功妊娠受多種因素的影響，包括胚胎的整倍體性、子宮內(nèi)膜容受性、以及內(nèi)膜與胚胎發(fā)育的同步性等［18］。凍融胚胎移植患者如何準備子宮內(nèi)膜，一直是臨床醫(yī)生探討的熱點問題。本研究通過PGT-A技術(shù)選擇整倍體胚胎移植排除了胚胎因素導(dǎo)致妊娠結(jié)局失敗的干擾，探究不同內(nèi)膜準備方案對PGT-A整倍體單囊胚移植的妊娠結(jié)局和產(chǎn)科結(jié)局的影響。結(jié)果提示，兩種方案對妊娠結(jié)局并無顯著影響。自然周期組與激素替代周期組的活產(chǎn)率差異并無顯著，與之前研究結(jié)果［19］一致。FU等［20］發(fā)現(xiàn)無論是否進行PGT-A，子宮內(nèi)膜準備方案對活產(chǎn)率均無顯著影響。本研究在進行多因素logistic回歸分析后，結(jié)果提示激素替代方案的流產(chǎn)率雖高于自然周期方案，但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，子宮內(nèi)膜準備方案不是流產(chǎn)的獨立影響因素（OR=0.476，95%CI：0.093～2.449，P=0.375）。然而，在一項涉及570個FET周期的隨機對照實驗［21］中，研究人員發(fā)現(xiàn)激素替代方案的流產(chǎn)率高于自然周期方案（21%vs.12%，P＜0.05）。另一項涉及非PCOS患者的6 840個FET周期的回顧性分析［22］顯示，激素替代周期方案相對于自然周期方案有更高的流產(chǎn)率。與之前結(jié)論不一致可能原因是本研究人群是進行PGT-A助孕的患者淘汰了非整倍體的胚胎，和子宮內(nèi)膜更同步。

采用自然周期方案的大部分患者可產(chǎn)生黃體，而激素替代周期方案一般不產(chǎn)生黃體。在胎盤形成之前，黃體是生殖激素和維持妊娠所需的其他物質(zhì)的重要來源。黃體細胞不僅產(chǎn)生妊娠必需的雌孕激素，而且產(chǎn)生血管活性因子，如對胎盤形成有重要意義的松弛素，調(diào)節(jié)母體循環(huán)系統(tǒng)的變化［23］。若黃體缺失，活性因子缺乏則不良產(chǎn)科結(jié)局的風(fēng)險可能增加。FU等［20］對3 400個FET周期進行了回顧性分析，研究選取月經(jīng)周期規(guī)律的患者進行PGT助孕后玻璃化冷凍囊胚移植，調(diào)整相關(guān)混雜因素后，結(jié)果顯示自然周期組和激素替代周期組的新生兒結(jié)局相似，而激素替代周期組的剖宮產(chǎn)率顯著高于自然周期組。然而，本研究結(jié)果提示自然周期組和激素替代周期組的剖宮產(chǎn)率和新生兒結(jié)局均無顯著差異?？赡苁潜狙芯恐贿x擇PGT-A周期整倍體胚胎進行分析且周期數(shù)量有限，結(jié)果顯示激素替代周期組的剖宮產(chǎn)率雖高于自然周期組，但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。

隨著女方年齡的增長，其妊娠能力逐漸下降，流產(chǎn)率逐漸上升，采用PGT-A技術(shù)助孕可在一定程度上改善妊娠結(jié)局。本研究首次證明行PGT-A高齡患者排除非整倍體胚胎因素后，與激素替代周期方案相比，自然周期方案可獲得更高的活產(chǎn)率和更低的流產(chǎn)率。可能原因是高齡孕婦是血栓形成事件的獨立危險因素，而外源性激素又與血栓形成風(fēng)險增加相關(guān)［24］。此外，雌激素通過不同的機制促進子宮胎盤循環(huán)：首先是促進子宮血管生成，其次是促進血管重塑，最后是控制血流動力學(xué)。在大多數(shù)哺乳動物妊娠中，雌二醇水平的逐漸升高與子宮-胎盤血流量的增加是一致的。這種子宮-胎盤血流量的增加是提供足夠的氧氣和營養(yǎng)所必需的，同時也是胎兒和胎盤生長發(fā)育以及正常妊娠結(jié)局所必需的。在孕婦中，血流不足與妊娠并發(fā)癥有關(guān)，如早產(chǎn)、宮內(nèi)生長遲緩，甚至先兆子癇。血流動力學(xué)的變化主要受血管阻力顯著降低的影響，這主要是血管重塑和血管擴張增加的共同作用。雌激素可以在子宮-胎盤的血管形成過程中調(diào)節(jié)細胞滋養(yǎng)層細胞的分化和侵襲，以及以劑量依賴的方式促進絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞的遷移。在這一過程中，由胎盤合成的雌二醇主要作用是調(diào)節(jié)侵襲性滋養(yǎng)層細胞的分泌活動以促進間質(zhì)重塑和遷移，而雌二醇過早的升高可能導(dǎo)致滋養(yǎng)層細胞凋亡，并與子宮胎盤功能不全有關(guān)［25］，因此使用激素替代周期方案的高齡女性的妊娠結(jié)局進一步惡化。

有研究［26］提出，玻璃化冷凍周期移植D6囊胚獲得較低妊娠結(jié)局可能與較高的非整倍體率有關(guān)。本研究選擇整倍體胚胎移植，消除了非整倍體胚胎因素導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的干擾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)囊胚發(fā)育天數(shù)是活產(chǎn)的獨立影響因素，內(nèi)膜準備方案并不影響妊娠結(jié)局。與IRANI等［27］結(jié)論一致，與移植D6整倍體囊胚相比，D5整倍體囊胚產(chǎn)生更高的活產(chǎn)率。可能原因：首先，胚胎細胞的DNA會隨著培養(yǎng)時間的延長發(fā)生損傷；其次，D5囊胚對子宮內(nèi)膜可能具有更好的內(nèi)膜容受性；此外，HASHIMOTO等［28］比較分析了D5囊胚和D6囊胚的著床率，發(fā)現(xiàn)D6囊胚會增加異常紡錘體的發(fā)生率，并降低玻璃化冷凍后胚胎移植的著床率。因此，囊胚發(fā)育天數(shù)在胚胎選擇中仍然起著重要作用，即使在考慮整倍體囊胚時也是如此。

本研究局限性：為回顧性分析且樣本量偏小，兩組內(nèi)膜準備方案的周期數(shù)相差較大，容易引起偏倚，后續(xù)需要大樣本量和多中心高質(zhì)量的前瞻性研究或隨機對照試驗來證實目前的研究結(jié)果。

綜上所述，目前的結(jié)果表明，整體來看，PGTA患者凍融周期整倍體單囊胚移植時，子宮內(nèi)膜準備方案并不影響妊娠結(jié)局及產(chǎn)科結(jié)局，但對于高齡患者，自然周期方案是最優(yōu)選擇。