＊高啟燕 趙心悅 周啟發(fā)*

（1.臺(tái)州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心 浙江 318001 2.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 浙江 310058）

引言

在過去的幾十年里，養(yǎng)豬場(chǎng)已經(jīng)從小型家庭農(nóng)場(chǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇笮图袆?dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)，以較低的成本提高生豬產(chǎn)量。根據(jù)世界觀察研究所進(jìn)行的研究，大型集中動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)產(chǎn)量占全球豬肉產(chǎn)量的55%[1]，豬廢水含有高濃度的氨、顆粒有機(jī)物（POM）和溶解性有機(jī)物（DOM）以及多種微生物[2-5]。養(yǎng)殖廢水可以作為液體肥料[6]和灌溉水[7]再利用，因?yàn)樗写罅坑袃r(jià)值的水和養(yǎng)分，可以促進(jìn)植物更好地生長(zhǎng)。

一般來說，污水在使用前應(yīng)儲(chǔ)存一段時(shí)間，這在一些國(guó)家有規(guī)定，例如意大利、芬蘭、丹麥和中國(guó)。在含氨廢水或沼渣的儲(chǔ)存過程中，復(fù)雜的氮（N）轉(zhuǎn)化，包括硝化-反硝化、氨氧化、厭氧氨氧化和部分硝化-厭氧氨氧化、氨同化和固氮[8-11]，可能會(huì)顯著影響廢水或消化液在施用后的水質(zhì)和肥料質(zhì)量。具體而言，一些氮轉(zhuǎn)化（例如氨的揮發(fā)、硝化反硝化和氨氧化）會(huì)導(dǎo)致廢水儲(chǔ)存過程中大量的氮損失，這會(huì)污染環(huán)境并減少提供給植物的養(yǎng)分量[11]。然而，在污水或沼渣的長(zhǎng)期儲(chǔ)存過程中，僅研究了有限的氮轉(zhuǎn)化[11]。因此，深入研究養(yǎng)殖廢水儲(chǔ)存期間包括氨同化的氮損失和氨轉(zhuǎn)化，可為養(yǎng)豬廢水作為液體肥料和灌溉水進(jìn)行再利用提供重要的科學(xué)依據(jù)。本研究通過測(cè)定不同儲(chǔ)存時(shí)間的pH、TOC、總氮（TN）、氨氮（NH4-N）、硝態(tài)氮（NO3-N）、亞硝態(tài)氮（NO2-N）、尿素含量，定量表征氮損失情況，并通過宏基因組測(cè)序結(jié)果分析氮轉(zhuǎn)化機(jī)理。

1.材料與方法

(1)材料

養(yǎng)豬廢水采自浙江省湖州市的一養(yǎng)豬場(chǎng)。廢水使用前通過濾紙（中國(guó)雙泉公司）過濾。該廢水具有養(yǎng)豬廢水的典型特征（如高氨氮、高TOC等）。

(2)厭氧儲(chǔ)存試驗(yàn)

2020年11月至2021年4月，在封閉式2.0mm厚的聚丙烯塑料容器（工作容積25L）中進(jìn)行厭氧儲(chǔ)存試驗(yàn)，溫度保持在25～30℃。

表1 本研究用養(yǎng)豬廢水性質(zhì)（n=3）

(3)廢水性質(zhì)測(cè)定

儲(chǔ)存過程中每30天采集一次水樣。每個(gè)廢水樣品通過0.45μm纖維素膜過濾，并收集上清液進(jìn)行分析。氫離子濃度（pH）使用PHB-4 pH計(jì)（中國(guó)上海INESA公司）測(cè)量?？傆袡C(jī)碳TOC使用總有機(jī)碳分析儀（德國(guó)JENA公司，MULTI N/C 3100）進(jìn)行測(cè)量。用微量凱氏定氮法測(cè)定總氮TN，并按照Nash試劑分光光度法測(cè)定NH4-N含量（SEPA，2002[12]）。使用離子色譜法（Dionex ICS-1500離子色譜系統(tǒng)，加拿大SpectraLab Scientific Inc.）測(cè)定NO3-N和NO2-N[10]?？扇苄杂袡C(jī)氮SON的計(jì)算方法是總氮TN減去NH4-N、NO3-N和NO2-N。尿素含量采用雙乙酰單肟試劑比色法測(cè)定。

(4)宏基因組分析

在儲(chǔ)存第0天、60天、120天和180天從每個(gè)容器中收集50mL廢水，水樣通過0.45μm混合纖維素酯過濾器進(jìn)行過濾，用TIANNAMP DNA試劑盒提取總DNA。根據(jù)Zhang和Lv[18]的方法進(jìn)行宏基因組測(cè)序和序列處理。使用NEB Next Ultra DNA library Prep Kit for Illumina（美國(guó)馬薩諸塞州新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室）構(gòu)建DNA片段庫(kù)后，在Illuminia HiSeq X-Ten平臺(tái)上測(cè)定序列。使用Trimmatic軟件（v0.36）對(duì)原始讀數(shù)進(jìn)行質(zhì)量控制。使用MEGAHIT軟件（v1.0.6）組裝Clean Reads，并使用MetaGeneMark軟件（v3.38）預(yù)測(cè)開放閱讀框（ORF）。使用BBMAP軟件將每個(gè)樣本的清洗數(shù)據(jù)映射到初始基因目錄（Unigenes）（http://jgi.doe.gov/data-andtools/bbtools/），并計(jì)算映射基因的數(shù)量。使用Cotillard等人的公式計(jì)算基因豐度。對(duì)于單基因的分類學(xué)注釋，在DIAMOND軟件（https://github.com/bbuchfink/diamond/）中對(duì)公共非冗余（NR）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索。預(yù)測(cè)基因的蛋白質(zhì)序列根據(jù)《京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)》（KEGG）（2018.01版本）繪制。廢水性質(zhì)測(cè)定儲(chǔ)存過程中每30天采集一次水樣。每個(gè)廢水樣品通過0.45μm纖維素膜過濾，并收集上清液進(jìn)行分析。氫離子濃度（pH）使用PHB-4 pH計(jì)（中國(guó)上海INESA公司）測(cè)量。總有機(jī)碳TOC使用總有機(jī)碳分析儀（德國(guó)JENA公司，MULTI N/C 3100）進(jìn)行測(cè)量。用微量凱氏定氮法測(cè)定總氮TN，并按照Nash試劑分光光度法測(cè)定NH4-N含量（SEPA，2002）。按照SEPA（2002）描述的方法，使用離子色譜法（Dionex ICS-1500離子色譜系統(tǒng)，加拿大SpectraLab Scientific Inc.）測(cè)定NO3-N和NO2-N。可溶性有機(jī)氮SON的計(jì)算方法是總氮TN減去NH4-N、NO3-N和NO2-N。尿素含量采用雙乙酰單肟試劑比色法測(cè)定。

2.結(jié)果

(1)廢水性質(zhì)變化

廢水pH值隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低（0～60天），然后持續(xù)升高（圖1）。養(yǎng)豬廢水的總有機(jī)碳TOC在儲(chǔ)存期間保持降低（圖2）。廢水中總氮TN和氨氮NH4-N含量（圖3）顯著降低，NO3-N和NO2-N含量（圖3）保持非常低，且隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)幾乎不變。而廢水可溶性有機(jī)氮SON（圖3）含量顯著增加。厭氧儲(chǔ)存180天后，原始養(yǎng)豬廢水中總氮含量由1319.3mg/L下降到842.9mg/L，損失了36.1%。原始養(yǎng)豬廢水中727.6mg/L的NH4-N發(fā)生了轉(zhuǎn)化，而儲(chǔ)存的養(yǎng)豬廢水中SON增加了202.6mg/L。在四個(gè)儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)，溶解性有機(jī)氮呈顯著負(fù)相關(guān)（R2=0.992，n=12，P＜0.001）。結(jié)果表明，養(yǎng)豬廢水厭氧儲(chǔ)存期間發(fā)生了從NH4-N到SON的顯著的氮損失和氮轉(zhuǎn)化。

圖1 廢水儲(chǔ)存期間不同時(shí)段pH值，數(shù)據(jù)是三次重復(fù)的平均值。條形表示標(biāo)準(zhǔn)誤差

圖2 廢水儲(chǔ)存期間不同時(shí)段TOC，數(shù)據(jù)是三次重復(fù)的平均值。條形表示標(biāo)準(zhǔn)誤差

圖3 廢水儲(chǔ)存期間不同時(shí)段總氮、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和可溶性有機(jī)氮含量。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)的平均值，條形表示標(biāo)準(zhǔn)差。不同字母表示P＜0.05時(shí)的顯著性

(2)氮轉(zhuǎn)化和氮損失相關(guān)的功能基因

①基因譜分析

在養(yǎng)豬廢水厭氧儲(chǔ)存的第0天、60天、120天、180天，分別檢測(cè)到245840個(gè)、672634個(gè)、433604個(gè)和248439個(gè)基因。PCA分析（圖4）結(jié)果表明，基因譜在不同儲(chǔ)存時(shí)間的養(yǎng)豬廢水之間明顯分離。支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（0.20%～0.45%）、轉(zhuǎn)座酶（0.13%～0.44%）和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（0.10%～0.17%）基因在整個(gè)儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)一直是最豐富的基因。

圖4 不同貯藏時(shí)間豬廢水中基因譜的主成分分析（PCA）。SWW0、SWW60、SWW120和SWW180分別代表儲(chǔ)存第0天、60天、120天和180天的養(yǎng)殖廢水

②不同氮轉(zhuǎn)化模塊的相對(duì)基因豐度

如圖5所示，在不同的儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)，反硝化作用DNI和谷氨酸/谷氨酰胺合成酶Gln的基因豐度始終最高，異化硝酸鹽還原DNR、天冬酰胺合成Aspn和厭氧氨氧化Annamox的基因豐度中等，硝酸鹽同化NA、同化硝酸鹽還原ANR和硝化作用NI的基因豐度非常低。特別的，在整個(gè)儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)，反硝化作用的基因豐度始終顯著高于硝化作用。反硝化作用、谷氨酸/谷氨酰胺合成酶、異化硝酸鹽還原和天冬酰胺合成的基因豐度隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而趨于降低。結(jié)果表明：養(yǎng)豬廢水的反硝化和氨同化（如氨基酸和酰胺的合成）基因活性較高，而硝酸鹽同化、硝化和同化硝酸鹽還原基因活性較低；此外，厭氧氨氧化和異化硝酸鹽還原在養(yǎng)豬廢水中也具有活性。

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3.討論

養(yǎng)豬廢水厭氧儲(chǔ)存180天后，廢水中總氮和氨氮含量顯著降低，而廢水可溶性有機(jī)氮顯著增加，試驗(yàn)結(jié)果表明，養(yǎng)豬廢水儲(chǔ)存期間發(fā)生了從氨氮到可溶性有機(jī)氮的顯著的氮損失和氮轉(zhuǎn)化，這可能歸因于一些氮反應(yīng)過程（例如硝化和反硝化作用，氨氧化，厭氧氨氧化和氨揮發(fā)）。氨為大多數(shù)細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)，并為尿素合成提供底物，因此可以被細(xì)菌轉(zhuǎn)化為可溶性有機(jī)氮。此外，TOC含量明顯下降，表明養(yǎng)豬廢水儲(chǔ)存期間養(yǎng)分損失嚴(yán)重。廢水儲(chǔ)存過程中的碳氮損失會(huì)污染環(huán)境，降低肥料質(zhì)量。

氮轉(zhuǎn)化基因譜顯示，廢水儲(chǔ)存中的氮轉(zhuǎn)化非常復(fù)雜，這與之前的研究一致[11,13-16]。值得注意的是，轉(zhuǎn)座酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和氨基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因被檢測(cè)為整個(gè)儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)最豐富的基因，這表明這些細(xì)菌最終增強(qiáng)了它們的序列插入和運(yùn)輸功能，以抵抗復(fù)雜的環(huán)境變化[17]，并在養(yǎng)豬廢水中獲得碳和氮源。同樣，糖和氨基酸的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也被確定為土壤中最豐富的蛋白質(zhì)[18]。富含氨的養(yǎng)豬廢水在厭氧條件下，硝化作用、硝酸鹽同化和硝酸鹽同化還原的基因豐度一直較低；因此，硝化作用、硝酸鹽同化和硝酸鹽同化還原反應(yīng)可能很弱。相比之下，反硝化和厭氧氨氧化模塊中的高基因豐度表明養(yǎng)豬廢水的反硝化和厭氧氨氧化活性較高。結(jié)果可能與Svehla等人[11]的結(jié)果一致，即硝化作用有助于減少液相厭氧的長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間的氮損失。在整個(gè)養(yǎng)豬廢水的儲(chǔ)存過程中，反硝化作用的高基因豐度和厭氧氨氧化作用的中等基因豐度可以解釋養(yǎng)豬廢水厭氧儲(chǔ)存過程中氮的顯著損失。反硝化和厭氧氨氧化模塊中的高基因豐度表明養(yǎng)豬廢水的反硝化和厭氧氨氧化活性較高。此外，盡管硝化作用的底物比反硝化作用豐富得多，但反硝化的基因豐度是硝化作用的2.6～94.1倍，這主要?dú)w因于養(yǎng)豬廢水的厭氧儲(chǔ)存條件。在養(yǎng)豬廢水的儲(chǔ)存過程中，反硝化作用的高基因豐度和厭氧氨氧化作用的中等基因豐度可以解釋養(yǎng)豬廢水厭氧儲(chǔ)存過程中氮的顯著損失。特別的，谷氨酸/谷氨酰胺合成酶的基因豐度，包括600個(gè)谷氨酸和548個(gè)谷氨酰胺合酶基因，在整個(gè)儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)始終處于中等水平；而天冬酰胺合成酶的基因豐度，包括353個(gè)天冬酰胺合酶基因，在整個(gè)儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)始終處于中等水平，表明在養(yǎng)豬廢水厭氧儲(chǔ)存過程中發(fā)生了氨向氨基酸和酰胺的活躍的同化作用。由于大多數(shù)細(xì)菌物種可以吸收養(yǎng)豬廢水中的氨，因此谷氨酸/谷氨酰胺合成酶和天冬酰胺合成酶的基因豐度相當(dāng)高或適中。此外，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的高豐度和檢測(cè)到的不同氨基轉(zhuǎn)移酶基因，指示著氨基酸和不同的酰胺化合物可以在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生。

4.結(jié)論

在180天的儲(chǔ)存過程中，養(yǎng)豬廢水TOC、TN和NH4-N含量顯著降低，NO3-N和NO2-N含量保持非常低，然而，溶解性有機(jī)氮（SON）含量顯著上升。存儲(chǔ)180天后，原始養(yǎng)豬廢水中總氮含量損失了36.1%，廢水中727.6mg/L的NH4-N發(fā)生了轉(zhuǎn)化，而儲(chǔ)存的養(yǎng)豬廢水中SON增加了202.6mg/L，這表明儲(chǔ)存過程發(fā)生了從NH4-N到SON的氮損失和氮轉(zhuǎn)化。另外，在不同的儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)，反硝化作用和谷氨酸/谷氨酰胺合成酶的基因豐度始終最高，異化硝酸鹽還原、天冬酰胺合成和厭氧氨氧化的基因豐度中等，養(yǎng)豬廢水中反硝化和氨同化基因（如氨基酸和酰胺的合成）活性較高表明發(fā)生了顯著的氮同化作用。