＊關(guān)東 董珍 陳凱 李國威 廖競遠(yuǎn) 黃均榮 游恒志*

（1.深圳市中核海得威生物科技有限公司 廣東 518057 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)（深圳） 廣東 518055）

引言

硼中子捕獲療法（Boron Neutron Capture Therapy，BNCT）是一種新興的二元靶向治療方式，旨在改善傳統(tǒng)上難以治療腫瘤的治療率。其原理是將對腫瘤有特異性親和力的10B化合物注入人體，經(jīng)中子束局部照射使聚集在腫瘤組織中的10B與熱中子發(fā)生核反應(yīng)，利用生成的7Li與α粒子破壞腫瘤組織[1-2]。α粒子的范圍很短，優(yōu)先影響腫瘤組織，同時避免更遠(yuǎn)端的正常組織受到損傷。目前，L-10BPA是已知可利用BNCT治療癌癥的重要硼化物[3]。富含10B的L-BPA的合成方法已有許多文獻(xiàn)報道，但現(xiàn)有技術(shù)都存在成本較高，合成條件苛刻等缺陷[4]，因此需要成本低、合成條件溫和的合成方法。本研究擬參考前人路線，在其基礎(chǔ)上設(shè)計正交實驗優(yōu)化釜式反應(yīng)條件，對釜式反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，并根據(jù)釜式參數(shù)探討了連續(xù)流合成技術(shù)的可行性，連續(xù)流工藝對于金屬有機試劑在反應(yīng)過程中放出的大量熱能以微熱的形式排出體系之外，可降低危險性以及反應(yīng)的放大效應(yīng)[5]。

1.實驗材料

（1）主要儀器。Agilent 1260高效液相色譜：美國Agilent公司；ME204E電子天平（萬分之一）：梅特勒-托利多公司；IKA RV3 eco旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；震蕩式連續(xù)流微通道反應(yīng)器：深圳一正科技有限公司。（2）主要試劑。N-叔丁氧羰基-4-碘-L-苯丙氨酸、異丙基氯化鎂（2M in THF）、硼酸三正丁酯；硼-10酸，深圳中核海得威生物科技有限公司；其他試劑和溶劑均為市售分析純。

2.實驗方法

（1）釜式反應(yīng)制備L-BPA中間體。合成路線如圖1所示。首先，精確稱量1.00g（16.17mmol，1eq.）硼酸加入反應(yīng)瓶中，加入磁子，稱量5.40g（72.77mmol，4.5eq.）正丁醇加入反應(yīng)燒瓶中，攪拌均勻。室溫條件下將31.72mg（0.32mmol，0.02eq.）濃硫酸加入反應(yīng)體系中。搭建回流裝置，常壓條件下油浴升溫至130℃，攪拌反應(yīng)4h，將反應(yīng)過程生成的水分分出，餾出的水體積不再增加且水的總體積與理論計算體積相近，常壓條件下油浴升溫至170℃，將反應(yīng)體系中未反應(yīng)完全的正丁醇蒸餾出來，至餾出體積不再變化且正丁醇餾出總體積和理論計算體積相近。將反應(yīng)體系降溫至50℃，油泵開啟穩(wěn)定后接入蒸餾裝置中，抽真空條件下將反應(yīng)體系升溫至110℃，分出硼-10酸三正丁酯，至最終無餾分蒸出且反應(yīng)瓶中無液體，收集得到3.1850g無色透明液體立即密封。精確稱量1.00g（2.55mmol，1eq.）的N-叔丁氧羰基-4-碘-L-苯丙氨酸，將其加入到schlenk管中，加入磁子，密封schlenk管，抽真空，置換氮氣循環(huán)3次。室溫下加12.5mL的無水THF，攪拌溶解后置于-30℃下預(yù)冷10min，使反應(yīng)體系溫度降低至-30℃。在30min內(nèi)緩慢滴加完10mL（20.4mmol，8eq.）異丙基氯化鎂（2.0M in THF），繼續(xù)在-30℃條件下反應(yīng)4h。再往體系中緩慢滴加0.85mL（3.19mmol，1.25eq.）的硼酸酯，繼續(xù)在-30℃下反應(yīng)過夜，TLC監(jiān)測反應(yīng)完成情況。待底物N-叔丁氧羰基-4-碘-L-苯丙氨酸完全反應(yīng)后加入38.25mL純水淬滅反應(yīng)，攪拌10min，溶液凝固，取出schlenk管置于室溫，攪拌。固體消失后，緩慢滴加38.25mL（1mol/L）稀鹽酸，攪拌2h，溶液逐漸變澄清透明。使用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，抽真空，完全除去溶劑，得到粗產(chǎn)品0.86g。最后，快速反相柱層析分離，得到0.496g白色粉末純產(chǎn)物，產(chǎn)率63%。

（2）連續(xù)流式反應(yīng)制備L-BPA中間體。連續(xù)流式反應(yīng)合成路線如圖2所示。首先，取下注射器，并在流路A，B，C三處同時以氮氣吹掃10min，排除體系中水氧。精確稱量0.6mmol的N-叔丁氧羰基-4-碘-L-苯丙氨酸234.72mg，以THF為溶劑配制4.8mL溶液，接入流路A；量取異丙基氯化鎂溶液（1Min THF）4.8mL，接入流路B；精確稱量0.75mmol硼酸酯172.62mg，以THF為溶劑配制9.6mL溶液，接入流路C；同時以25μL/min的流速注入流路A，B，使兩者在反應(yīng)器1中進(jìn)行反應(yīng)；以50μL/min的流速注入流路C，在反應(yīng)器2中與第一步反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行硼酯化，流出液后處理與釜式反應(yīng)一致。

圖2 連續(xù)流式反應(yīng)過程示意圖

3.實驗結(jié)果與討論

（1）釜式反應(yīng)實驗條件優(yōu)化。通過前期調(diào)研，本研究選取了格氏試劑、硼酸酯、溶劑、溫度進(jìn)行了實驗設(shè)計，對每個因素分別設(shè)置了3個水平，以分析這四個因素不同水平分布對結(jié)果的影響，如表1所示。

表1 L9（34）正交實驗表及結(jié)果

從以上分析可得，影響產(chǎn)物合成的因素貢獻(xiàn)順序為A＞B＞C＞D，即格氏試劑的用量＞硼酸酯的用量＞溫度＞溶劑的量。格氏試劑和硼酸酯當(dāng)量的變化對于反應(yīng)的產(chǎn)率影響較大，格氏試劑的當(dāng)量對結(jié)果影響最為顯著。綜上，最優(yōu)的釜式反應(yīng)條件為：格氏試劑8當(dāng)量，硼酸正丁酯1.25當(dāng)量，溫度為-30℃，溶劑THF為0.2mol/L。最佳反應(yīng)條件在9組實驗中并沒有出現(xiàn)。在此條件下，重復(fù)3次驗證實驗，得到的實驗產(chǎn)率分別是75%、78%及76%，證明了正交實驗的準(zhǔn)確性。

（2）釜式反應(yīng)后處理條件優(yōu)化。本文還探究了后處理時酸化的反應(yīng)條件，結(jié)果如表2所示。

表2 后處理優(yōu)化研究

實驗結(jié)果表明，當(dāng)使用不同濃度的鹽酸時，0.5mol/L的HCl在酸化2h后得到63%的產(chǎn)率，隨著稀鹽酸濃度的逐漸提升（1～2mol/L），分離產(chǎn)率開始下降。這可能是由于在此鹽酸濃度（1～2mol/L）下2h的攪拌時間過長，導(dǎo)致Boc基團(tuán)脫落，目標(biāo)產(chǎn)物減少。而使用濃鹽酸攪拌1h，實驗分離產(chǎn)率為52%，可能是濃鹽酸酸化1h太劇烈導(dǎo)致生成了副產(chǎn)物，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率不高。

（3）連續(xù)流工藝的結(jié)果。根據(jù)上述釜式反應(yīng)得到的較優(yōu)實驗條件，同時根據(jù)連續(xù)流工藝的特點及圖2所示的實驗裝置和條件進(jìn)行連續(xù)流式反應(yīng)，分別合成了天然B和10B同位素的L-BPA中間體(S)-Boc-4-二羥基硼基-苯丙氨酸。在連續(xù)流式反應(yīng)下，克級反應(yīng)實驗的分離產(chǎn)率為57%，反應(yīng)時間2h。所獲得產(chǎn)物通過核磁共振圖譜進(jìn)行了定性表征。用氘代DMSO作溶劑，采用1H NMR和13C NMR表征了目標(biāo)產(chǎn)物，核磁圖及高分辨質(zhì)譜圖結(jié)果示于圖3。高分辨質(zhì)譜顯示，天然B（測試值為：C14H2011BNNaO6+=332.1289；計算值為：C14H2011BNNaO6+=332.1276）和10B同位素（測試值為：C14H2010BNNaO6+=331.1318；計算值為：C14H2010BNNaO6+=331.1212）的實驗結(jié)果與計算結(jié)果吻合，證明合成產(chǎn)物確為目標(biāo)分子。

4.結(jié)論

L-10BPA在BNCT治療腫瘤方面有著極其重要的應(yīng)用價值，是目前市場上唯一一種使用BNCT技術(shù)治療腫瘤的同位素硼藥。本研究通過設(shè)計正交實驗優(yōu)化了釜式反應(yīng)的條件，并且對反應(yīng)后處理和提純方式進(jìn)行了優(yōu)化。該方法制成的L-10BPA中間體克級反應(yīng)分離收率63%，而且通過連續(xù)流技術(shù)可以實現(xiàn)L-10BPA中間體(S)-Boc-4-二羥基10硼基-苯丙氨酸的連續(xù)和快速合成，連續(xù)流式反應(yīng)實驗的分離收率57%。本研究為進(jìn)一步工業(yè)化放大生產(chǎn)L-10BPA提供了基礎(chǔ)。