隋紅霞王培旭

(1天津市河西區(qū)東海街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心,天津 300222;2煙臺(tái)山醫(yī)院藥劑科,煙臺(tái) 264000)

氨基酸是含有氨基和羧基的一類有機(jī)化合物的通稱,氨基酸的分析技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)和整個(gè)生命科學(xué)研究以及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、質(zhì)量控制和生產(chǎn)管理等具有重要意義[1-2]。一方面谷氨酸鈉注射液是一種用于治療代謝性酸中毒、電解質(zhì)紊亂、肝性腦病的藥物,內(nèi)含谷氨酸鈉,因其無(wú)發(fā)色基團(tuán)且極性較大為高靈敏度和高選擇的分析帶巨大來(lái)挑戰(zhàn)[3-4]。另一方面,谷氨酸鈉含量的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)于藥品的質(zhì)量控制和使用效果的評(píng)價(jià)以及不良反應(yīng)的控制具有重要的意義[5],因此,谷氨酸鈉注射液中谷氨酸鈉含量的準(zhǔn)確測(cè)定是藥品質(zhì)量控制和用藥效果評(píng)價(jià)的關(guān)鍵步驟。

由于谷氨酸無(wú)發(fā)色基團(tuán)且極性較大,難以在C18色譜柱保留,無(wú)法直接測(cè)定,需要采用衍生化反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化成易電離物質(zhì)進(jìn)行間接測(cè)定[2]。高效液相色譜是分析化學(xué)中發(fā)展最快,應(yīng)用最廣的領(lǐng)域之一,具有操作方便、準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)等特性[6],使其成為臨床化學(xué)、生物學(xué)和毒物學(xué)等領(lǐng)域中有效分離和質(zhì)量監(jiān)控手段[7-8]。質(zhì)譜檢測(cè)具有選擇性好,檢測(cè)限低,較高的靈敏度,線性范圍寬,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,成本低廉,無(wú)放射,無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。本研究采用柱前衍生化技術(shù)結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜檢測(cè)法測(cè)定谷氨酸鈉注射液中谷氨酸鈉的含量,為準(zhǔn)確測(cè)定谷氨酸鈉注射液中谷氨酸鈉的含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1儀器 超高效液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀Triple TOF 5600+(AB Sciex公司,美國(guó)),Kinetex C18(2.0×100mm,1.7μm)色譜柱(Waters公司,美國(guó)),YY91001-1999型全玻璃注射器(金壇市第二注射器廠制造),H00005型超聲洗滌機(jī)(無(wú)錫超聲電子設(shè)備廠),抽濾設(shè)備(HENGAO T&D公司,中國(guó)),混合纖維素酯微孔濾膜(北京化工學(xué)校附屬工廠),2D-2型自動(dòng)電位滴定計(jì)(上海第二分析儀器廠),BT125D型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.1.2試劑 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,C5H9NO4,色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):B2216322),6-氨基己酸(6-Aminocaproic acid,IS,C6H13NO2,色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司批號(hào):RH431250),谷氨酸鈉注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司),3-溴丙基三苯基磷(3-BMP,C21H21BrP,色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司批號(hào):K2108775),三乙胺(色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠批號(hào):20211126),實(shí)驗(yàn)用水均為重蒸水。

1.2 方法

1.2.1溶液的配置 1)對(duì)照品溶液的配置。參照以下方法配制0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL的對(duì)照品溶液:稱取0.0200g谷氨酸,放入10mL容量瓶中,用重蒸水溶解定容,配制成2mg/mL的溶液;稱取0.0100g谷氨酸對(duì)照品,放入10mL容量瓶中,用重蒸水溶解定容,配制成1mg/mL的溶液;取此溶液1mL放入10mL的容量瓶中,用重蒸水定容,配制成0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液;取0.0050g谷氨酸,放入10mL容量瓶中,用重蒸水溶解定容,配制成0.5mg/mL的溶液;稱取0.0150g谷氨酸,放入10mL容量瓶中,用重蒸水溶解定容,配制成1.5mg/mL的溶液。

2)供試品溶液的配置。精密量取待測(cè)谷氨酸鈉注射液1.0mL用重蒸水溶解定容至1000mL,溶解,待測(cè)。

1.2.2樣品衍生化反應(yīng) 現(xiàn)有的氨基酸一般常使用3-BMP作為衍生化試劑,用5%三乙胺提供氨基酸與3-BMP衍生物提供反應(yīng)所需的堿性條件。

精密稱取0.0040g 3-BMP,加入1mL乙腈和水溶液,超聲溶解,即得衍生化試劑。將其放入冰箱中冷藏,避光保存。

取300μL谷氨酸和50μL內(nèi)標(biāo)工作液于聚乙烯管內(nèi),加50μL衍生化試劑,60℃下反應(yīng)30min即可完成衍生化,用于后續(xù)測(cè)定。

1.2.3色譜條件 色譜和質(zhì)譜條件:色譜柱為反相色譜柱Kinetex C18(2.0×100mm,1.7μm),流動(dòng)相的組成為0.1%甲酸水和甲醇溶液,進(jìn)樣量為1μL,流速為0.40μL/min,使用非數(shù)據(jù)依賴模式掃描谷氨酸衍生化物母離子和特征碎片分別為 450.18→320.16。

1.2.4流動(dòng)相和檢測(cè)條件的選擇 分別量取0.1%甲酸溶于水和甲醇溶液中作為流動(dòng)相A和B,在0～5～20min內(nèi)使用10%～19%～19%的流動(dòng)相B的梯度測(cè)定谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,觀察測(cè)定的靈敏度和峰形。

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 由配制的一系列對(duì)照品溶液(0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL),依次與3-BMP進(jìn)行衍生化反應(yīng)后,分別取一定量,按照1.2.3方法進(jìn)樣分析,測(cè)定峰面積,以谷氨酸的峰面積對(duì)其濃度作圖,計(jì)算回歸方程(Y=bx+a),即為谷氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取1.2.1中配置好的1mg/mL的對(duì)照品溶液,與3-BMP進(jìn)行衍生化反應(yīng)后,重復(fù)進(jìn)樣9次,按照1.2.3方法進(jìn)樣分析,測(cè)定峰面積,計(jì)算9次進(jìn)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7回收率試驗(yàn) 為了使未加標(biāo)的樣品與加標(biāo)的樣品稀釋相同的倍數(shù),在樣品中加入同體積的流動(dòng)相,即將300μL供試品溶液和300μL的1mg/mL谷氨酸對(duì)照品溶液混合,經(jīng)衍生化后,取20μL混合液進(jìn)樣。同理將300μL供試品溶液和300μL的流動(dòng)相混合,經(jīng)衍生化后,取20μL混合液進(jìn)樣。再將300μL的1mg/mL谷氨酸對(duì)照品溶液與300μL流動(dòng)相混合,經(jīng)衍生化后,取20μL混合液進(jìn)樣。重復(fù)5次,得到回收率數(shù)據(jù),對(duì)5個(gè)回收率進(jìn)行相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算。

1.2.8最低檢測(cè)限和最低定量限測(cè)定 在本實(shí)驗(yàn)條件下,由1mg/mL谷氨酸對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋,采用1.2.3方法進(jìn)樣分析,測(cè)定進(jìn)樣濃度下的信噪比(S/N),當(dāng)S/N=3時(shí)的對(duì)照品溶液中谷氨酸的濃度即為最低檢測(cè)量,當(dāng)S/N=10時(shí)的對(duì)照品溶液中谷氨酸的濃度即為最低定量限。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化條件的優(yōu)化

使用3-BMP標(biāo)記Glu的具體過(guò)程如圖1所示。圖2表明谷氨酸衍生物的母離子和靶向標(biāo)記氨基官能團(tuán)的特征碎片450.18→320.16。而后通過(guò)非數(shù)據(jù)依賴型掃描模式檢測(cè)谷氨酸,結(jié)果如圖3所示,谷氨酸在12.85min溶出。而后通過(guò)考察谷氨酸衍生物峰面積,圖4表明隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大并在100min時(shí)趨于平穩(wěn),200min時(shí)保持不變,因此,當(dāng)在60℃下衍生100min時(shí),標(biāo)記效率最高。

圖1 谷氨酸與3-BMP的衍生化反應(yīng)及化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 谷氨酸衍生物的特征碎片

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別配制0.024～1000pmol的對(duì)照品溶液,依次進(jìn)樣記錄峰面積。以谷氨酸峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖3所示,以谷氨酸的濃度對(duì)其峰面積進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為:y=0.0007x+0.003,相關(guān)系數(shù)R2=0.9999,即在0.024～1000pmol范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖3 谷氨酸衍生物的UHPLC-HRMS色譜圖

圖4 60℃下3-BMP標(biāo)記谷氨酸反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程

表1 谷氨酸衍生物工作曲線和檢測(cè)限

2.3 重復(fù)性

取低中高3個(gè)濃度的谷氨酸對(duì)照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣9次,分析操作重復(fù)性(結(jié)果如表3所示)。在進(jìn)樣量相同時(shí),各個(gè)峰面積大小接近,日內(nèi)日間RSD為2.19%～3.04%和1.05%～3.97%,表明該方法的重復(fù)性良好,可滿足對(duì)供試品的測(cè)定需求。

表2 通過(guò)日內(nèi)和日間分析確定建議方法的準(zhǔn)確度和精密度

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

按照1.2.7方法檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性,結(jié)果見(jiàn)表3,下表中樣品中谷氨酸的回收率為86.15%～97.55%,平均回收率為91.71%,RSD為1.67%～2.64%,表明該方法可準(zhǔn)確測(cè)定谷氨酸的含量,可用于谷氨酸鈉注射液中的樣品濃度測(cè)定。

表3 谷氨酸測(cè)定的回收率實(shí)驗(yàn)

2.5 最低檢測(cè)限

在本實(shí)驗(yàn)條件下,由1mmol/L谷氨酸對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋至4fmol時(shí),信噪比為3,即方法的最低檢測(cè)量為4.00fmol;當(dāng)谷氨酸對(duì)照品溶液濃度為24.25fmol時(shí),信噪比為10,即該方法的最低定量限為24.25fmol。說(shuō)明該方法的靈敏度高,可滿足檢測(cè)需求。

3 結(jié)論

選用色譜柱為Kinetex C18(2.0×100mm,1.7μm),流動(dòng)相為0.1%甲酸水和甲醇溶液,樣本中谷氨酸以3-溴丙基三苯基磷(3-BMP)進(jìn)行衍生化反應(yīng),流速為0.40μL/min,谷氨酸衍生化物母離子和特征碎片分別為450.18→320.16等實(shí)驗(yàn)條件,能較好地檢測(cè)出樣品中谷氨酸的含量。

該方法線性范圍寬,靈敏度高,準(zhǔn)確度好,可應(yīng)用到臨床研究中,檢測(cè)患者血漿中氨基酸的含量,作為阻塞性心血管疾病危險(xiǎn)的早期診斷輔助指標(biāo),為患者臨床用藥方案的制定提供參考,也可用于谷氨酸鈉注射液中谷氨酸的含量檢驗(yàn)工作中,為藥品有效成分含量檢驗(yàn)具有非常重要的作用。

利益沖突:所有作者均申明不存在利益沖突。