谷成毅，陳明亮，丁松，周游

（三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院骨科，湖北宜昌 443001）

雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一類大分子蛋白質(zhì)，分子量為289 kDa，作為細(xì)胞多種病理生理過程的關(guān)鍵調(diào)控分子，在不同的組織細(xì)胞中均有表達(dá)，在細(xì)胞病理生理過程中的作用至關(guān)重要［1］。mTOR 存在兩種不同復(fù)合物形式，即mTORC1 和mTORC2［2］。mTOR 整合細(xì)胞外多種信號(hào)刺激，參與體內(nèi)多條信號(hào)通路，影響轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成，與細(xì)胞凋亡、自噬、生長(zhǎng)等均有重要聯(lián)系［3］。mTORC 1 在干細(xì)胞自我更新和分化方面也起到很重要的作用［4］。

肌腱干細(xì)胞（tendon stem cell,TSC）是一群存在于肌腱中具有多向分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞，在合適的條件下可以分化為肌腱組織、骨骼組織或者軟骨組織［5］。有研究發(fā)現(xiàn)肌腱干細(xì)胞在肌腱病的發(fā)生、發(fā)展中也扮演著重要角色［6，7］。當(dāng)肌腱干細(xì)胞處于異常的誘導(dǎo)環(huán)境時(shí)，會(huì)朝著非肌腱細(xì)胞方向分化［8］。老齡化會(huì)使肌腱干細(xì)胞的干性降低，增殖能力、克隆能力都顯著下降，從而更易于向非肌腱細(xì)胞方向分化［9］。肌腱中殘存的干細(xì)胞對(duì)于組織的再生、修復(fù)非常重要，然而老齡化會(huì)導(dǎo)致肌腱中肌腱干細(xì)胞數(shù)目下降而且功能減弱［10］。有臨床研究表明，老齡化肌腱的愈合能力很差，嚴(yán)重影響老齡人群肌腱病的術(shù)后康復(fù)效果［11］。

mTOR 參與干細(xì)胞的更新分化，故本研究擬通過調(diào)控mTOR 蛋白觀察其對(duì)老年大鼠肌腱干細(xì)胞成肌腱分化的影響，從而找出針對(duì)老年肌腱損傷、疾病修復(fù)的新思路，為臨床提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，老年大鼠（1年，28 只）和青年大鼠（12 周，4 只），清潔級(jí)，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。體外實(shí)驗(yàn)分為老年大鼠（4 只）和青年大鼠（4 只）兩組；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為mTOR 表達(dá)（6 只）、mTOR 干擾（6 只）、GFP（6只）、空白（6 只）。

1.2 體外試驗(yàn)

1.2.1 TSCs 的分離培養(yǎng)

老年和青年SD 大鼠各4 只CO2安樂處死，取跟腱剪碎，0.25%胰酶消化1 h。4℃1 000 r/min 離心，加10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液（1×10/ml）。接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2培養(yǎng)。2 d 后換液，2～3 d 換液1 次，細(xì)胞占瓶底80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。傳至3 代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 老年大鼠TSCs 轉(zhuǎn)染

將老年大鼠TSCs 分為mTOR 表達(dá)、mTOR 干擾、GFP 和空白四組。使用腺病毒轉(zhuǎn)染制作mTOR表達(dá)、mTOR 干擾和GFP 的TSCs。取第3 代老年大鼠TSCs，通過重組腺病毒Ad-mTOR 按照預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的最大MOI 值（100）轉(zhuǎn)染，12 h 后換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)

各組細(xì)胞加入RIPA 裂解液置于冰上30 min。然后12 000 r/min 離心15 min，收集上清液，檢測(cè)總蛋白濃度。4%～20%梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，室溫5%的脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗mTOR（1∶1 000）、Raptor（1∶500）、S6K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）搖晃過夜。TBST 清洗3 遍，加二抗（1∶10 000）避光搖晃1 h，洗滌3 次。BIO-RAD 凝膠電泳圖像分析儀采圖，圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)各指標(biāo)的表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.4 肌腱修復(fù)材料制備

（1）3 瓶上述SD 老齡大鼠TSCs，腺病毒處理分為mTOR 過表達(dá)、mTOR 干擾、GFP。轉(zhuǎn)染72 h 后收細(xì)胞備用；（2）稱2.2 g 脫乙酰度＞95%的殼聚糖溶100 ml 的0.1 mol/L 的冰醋酸溶液中，配成2.15 wt%殼聚糖C 溶液。磁力攪拌器保持50℃左右攪拌4 h，121℃消毒10 min。稱5 g β-甘油磷酸鈉溶于5 ml 去離子水中，攪拌均勻得到50 wt% GP 溶液，用0.22 μm 的濾器過濾除菌。取6 ml C 溶液，再將1 ml 的GP 溶液逐滴加入到C 溶液中，混合均勻獲得C/GP溶液；（3）將水凝膠和目的細(xì)胞懸液按照2∶1 的體積比配置備用。

1.3 體內(nèi)試驗(yàn)

1.3.1 髕腱損傷與修復(fù)

將24 只老年大鼠分為mTOR 表達(dá)、mTOR 干擾、GFP 和空白四組，每組6 只。異氟醚麻醉，取仰臥位，酒精消毒雙側(cè)膝關(guān)節(jié)。以右側(cè)膝關(guān)節(jié)為例，膝屈曲30°，取正中切口，全長(zhǎng)2 cm 至髕骨上下緣，切開皮膚、筋膜顯露髕腱，使用2 mm×5 mm 的模版去掉髕腱組織，得到損傷模型。在髕腱缺損處加入50 μl 的水凝膠和實(shí)驗(yàn)細(xì)胞混合液，關(guān)閉切口，同法處理對(duì)側(cè)。待術(shù)后2 周和4 周，每組每次3 只取髕腱進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 HE 染色

制作SD 老齡大鼠髕腱損傷修復(fù)模型，分別在2周、4 周收取髕腱標(biāo)本經(jīng)處理成石蠟切片，將組織用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，后切片機(jī)冠狀面連續(xù)切片（5 μm），脫蠟后HE 染色。每組隨機(jī)取5張切片置于IX70 顯微鏡下觀察3 個(gè)視野中髕腱缺損的修復(fù)情況。組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：從纖維結(jié)構(gòu)、纖維排列、核圓程度、炎癥細(xì)胞、靜脈數(shù)量和細(xì)胞數(shù)量等方面進(jìn)行評(píng)分。

1.3.3 免疫組化

先石蠟組織脫蠟后水化，再用胰酶修復(fù)法修復(fù)，使用SCX、Col1 的1 抗抗體溶液。染色液鏡下染色蘇木素染核，90s 后60℃水浴環(huán)境下返藍(lán)10 min。梯度乙醇脫水，常溫下晾干，中心樹膠封片。使用光密度（optical density,OD）計(jì)量。

1.3.4 生物力學(xué)測(cè)試

采用CO2安樂處死模型大鼠。取2、4 周大鼠髕腱缺損模型的完整后肢，保留髕骨和脛骨髕腱，使用生物力學(xué)測(cè)試儀進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)，測(cè)量修復(fù)組織的最大損毀強(qiáng)度（單位N）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，資料呈正態(tài)分布時(shí)，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；資料呈非正態(tài)分布時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 青年與老年大鼠TSCs 的mTOR 相關(guān)蛋白表達(dá)比較

青年與老年大鼠肌腱干細(xì)胞中mTOR 及相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot 見表1 所示：mTOR、Raptor、P-Raptor 表達(dá)老年組顯著高于青年組（P＜0.05）；而AKT、P-Akt、S6K、P-S6k 兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 青年與老年大鼠TSCs 的mTOR 相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 1 Comparison of relative expression mTOR-related proteins in TSCs between young and old rats( ±s)

表1 青年與老年大鼠TSCs 的mTOR 相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 1 Comparison of relative expression mTOR-related proteins in TSCs between young and old rats( ±s)

指標(biāo)mTOR Raptor P-Raptor Akt P-Akt S6k P-S6k青年組（n=3）0.9±0.1 2.2±0.3 0.7±0.0 2.3±0.1 0.8±0.0 6.2±0.6 4.7±0.4老年組（n=3）1.8±0.1 4.1±0.3 2.1±0.1 2.3±0.0 0.8±0.1 6.2±0.6 4.6±0.4 P 值0.032 0.028 0.012 0.083 0.102 0.096 0.094

2.2 老年大鼠TSCs 體外轉(zhuǎn)染后mTOR 相關(guān)蛋白表達(dá)比較

老年大鼠TSCs 體外轉(zhuǎn)染后mTOR 及相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot 見表2。mTOR、Raptor 及P-Raptor表達(dá)從高到低的順序：mTOR 的表達(dá)組＞GFP 組＞mTOR 干擾組（P＜0.05）；而AKT、P-Akt、S6K 和P-S6k 的表達(dá)三組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 老年大鼠TSCs 體外轉(zhuǎn)染后mTOR 相關(guān)蛋白表達(dá)比較( ±s)Table 2 Comparison of relative expression mTOR-related proteins in TSCs transinfected differently in the old rats( ±s)

表2 老年大鼠TSCs 體外轉(zhuǎn)染后mTOR 相關(guān)蛋白表達(dá)比較( ±s)Table 2 Comparison of relative expression mTOR-related proteins in TSCs transinfected differently in the old rats( ±s)

指標(biāo)P 值mTOR Raptor P-Raptor Akt P-Akt S6k P-S6k mTOR 表達(dá)組（n=3）3.9±0.1 1.0±0.0 4.2±0.6 1.2±0.1 3.4±0.5 4.1±0.7 3.7±0.4 mTOR 干擾組（n=3）1.2±0.0 0.3±0.0 1.5±0.2 1.2±0.0 3.1±0.4 3.9±0.6 3.3±0.4 GFP 組（n=3）2.1±0.1 0.6±0.1 2.1±0.2 1.2±0.1 3.6±0.6 4.1±0.6 3.6±0.4 0.015 0.021 0.032 0.076 0.082 0.091 0.094

2.3 體內(nèi)修復(fù)檢測(cè)結(jié)果

HE 染色觀察髕腱損傷的修復(fù)效果見圖1、表3，與術(shù)后2 周相比，術(shù)后4 周四組HE 組織評(píng)分均顯著增加（P＜0.05），相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分?jǐn)?shù)從高到低的順序依次為mTOR 干擾組＞GFP 組＞mTOR 表達(dá)組＞空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組織學(xué)評(píng)分mTOR 干擾組相對(duì)其他三組纖維排列相對(duì)更整齊，炎癥細(xì)胞數(shù)量更少，靜脈數(shù)量和細(xì)胞數(shù)量明顯增多。

表3 老年大鼠髕腱修復(fù)檢測(cè)結(jié)果比較（±s）Table 3 Comparison of assay consequences after patellar tendon repair in the old rats( ±s)

表3 老年大鼠髕腱修復(fù)檢測(cè)結(jié)果比較（±s）Table 3 Comparison of assay consequences after patellar tendon repair in the old rats( ±s)

指標(biāo)HE 組織評(píng)分時(shí)間點(diǎn)2 周4 周P 值2 周4 周P 值2 周4 周P 值2 周4 周P 值P 值0.016 0.021 Col1 組化(OD)0.006 0.005 SCX 組化(OD)0.008 0.009最大損毀強(qiáng)度(N)0.038 0.041空白對(duì)照組（n=6）2.3±0.1 3.3±0.7 0.042 1.1±0.1 1.1±0.1 0.085 0.9±0.1 1.0±0.1 0.083 15.0±0.1 24.1±0.1 0.044 mTOR 表達(dá)組（n=6）5.1±0.8 7.2±1.0 0.047 0.4±0.1 0.4±0.1 0.079 0.4±0.1 0.4±0.1 0.069 17.1±0.2 26.1±0.3 0.041 mTOR 干擾組（n=6）13.2±1.2 17.5±1.4 0.038 4.3±0.2 4.5±0.3 0.063 5.1±0.4 5.6±0.5 0.093 36.2±0.2 46.3±0.3 0.037 GFP 組（n=6）8.1±1.0 11.5±1.2 0.046 2.7±0.2 2.9±0.2 0.068 2.1±0.1 2.2±0.1 0.077 25.1±0.2 36.2±0.2 0.035

石蠟切片免疫組化Col1 和SCX 檢測(cè)結(jié)果見圖2、圖3、表3，與術(shù)后2 周相比，術(shù)后4 周，Col1及SCX 的表達(dá)均無顯著變化（P＞0.05），相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，四組間Col1、SCX 的表達(dá)定量從高到低依次為mTOR 干擾組＞GFP 組＞空白組＞mTOR 表達(dá)組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 四組髕腱損傷修復(fù)組織學(xué)觀察（Col1 免疫組化，×100 μm）。2a, 2e: 空白對(duì)照；2b, 2f: mTOR 表達(dá)組；2c, 2g: mTOR 干擾組；2d, 2h: GFP 組。Figure 2. Histology of patellar tendon injury repair in four groups (Col1 immunohistochemistry, ×100 μm). 2a, 2e: Blank control. 2b, 2f:mTOR expression group.2c,2g:mTOR interference group.2d,2h:GFP group.

圖3 四組髕腱損傷修復(fù)組織學(xué)觀察（SCX 免疫組化×100 μm）。3a, 3e: 空白對(duì)照；3b, 3f: mTOR 表達(dá)組；3c, 3g: mTOR 干擾組；3d, 3h: GFP 組。Figure 3.Histology observation of patellar tendon injury repair in four groups(SCX immunohistochemistry×100 μm).3a,3e:Blank control.3b,3f:mTOR expression group.3c,3g:mTOR interference group.3d,3h:GFP group.

生物力學(xué)結(jié)果見表3，與術(shù)后2 周相比，術(shù)后4周四組最大損毀強(qiáng)度均顯著增加（P＜0.05），相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，最大損毀強(qiáng)度值從大到小依次為mTOR 干擾組＞GFP 組＞空白組＞mTOR 表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

mTOR 是一類大分子蛋白質(zhì)，存在兩種不同復(fù)合物形式，即mTORC1 和mTORC2［10，12］。mTORC1 由mTOR、RAPTOR 和mLST8 組成［3］。mTORC 1 在干細(xì)胞自我更新和分化方面也起到很重要的作用［4］。mTOR 整合細(xì)胞外多種信號(hào)刺激，參與體內(nèi)多條信號(hào)通路［13，14］，影響轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成，與細(xì)胞凋亡、自噬和生長(zhǎng)等生命活動(dòng)均有很重要的聯(lián)系［15～17］。有研究表明使用mTOR 抑制劑可以延長(zhǎng)壽命減緩衰老，說明mTOR 在衰老的過程中表達(dá)是增加的［18］。本研究通過檢測(cè)青年和老年大鼠TSCs 中mTOR 及與其相關(guān)的蛋白表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)mTOR、RAPTOR 在老年大鼠細(xì)胞中表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于青年大鼠，從而證實(shí)了mTOR 的表達(dá)會(huì)隨衰老而增強(qiáng)。眾所周知，老齡化是導(dǎo)致肌腱損傷修復(fù)變得更加困難的一個(gè)重要因素，部分原因就是老齡化過程會(huì)使肌腱組織中的肌腱干細(xì)胞向肌腱方向分化的能力減弱［5］。mTOR 對(duì)于干細(xì)胞的自我更新和分化很重要，而且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示老年大鼠的mTOR 蛋白表達(dá)相對(duì)青年大鼠增加，故此推斷可能是mTOR 蛋白表達(dá)的增加抑制老年大鼠肌腱干細(xì)胞的成肌腱分化，從而導(dǎo)致老齡化肌腱損傷修復(fù)能力減弱。

有研究通過構(gòu)建肌腱損傷模型，在病變部位植入自體或異體來源干細(xì)胞，調(diào)控干細(xì)胞的分化方向達(dá)到促進(jìn)肌腱再生修復(fù)的作用［19～21］。Kokubu 等［22］將脂肪來源的干細(xì)胞注射到跟腱損傷模型缺損處，證明了脂肪來源的干細(xì)胞能夠促進(jìn)損傷跟腱的修復(fù)。從曉霞等［23］研究發(fā)現(xiàn)，AKT-mTOR 軸是肌腱分化關(guān)鍵調(diào)節(jié)信號(hào)，并為肌腱損傷和肌腱相關(guān)疾病提供了新的治療靶點(diǎn)。本研究通過腺病毒轉(zhuǎn)染將控制mTOR 蛋白表達(dá)的老齡大鼠TSCs 混合物植入大鼠髕腱缺損處建立髕腱缺損修復(fù)模型，通過調(diào)節(jié)mTOR 蛋白的表達(dá)來探索修復(fù)效果的差異。研究結(jié)果顯示，HE 染色抑制mTOR 蛋白表達(dá)組中肌腱類似組織更多，其組織學(xué)評(píng)分、纖維結(jié)構(gòu)評(píng)分均高于mTOR 蛋白過表達(dá)組。免疫組化結(jié)果也顯示抑制mTOR 蛋白表達(dá)組Col1 表達(dá)均高于mTOR 蛋白過表達(dá)組。本研究的結(jié)果說明抑制mTOR 蛋白的表達(dá)能夠促進(jìn)老齡大鼠肌腱干細(xì)胞成肌腱分化，利于老年肌腱損傷組織的修復(fù)。

有研究發(fā)現(xiàn)，mTOR 蛋白的活性在肌腱組織損傷后出現(xiàn)改變，參與肌腱組織的修復(fù)過程［24］。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過喂飼mTOR 蛋白抑制劑，可使損傷的肌腱組織在結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)上與成年小鼠的肌腱相似［25］。表明mTOR 蛋白參與了肌腱組織損傷后的修復(fù)過程。本實(shí)驗(yàn)生物力學(xué)研究結(jié)果顯示，抑制mTOR蛋白表達(dá)后，修復(fù)的肌腱組織韌性更強(qiáng)，抗拉能力好，組織損傷修復(fù)效果相對(duì)較好。將來可通過對(duì)該信號(hào)通路進(jìn)一步深入研究，明確其作用機(jī)制和下游的信號(hào)蛋白，為臨床上使用藥物抑制mTOR 蛋白的表達(dá)，來預(yù)防和治療老齡化的肌腱損傷和肌腱病提供理論依據(jù)。

本研究局限性在于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性別差異（雌性動(dòng)物缺乏）、數(shù)量少、隨訪觀察時(shí)間短。然而，本研究結(jié)果支持了這樣的假設(shè)，即mTOR 蛋白調(diào)控TSCs 向成肌腱方向分化，可以調(diào)節(jié)老年大鼠肌腱損傷的修復(fù)。筆者認(rèn)為，mTOR 蛋白在老化肌腱損傷修復(fù)中起著重要作用，但是精確分子機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步深入研究。