李巖鵬?王兵?沈崢?徐冬梅?王振杰

摘要：Thaxtomin是由瘡痂鏈霉菌（Streptomyces scabies）、酸性瘡痂鏈霉菌（Streptomyces acidiscabies）等植物病原菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物，具有新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)和良好的除草活性，是美國環(huán)境保護(hù)局批準(zhǔn)用作農(nóng)田除草劑的主要活性物質(zhì)，是一類非常有潛力的新一代生物除草劑。本文主要從thaxtomin結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生物合成及調(diào)控機(jī)制、衍生物合成等方面，對其研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，總結(jié)討論了thaxtomin產(chǎn)量提高及衍生物合成的策略，并對thaxtomin的后續(xù)研究進(jìn)行了探討。

關(guān)鍵詞：生物除草劑；thaxtomin；基因簇；生物合成；高產(chǎn)；thaxtomin衍生物

中圖分類號(hào)：R9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Research progresses on biosynthesis of the bioherbicide thaxtomin

Li Yanpeng， Wang Bing， Shen Zheng， Xu Dongmei， and Wang Zhenjie

（Hebei Vocational University of Industry Technology， Shijiazhuang 050091）

Abstract Thaxtomins are natural products produced by plant-pathogenic Streptomyces strains such as S. scabies and S. acidiscabies， which have novel chemical structures and excellent herbicidal activity， and have been developed as the main active component of a bioherbicide approved by the United States Environmental Protection Agency. Therefore， thaxtomins are the next-generation bioherbicide with great potential. In the paper， the research progresses of thaxtomins were reviewed from several aspects， including structure characteristics， biosynthesis， and regulatory mechanism. The strategies to increase thaxtomin yield and synthesize thaxtomin derivatives were summarized and discussed， and the subsequent researches on thaxtomins were also discussed.

Key words Bioherbicide; Thaxtomin; Gene cluster; Biosynthesis; High yield; Thaxtomin derivatives

雜草是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最主要威脅之一，據(jù)Phillips McDougall發(fā)布，中商產(chǎn)業(yè)研究院統(tǒng)計(jì)預(yù)測，2020年全球主要農(nóng)藥產(chǎn)品市場中除草劑、殺菌劑、殺蟲劑占據(jù)了絕大部分份額，其中除草劑份額約為44.18%[1]。目前雜草防治主要依賴化學(xué)除草劑，然而隨著草甘膦等化學(xué)除草劑的廣泛使用，導(dǎo)致耐藥性雜草產(chǎn)生，并且生態(tài)環(huán)境正受到威脅[2]。因此，開發(fā)高效環(huán)保的新型除草劑刻不容緩，而天然產(chǎn)物來源的除草劑由于其靶點(diǎn)的多樣性及環(huán)境友好性越來越受到重視，是重要的開發(fā)方向。Thaxtomin是由酸性瘡痂鏈霉菌等植物病原菌產(chǎn)生的哌嗪二酮類化合物，具有新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作為除草劑的新型活性模式[3]。因?yàn)楦咝А⒌投?、低殘留的?yōu)良特征，商品名為MBI-005的滅活酸性瘡痂病鏈霉菌菌株被美國環(huán)境保護(hù)局（EPA）批準(zhǔn)用于控制多種農(nóng)作物雜草的生長，其主要成分是thaxtomin A， 具有很大的應(yīng)用價(jià)值和市場潛力[4-5]。本文概述了thaxtomin類化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、作用機(jī)制、生物合成調(diào)控、高產(chǎn)策略及衍生物合成等方面的研究進(jìn)展。同時(shí)，也對未來thaxtomin高產(chǎn)菌株的分子育種和新型類似物的開發(fā)和應(yīng)用進(jìn)行了探討。

1 Thaxtomin化合物的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制

1989年，加拿大農(nóng)業(yè)部馬鈴薯研究中心King等[6]研究人員首次從感染瘡痂病的馬鈴薯塊莖中分離并鑒定到thaxtomin A（1）和thaxtomin B（4）兩種植物毒素（圖1）。為了紀(jì)念美國著名植物病理學(xué)家Roland Thaxter （首次確定了馬鈴薯瘡痂病的致病菌），研究者將該類化合物命名為“thaxtomin”。隨后，該團(tuán)隊(duì)又陸續(xù)分離鑒定了thaxtomin C（3）等9種類似物[7-9]。Thaxtomin類化合物是由4-硝基色氨酸的α-羧基（α-氨基）和苯丙氨酸的α-氨基（α-羧基）相互脫水縮合，形成的含有2，5-二酮哌嗪結(jié)構(gòu)的二肽。不同的thaxtomin類似物，其結(jié)構(gòu)差異在于兩個(gè)氨基酸的α-氨基氫是否被甲基取代，苯丙氨酸中C2氫及苯環(huán)上的3個(gè)氫是否被羥基取代[10]（圖1）。

其中，thaxtomin A是馬鈴薯瘡痂病原菌產(chǎn)生的thaxtomin類似物中最主要的植物毒素，活性最高[10]。后續(xù)研究表明，thaxtomin化合物不僅會(huì)在馬鈴薯、胡蘿卜等塊根上引發(fā)瘡痂病，還具有廣泛的引起單/雙子葉植物幼苗發(fā)病的能力[11]。當(dāng)thaxtomin A濃度較低時(shí)（10～20 μmol/L），會(huì)引起植物細(xì)胞膨大，根和芽發(fā)育遲緩；而當(dāng)thaxtomin A產(chǎn)量濃度較高時(shí)（50～

100 μmol/L），會(huì)抑制植物幼苗生長，造成組織壞死和幼苗死亡。2001年，King等[3]首次報(bào)道了thaxtomin作為除草劑的活性。通過植物生長抑制活性實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)8種thaxtomin類化合物均表現(xiàn)出了一定的雜草生長抑制活性。其中，thaxtomin A對浮萍屬和剪股穎屬植物的GR50值有效劑量分別在12和5 ppb，抑制活性最為顯著，強(qiáng)于包括乙酰乳酸酶在內(nèi)的大多數(shù)已經(jīng)商品化的除草劑；此外，thaxtomin A對擬南芥屬和糠穗草也有抑制活性，ID50分別為10和25 ppb，也強(qiáng)于多數(shù)市售除草劑。同時(shí)，thaxtomin引起的癥狀與已知纖維素生物合成抑制劑，如雙氯苯尼和異沙苯非常相似，皆為發(fā)育不良和根尖膨大等。2009年，Bischoff等[12]發(fā)現(xiàn)用thaxtomin A處理擬南芥幼苗后，植物細(xì)胞壁中的結(jié)晶纖維素減少，果膠和半纖維素含量增加。同時(shí)，細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá)情況也發(fā)生了改變。以上研究證明thaxtomin A能夠影響植物纖維素合成，作用靶點(diǎn)為植物細(xì)胞壁，但是其具體作用機(jī)制仍不清楚。2013年，美國Marrone Bio Innovations （MBI）公司申請專利，證實(shí)thaxtomin可在有機(jī)水稻種植體系中有效的防治莧菜、芒稗和莎草等雜草[13]。此外，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)一種或多種thaxtomin和一種或多種其他化學(xué)除草劑組合使用時(shí)，可提高雜草的控制效果，還能降低其他除草劑的用量[14]。2008年諾維信生物股份有限公司公布專利，公開書中表明使用thaxtomin還可以減少/消除水體中的藻類[15]。2015年，天津大學(xué)Zhang等[16]全化學(xué)合成了thaxtomin A及3種衍生物，并對其作為除草劑的生物活性進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果顯示thaxtomin A等4種類似物均對油菜、反枝莧和苘麻具有較好的抑制活性。其中，在低劑量下（187.5 g/ha），thaxtomin A活性與除草劑二氯硝基苯相當(dāng)，甚至更強(qiáng)。此外，這4種化合物對不同作物均表現(xiàn)出良好的選擇性，證明了其具有良好的安全性。

2 Thaxtomin 生物合成機(jī)制

2.1 Thaxtomin生物合成途徑

Thaxtomin 基因簇一般位于瘡痂鏈霉菌（S. scabies）、腫痂鏈霉菌（S. turgidiscabies）等植物瘡痂病病原菌基因組中的保守的“毒力島” （pathogenicity island， PAI）[17]。以最主要且研究最完善的代謝產(chǎn)物thaxtomin A為例，其基因簇長約18 kb，包含7個(gè)基因（txtR、txtA、txtB、txtE、txtD、txtC和txtH） （圖2A）。其中txtR編碼thaxtomin A生物合成途徑中的正調(diào)控因子[18]，txtA和txtB編碼NRPS合成酶[19]，txtE 和txtC 編碼細(xì)胞色素P450蛋白[20-21]，研究發(fā)現(xiàn)txtC屬于一個(gè)雙功能細(xì)胞色素P450蛋白，能夠在兩個(gè)不同的位置對雙酮丙哌嗪底物thaxtomin D進(jìn)行連續(xù)的脂肪族和芳香羥基化，生成thaxtomin A[22]。研究表明，txtH編碼蛋白屬于MbtH-like protein（MLP）家族，該類蛋白通常與NRPS酶行使正常功能相關(guān)，可促進(jìn)NRPS合成酶的溶解和腺苷化，而缺失txtH基因會(huì)顯著降低thaxtomin A的產(chǎn)生[23]。最近的研究發(fā)現(xiàn)來自不同細(xì)菌的非同源MbtH蛋白作為分子伴侶促進(jìn)NRPS合成酶TxtA和TxtB的可溶性和腺苷化，這種活性依賴于蛋白結(jié)構(gòu)中保守的氨基酸而非相似性。同時(shí)，不同來源的MLP蛋白能夠互補(bǔ)內(nèi)源性TxtH編碼基因缺失菌株中thaxtomin A的生物合成[24]。

Thaxtomin A的生物合成包括多個(gè)步驟（圖2B）：首先是L-4-硝基色氨酸底物的合成，其中TxtD催化精氨酸發(fā)生氧化反應(yīng)生成一氧化氮（NO）和瓜氨酸[25]。其次，TxtE再催化生成的NO和色氨酸反應(yīng)生成L-4-硝基色氨酸[21]。再次，NRPS合成酶TxtA和TxtB以苯丙氨酸和4-硝基色氨酸為前體，合成2，5-二酮哌嗪化合物thaxtomin D[19]。最后，細(xì)胞色素P450酶TxtC催化thaxtomin D完成后修飾，獲得終產(chǎn)物thaxtomin A [26-27]。

2.2 Thaxtomin生物合成調(diào)控

與其他鏈霉菌來源抗生素一樣，thaxtomin的生物合成受到了包括途徑特異性調(diào)控和多效調(diào)控等多層次復(fù)雜而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控。Thaxtomin A基因簇中含有一個(gè)途徑特異性調(diào)控基因txtR，位于txtE和txtA基因之間。TxtR調(diào)控蛋白屬于AraC/XylS家族成員，其C端是具有AraC/XylS信號(hào)特征的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，N端是配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該蛋白通過作用于txtA和txtE的啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控thaxtomin的生物合成。當(dāng)失活txtR基因后，txtA、txtB以及txtC基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，thaxtomin A不再合成，而過表達(dá)txtR則大幅度提高了thaxtomin A的產(chǎn)量，結(jié)果表明TxtR在thaxtomin 生物合成過程中發(fā)揮著正調(diào)控作用。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)纖維二糖可以通過和TxtR結(jié)合提高txtR和其他thaxtomin合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而激活thaxtomin的生物合成[18]。另外，S. scabiei中還存在一個(gè)thaxtomin生物合成的負(fù)調(diào)控基因cebR，其編碼蛋白可與thaxtomin基因簇中兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。其中，一個(gè)位點(diǎn)位于的txtR的上游，另一個(gè)位點(diǎn)位于txtAB基因內(nèi)。纖維二糖（cellobiose）或者纖維三糖（cellotriose）作為誘導(dǎo)物，可與CebR蛋白結(jié)合，使其從基因簇上解離來啟動(dòng)thaxtomin基因簇的轉(zhuǎn)錄；cebR基因的敲除失活會(huì)解除thaxtomin A的反饋抑制作用，同時(shí)導(dǎo)致thaxtomin A的過量產(chǎn)生[28]。除此以外，在S. scabiei中thaxtomin A的生物合成至少還受到5個(gè)bld家族全局調(diào)控因子的調(diào)控。比如，研究發(fā)現(xiàn)敲除失活bldA，bldC，bldD，bldG和bldH/adpA 會(huì)導(dǎo)致thaxtomin A的合成降低或喪失。其中，4種突變株中txtR的轉(zhuǎn)錄表達(dá)大幅降低，所有的突變株均表現(xiàn)出已知或預(yù)測的thaxtomin表達(dá)的降低。以上研究均表明，在S. scabies中thaxtomin的生物合成受到bld 基因編碼產(chǎn)物的全局調(diào)控[29]，而thaxtomin的生物合成是受到了復(fù)雜而精密的調(diào)控。

3 Thaxtomin衍生物的生物合成

3.1 前體導(dǎo)向的thaxtomin衍生物合成

底物的寬泛性影響了終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性。在thaxtomin的生物合成過程中，底物如L-色氨酸，L-精氨酸，L-苯丙氨酸以及L-4-硝基色氨酸，分別接受TxtD、TxtE、TxtA和TxtB的催化，最終合成thaxtomin產(chǎn)物。因此，可通過尋找寬泛性的酶基因，通過合成生物學(xué)手段來達(dá)到提高終產(chǎn)物的多樣性的目的。

Thaxtomin基因簇中txtE編碼蛋白對色氨酸外的底物選擇具有高度的靈活性[30-31]，NRPS合成酶TxtAB對帶有不同取代基的苯丙氨酸和色氨酸類似物具有一定的底物容忍性，Jiang等[32]通過在thaxtomin產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入5-氟-L-色氨酸產(chǎn)生了1種新的衍生物5-F-thaxtomin A，除草劑活性顯示其半數(shù)抑制劑量[I50為（0.56±0.01） ?mol/L]，稍差于thaxtomin A [I50=（0.45±0.05） ?mol/L]（圖3A）。Winn等[38]將一系列在C4位帶有F、Cl、Br等集團(tuán)的色氨酸類似物添加到含有txtAB表達(dá)基因的白色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，導(dǎo)致菌體產(chǎn)生了多種thaxtomin D 類似物（圖3B）。類似地，他們把以上色氨酸類似物添加到含有txtABC表達(dá)基因的白色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，菌體產(chǎn)生了多種羥基化的thaxtomin A類似物。前期研究表明，在鼠傷寒沙門菌（ATCC37845）中色氨酸合酶能催化一系列的吲哚衍生物為底物與L-絲氨酸縮合，生成各種色氨酸衍生物[33-37]。進(jìn)一步地，Winn等[38]將來源于沙門氏菌的色氨酸合酶trpS基因與NRPS基因txtA和txtB進(jìn)行組裝，加入強(qiáng)啟動(dòng)子，在白色鏈霉菌宿主中進(jìn)行異源表達(dá)，最終獲得了一系列以吲哚衍生物為前體的thaxtomin D衍生物（圖3C）。但遺憾的是，他們并未對以上這些thaxtomin衍生物進(jìn)行活性測試。

3.2 一鍋法體外生物合成thaxtomin衍生物

Jiang等[39]研究了TxtE和TxtC的催化結(jié)構(gòu)，通過添加不同長度的氨基酸接頭，重構(gòu)并驗(yàn)證了不同嵌合體酶的催化效果，確定了帶有14個(gè)氨基酸接頭的嵌合體是芳香族硝化生物最佳催化劑。通過將TxtE和TxtC改造后的最佳的嵌合體酶TB14和TCB14與TxtA、TxtB按照一定的順序在體外條件下進(jìn)行生物合成反應(yīng)，首先獲得了中間體thaxtomin D，然后進(jìn)一步獲得thaxtomin A。通過將4種酶體外混合，利用其對底物的寬泛性，加入多種簡單的氨基酸底物，合成了124個(gè)thaxtomin類似物（圖4）。選取其中5個(gè)類似物（21Me-Thx A、21Me-Thx D、desnitro-4-Me-Thx D、6F-20F-Thx D和 21N3-Thx D）以及thaxtomin A進(jìn)行除草劑活性測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有21Me-Thx A活性與thaxtomin A相當(dāng)[（0.41±0.01） ?mol/L vs （0.39±0.03） ?mol/L]，其他幾個(gè)活性均弱于thaxtomin A。

3.3 基于NRPS合成酶及后修飾酶改造的衍生物合成

通過改造生物合成過程中的關(guān)鍵性修飾酶和合成酶基因，可有目的性的獲得特定的thaxtomin衍生物。山東大學(xué)周甜甜等[40]通過敲除thaxtomin基因簇中的TxtC編碼基因，接著定點(diǎn)失活TxtA或/和TxtB酶編碼基因中與甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域相關(guān)活性位點(diǎn)，獲得了高活性代謝產(chǎn)物thaxtomin C、des-N-methythaxtomin C和des-N-methythaxtomin D衍生物。其中，點(diǎn)突變txtA的重組菌，相較于未修飾的異源表達(dá)菌，thaxtomin C的產(chǎn)量提高了30%。點(diǎn)突變txtB基因獲得了des-N-methylthaxtomin C和des-N-methythaxtomin D（圖5A），而同時(shí)點(diǎn)突變txtA和txtB 獲得了des-N-methylthaxtomin C（圖5B）。

總結(jié)來看，盡管通過多種生物合成方法產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)多樣的thaxtomin衍生物，但大部分新結(jié)構(gòu)的除草劑活性未經(jīng)測試。測試的幾個(gè)活性衍生物中，還未發(fā)現(xiàn)比天然thaxtomin活性更優(yōu)的化合物。后續(xù)研究不僅需要加大新結(jié)構(gòu)的活性測試工作外，還需拓展合成生物學(xué)改造尺度，以獲得活性更好的衍生物。

4 Thaxtomin 高產(chǎn)優(yōu)化策略

目前，已知thaxtomin的產(chǎn)生菌主要有4種，分別是瘡痂鏈霉菌（S. scabies）、酸性瘡痂鏈霉菌（S. acidiscabies）、番薯鏈霉菌（S. ipomoea）以及腫痂鏈霉菌（S. turgidiscabies）。盡管美國EPA已經(jīng)批準(zhǔn)MBI公司生物除草劑MBI-005（滅活的酸性瘡痂鏈霉菌RL110菌）的使用，但較低的發(fā)酵單位極大的限制了該品種的產(chǎn)業(yè)化?；诤铣缮飳W(xué)技術(shù)的快速發(fā)展及thaxtomin生物合成和調(diào)控機(jī)制研究的深入，科學(xué)家通過對產(chǎn)生菌及thaxtomin生物合成基因簇進(jìn)行遺傳操作來提高thaxtomin的發(fā)酵產(chǎn)量。

4.1 基于途徑特異性調(diào)控機(jī)制的原產(chǎn)菌中產(chǎn)量提高策略

Francis等[28]研究者以S. scabies 97.22為出發(fā)菌，通過敲除thaxtomin合成的負(fù)調(diào)控基因cebR，獲得了比野生菌產(chǎn)量高6倍左右的thaxtomin A突變株。

4.2 基于簡單的異源表達(dá)的產(chǎn)量提高策略

將天然產(chǎn)物生物合成基因簇在遺傳背景清晰的模式宿主中進(jìn)行異源表達(dá)成為提高產(chǎn)物產(chǎn)量的一種有效手段。Jiang等[32]將來源于兩種瘡痂病原菌的“毒力島” PAI（大小分別為177和674 kb）轉(zhuǎn)移到天藍(lán)色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌和阿維鏈霉菌等常用的5種鏈霉菌異源宿主中，通過發(fā)酵培養(yǎng)及分離純化，成功獲得了thaxtomin類化合物。其中，在白色鏈霉菌中異源表達(dá)的thaxtomin類化合物產(chǎn)量最高。但“毒力島”PAI異源表達(dá)可能在宿主中存在遺傳不穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致改造的菌株不穩(wěn)定[5]。因此，Jiang等[32]進(jìn)一步應(yīng)用TAR（transformation-associated recombination）的方法克隆了瘡痂鏈鏈霉菌thaxtomin A的生物合成基因簇，并將它轉(zhuǎn)化至白色鏈霉菌J1074中異源表達(dá)，通過發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化將菌株中thaxtomin A的發(fā)酵產(chǎn)量提高到原產(chǎn)菌的20倍以上，約～170 mg/L。

4.3 基于合成生物學(xué)和代謝工程的產(chǎn)量提高策略

Li等[41]利用PCR和Gibson連接的方法，將來源于酸瘡鏈霉菌的thaxtomin A基因簇克隆到pSET152載體上，通過接合轉(zhuǎn)移整合至中微白黃鏈霉菌等宿主基因組。后期通過采用組合代謝工程策略，將敲除負(fù)調(diào)控基因cebR或者高表達(dá)正調(diào)控基因txtR等手段組合起來對菌株進(jìn)行遺傳改造。通過對重組菌進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，在搖瓶水平上，將thaxtomin類似物的產(chǎn)量提升至728 mg/L，在5 L小型發(fā)酵罐水平上，提升至1973 mg/L。其中，thaxtomin A產(chǎn)量約為424 mg/L。

山東大學(xué)周甜甜等[40]通過ExoCET技術(shù)直接克隆了thaxtomin生物合成基因簇，并在白色鏈霉菌中成功獲得thaxtomin A和thaxtomin C產(chǎn)物。進(jìn)一步用kasOp*-57p雙向組成型強(qiáng)啟動(dòng)子替換掉調(diào)控基因txtR，利用kasOp*啟動(dòng)子表達(dá)txtDE，57p表達(dá)txtABHC。將改造后的基因簇轉(zhuǎn)入宿主后，thaxtomin A產(chǎn)量提升了12%，thaxtomin C提升了40%。

Zhao等[43]利用基因簇直接克隆的方法（CATCH），首先克隆獲得thaxtomin A基因簇，然后將其接合轉(zhuǎn)移至3種常用異源宿主（天藍(lán)色鏈霉菌、白色鏈霉菌和委內(nèi)瑞拉鏈霉菌），也成功實(shí)現(xiàn)了thaxtomin A的異源表達(dá)。與其他團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果不同，該基因簇在天藍(lán)色鏈霉菌中獲得了最高的產(chǎn)量，其次是白色鏈霉菌，而在委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中該基因簇為沉默狀態(tài)。應(yīng)用基于CRISPR/Cas9和釀酒酵母的同源重組系統(tǒng)將基因簇中txtE、txtA和txtC啟動(dòng)子替換為kasOp*系列組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，thaxtomin A的產(chǎn)量較野生基因簇有了大幅度提高。通過進(jìn)一步組合使用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子，獲得了多株thaxtomin A產(chǎn)量更高產(chǎn)的菌，實(shí)驗(yàn)室搖瓶產(chǎn)量最高達(dá)到501 mg/L。另外，Zhao等[44]開發(fā)了以σECF17因子為基礎(chǔ)的鏈霉菌正交轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，通過基因簇重構(gòu)的方式，獲得了ECF17啟動(dòng)子控制的thaxtomin A生物合成基因簇，將重構(gòu)的基因簇重新在白色鏈霉菌中表達(dá)，產(chǎn)量達(dá)到239 mg/L，比野生型提高了10倍以上。

總體來講，以上的研究不僅涉及到提高次級代謝產(chǎn)物表達(dá)的常用策略，比如過表達(dá)正調(diào)控基因txtR，敲除負(fù)調(diào)控基因cebR。同時(shí)，也應(yīng)用到了先進(jìn)的基因簇克隆及編輯技術(shù)，比如基因簇的直接克?。–ATCH、TAR、ExoCET），對基因簇多個(gè)基因啟動(dòng)子的同時(shí)改造等，這使得針對thaxtomin基因簇的改造更加高效。另外，新型ECF17誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)等高效調(diào)控元件的應(yīng)用也可大幅提高thaxtomin的產(chǎn)量。然而，目前對thaxtomin高產(chǎn)策略主要還是體現(xiàn)在對其基因簇轉(zhuǎn)錄層面的調(diào)控。但事實(shí)上，除了轉(zhuǎn)錄層次外，目標(biāo)產(chǎn)物的高產(chǎn)還應(yīng)涉及到其他層次的調(diào)控，比如翻譯水平調(diào)控等，后續(xù)研究可組合優(yōu)化多種層次各因素來進(jìn)一步提高thaxtomin產(chǎn)量。

5 總結(jié)與展望

當(dāng)前，草甘膦等化學(xué)除草劑的廣泛使用對生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的破壞，并且導(dǎo)致了耐藥性雜草的產(chǎn)生，研發(fā)新型、低毒、低殘留的綠色農(nóng)藥對于促進(jìn)我國農(nóng)藥產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的優(yōu)化調(diào)整，發(fā)展綠色環(huán)保農(nóng)業(yè)有著重要的意義。

Thaxtomin來源于微生物，與環(huán)境相容性好，易降解，具有很好的安全性，不僅可用于田間作物，還可以應(yīng)用于有機(jī)農(nóng)業(yè)。Thaxtomin的作用機(jī)制是抑制雜草細(xì)胞壁纖維素的合成，作用靶點(diǎn)獨(dú)特，是新型安全高效除草劑開發(fā)中最有潛力的方向。此外，研究發(fā)現(xiàn)thaxtomin與其他化學(xué)除草劑聯(lián)用可降低化學(xué)除草劑的用量，間接降低對環(huán)境的污染[14]。而Thaxtomin產(chǎn)生菌發(fā)酵液經(jīng)滅活后可直接用做田間除草劑，制備工藝簡單易行。但是，自從2012年美國環(huán)境保護(hù)局批準(zhǔn)其用作農(nóng)田除草劑以來，因?yàn)榫臧l(fā)酵單位低，生產(chǎn)成本大，未能大規(guī)模上市。而化學(xué)合成thaxtomin除了總產(chǎn)率較低之外，還會(huì)產(chǎn)生有毒廢物和較多的副產(chǎn)物，也不適合工業(yè)化生產(chǎn)。因此，基于thaxtomin生物合成和調(diào)控機(jī)制的組合代謝工程改造策略，優(yōu)化工程菌株，提升thaxtomin發(fā)酵單位，是當(dāng)前主要的研究方向。另外，盡管產(chǎn)生了多種thaxtomin衍生物，但是大部分衍生物的活性還未經(jīng)測定與比較，后續(xù)的生物活性驗(yàn)證還需進(jìn)一步加強(qiáng)。

隨著合成生物學(xué)、比較基因組學(xué)、代謝組學(xué)等新技術(shù)的應(yīng)用，對菌株的遺傳改造越發(fā)有針對性，后續(xù)工作可以從幾個(gè)方面開展來提高thaxtomin及其高活性衍生物的產(chǎn)量：①對底盤菌進(jìn)行深度改造，提高宿主和基因簇的適配性。比如提高thaxtomin合成前體和輔因子的供應(yīng)、優(yōu)化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等；L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-精氨酸是thaxtomin生物合成的前體，通過對鏈霉菌初級代謝途徑進(jìn)行全面分析，在此基礎(chǔ)上增強(qiáng)L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-精氨酸代謝途徑中限速酶和關(guān)鍵合成酶表達(dá)水平，敲除競爭途徑關(guān)鍵酶基因等策略提高前體的供應(yīng)。S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine， SAM）作為甲基供體參與thaxtomin的生物合成，S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（MetK）可以合成SAM，后續(xù)可以通過過量表達(dá)MetK編碼基因提高菌體thaxtomin的產(chǎn)量。②鏈霉菌存在發(fā)酵周期過長，遺傳改造難，發(fā)酵工藝復(fù)雜等問題，因此嘗試在芽胞桿菌、大腸埃希菌、假單胞菌等鏈霉菌以外的，能夠快速生長，調(diào)控元件豐富，易于遺傳改造的宿主中優(yōu)化表達(dá)，也可能有利于thaxtomin的高效合成；③理性化改造生物合成途徑，調(diào)控中間代謝產(chǎn)物的合成水平，避免支路浪費(fèi)，以提高代謝流向終產(chǎn)物thaxtomin A的合成方向。Jiang等[32]、周甜甜等[40]和Li等[41]研究也都表明除了thaxtomin A外，還產(chǎn)生了thaxtomin C、thaxtomin D、Ｎ-乙?；?４-硝基色氨酸等其他產(chǎn)物。因此，后續(xù)可以針對代謝途徑各基因表達(dá)量進(jìn)行精確控制，提高終產(chǎn)物thaxtomin A產(chǎn)量。（4） 優(yōu)化菌株發(fā)酵工藝，提高thaxtomin工業(yè)生產(chǎn)水平。比如，外源補(bǔ)充L-色氨酸和L-苯丙氨酸等前體物質(zhì)；通過響應(yīng)面等方法優(yōu)化發(fā)酵配方，對接種量、補(bǔ)碳、pH等條件進(jìn)行摸索，采取流加底物等原料補(bǔ)充策略進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝。

參 考 文 獻(xiàn)

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收稿日期：2022-10-01

基金項(xiàng)目：河北工業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目（No. bz202203）；河北省教育廳高等學(xué)校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（No. ZD2022084）

作者簡介：李巖鵬，生于1981年，碩士，講師，研究方向?yàn)樗幤飞a(chǎn)技術(shù)，E-mail： 714138074@qq.com

*通信作者，E-mail： wangzhenjie@sina.com