李曉露?曹鵬然?高月麒?張雪霞?王寧　任風芝　于蘭

摘要：目的 分離純化那他霉素關鍵工藝雜質(zhì)，并鑒定其結(jié)構，為那他霉素工藝和質(zhì)量控制奠定基礎。方法 采用色譜純化技術，分離制備那他霉素粗品中的關鍵雜質(zhì)，經(jīng)LC-MS和NMR分析鑒定雜質(zhì)結(jié)構。結(jié)果 建立了那他霉素工藝雜質(zhì)的分離純化方法，制備得到了3個雜質(zhì)化合物，并通過波譜分析鑒定了化合物結(jié)構，其中雜質(zhì)1為那他霉素的C2位差向異構體；雜質(zhì)2為那他霉素的C18位甲氧基取代產(chǎn)物；雜質(zhì)3為那他霉素三元氧環(huán)開環(huán)后脫去羥基形成的雙鍵產(chǎn)物。結(jié)論 雜質(zhì)化合物與那他霉素具有相似的骨架結(jié)構，均由那他霉素生產(chǎn)過程產(chǎn)生，為那他霉素原料藥的生產(chǎn)工藝開發(fā)和質(zhì)量控制提供了技術參考。

關鍵詞：那他霉素；雜質(zhì)；分離純化；結(jié)構鑒定

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Preparation and structure identification of the key impurities of natamycin

Li Xiaolu， Cao Pengran， Gao Yueqi， Zhang Xuexia，Wang Ning， Ren Fengzhi， and Yu Lan

（National Engineering Research Center of Microbial Medicine， Hebei Industry Microbial Metabolic Technology Innovation Centre， New Drug Research & Development Company of NCPC， Shijiazhuang 052165）

Abstract Objective To isolate and purify the key process impurities of natamycin， and to identify their structures， so as to lay a foundation for the process and quality control of natamycin. Methods The key impurities in the natamycin crude product were separated and prepared by chromatographic purification technology， and their structures were identified by LC-MS and NMR analysis. Results A method was established for separation and purification of the process impurities of natamycin. Three impurities were prepared， and their structures were identified by spectral analysis. Among them， Impurity 1 was the C2 epimer of natamycin; Impurity 2 was the C18 methoxy substituent of natamycin; Impurity 3 was the double bond product formed by removing the hydroxyl group after the ring opening of the epoxy three-membered of natamycin. Conclusion These impurity compounds have similar skeleton structure with natamycin， which are produced in the production process of natamycin. This study provides a technical reference for the production process development and quality control of natamycin API.

Key words Natamycin; Impurity; Separation and purification; Structural identification

那他霉素是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，不僅能有效抑制霉菌和酵母菌的生長，還能抑制真菌毒素的產(chǎn)生，在食品保鮮和抗真菌治療方面均有很好的應用[1-5]。那他霉素滴眼液由美國Alcon公司研發(fā)，1978年在美國上市，商品名為Natacyn?（那特真）。由于其顯著的抑菌和殺菌作用，那他霉素被專家推薦為一線眼部抗真菌藥物，其抗菌機制為同真菌細胞膜上的固醇相結(jié)合，轉(zhuǎn)化為多烯固醇復合物，通過改變細胞膜內(nèi)外滲透壓導致細胞內(nèi)容物外溢，造成真菌細胞死亡[6]。由于那他霉素良好的治療效果，它通常也是大多數(shù)真菌性角膜炎和角膜潰瘍患者的首選抗生素。

那他霉素來源于微生物發(fā)酵，雖然發(fā)酵過程主要產(chǎn)生那他霉素，但也會產(chǎn)生許多那他霉素的結(jié)構類似物和其他發(fā)酵副產(chǎn)物。那他霉素含有堿性和酸性基團（圖1），可溶于冰醋酸，微溶于甲醇，幾乎不溶于乙醇和水[7]。

雜質(zhì)研究是藥物開發(fā)的重要組成部分，不僅可為原料藥及制劑的工藝質(zhì)量控制提供依據(jù)，也有助于提高產(chǎn)品質(zhì)量標準的可靠性。本文建立了那他霉素關鍵工藝雜質(zhì)的分離提純方法，制備得到了雜質(zhì)單體，并鑒定了雜質(zhì)結(jié)構，這對那他霉素相關物質(zhì)的控制和藥物安全性的保證具有重要意義。

1 儀器與試藥

LC-2030C 3D型高效液相色譜儀（日本島津公司）；LC3000型制備液相色譜儀（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；TR026型酸度計（Mettler公司）；Loborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（Heidolph公司）；AS-LGJ-18A型冷凍干燥機（鄭州安晟科學儀器有限公司）；Xevo TQ質(zhì)譜儀（Waters公司）；Avance III 500型核磁共振波譜儀（Bruker公司）。

那他霉素粗品（色譜純度86.3%）本公司自制；UniSil C18購自蘇州納微科技股份有限公司；色譜純乙腈、甲醇、氘代二甲基亞砜購自美國Merck公司；其他試劑購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

參照《中國藥典》2020年版方法[7]，進行那他霉素HPLC檢測，色譜柱：Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm，

5 μm）；以乙酸銨緩沖液-乙腈-四氫呋喃（76：24：0.5）為流動相；流速1.0 mL/min；檢測波長303 nm。那他霉素粗品的HPLC圖譜見圖2。

2.2 雜質(zhì)富集

稱取那他霉素粗品15 g，加入120 mL甲醇，用2 mol/L鹽酸調(diào)pH至3.7～4.2使之溶解，溶解液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，得到澄清上樣液。

2 L層析柱（反相硅膠C18填料，10 μm），流動相為37%乙腈-63%水（含0.2%乙酸銨），流速為70 mL/min，檢測波長303 nm，平衡1倍柱體積后上樣，采用同樣條件進行洗脫，根據(jù)在線圖譜分別進行主峰前雜質(zhì)和主峰后雜質(zhì)的收集，收集的洗脫液減壓濃縮后待再次純化。

2.3 雜質(zhì)單體制備

2.3.1 主峰前雜質(zhì)的分離制備

制備柱（Kromasil C18，100-10-C18，21.2 mm ×250 mm），流動相為27%乙腈-73%水（含0.2%乙酸銨），流速為14 mL/min，檢測波長303 nm。

平衡制備柱2倍柱體積后，取“2.2”項所得主峰前雜質(zhì)進樣，根據(jù)在線檢測圖譜進行雜質(zhì)餾分收集。合并HPLC純度大于95%的雜質(zhì)1餾分，經(jīng)減壓濃縮后凍干，得到雜質(zhì)1： 60 mg，色譜純度98.2%。

2.3.2 主峰后雜質(zhì)的分離制備

制備柱（Kromasil C18，100-10-C18，21.2 mm ×250 mm），流動相為32%乙腈-68%水（含0.2%乙酸銨），流速為14 mL/min，檢測波長303 nm。

平衡制備柱2倍柱體積后，取“2.2”項所得主峰后雜質(zhì)進樣，根據(jù)在線檢測圖譜進行餾分收集。分別合并HPLC純度大于95%的雜質(zhì)2餾分和雜質(zhì)3餾分，經(jīng)減壓濃縮后凍干，得到雜質(zhì)2：32 mg，色譜純度95.3%；雜質(zhì)3： 26 mg，色譜純度96.7%。

2.4 雜質(zhì)結(jié)構鑒定

2.4.1 質(zhì)譜分析

將那他霉素雜質(zhì)化合物用甲醇溶解，進行質(zhì)譜分析，其ESI（+）分析結(jié)果見圖3。

2.4.2 核磁共振分析

將那他霉素雜質(zhì)化合物用氘代二甲基亞砜（DMSO-d6）溶解，進行核磁共振波譜分析，其1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表1～2。

2.4.3 結(jié)構解析[6]

雜質(zhì)1：由ESI（+）離子峰圖譜可知，雜質(zhì)1分子量為665，與那他霉素的分子量相同。由NMR數(shù)據(jù)可知雜質(zhì)1與那他霉素C、H的個數(shù)相同，因此確定雜質(zhì)1的分子式與那他霉素相同。比對雜質(zhì)1與那他霉素的NMR數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)二者數(shù)據(jù)基本一致，僅C-3（ΔδC 6.6）化學位移有明顯差別，結(jié)合NOESY譜中1-Me與H-4有NOE相關，即雜質(zhì)1的1-Me朝向與那他霉素相反，可以判斷雜質(zhì)1為那他霉素的C2位差向異構體。

雜質(zhì)2：由ESI（+）離子峰圖譜可知，雜質(zhì)2分子量為679，比那他霉素的分子量多14。由核磁共振波譜數(shù)據(jù)可知，雜質(zhì)2含有一個連氧甲基，該甲氧基δC 47.39 ppm，δH 2.97 ppm， s， 結(jié)合HMBC，可以發(fā)現(xiàn)該甲氧基的氫信號與C18相關。綜合分析HSQC、HMBC、H-H COSY及NOESY，對雜質(zhì)2的碳信號和氫信號進行了歸屬，可以判斷雜質(zhì)2為那他霉素的C18位甲氧基取代產(chǎn)物。

雜質(zhì)3：由ESI（+）離子峰圖譜可知，雜質(zhì)3分子量為649，比那他霉素的分子量少16。由NMR數(shù)據(jù)可知雜質(zhì)3較那他霉素少一個O。比對雜質(zhì)3與那他霉素的NMR數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)二者數(shù)據(jù)基本一致，差異主要為C-22和C-23的化學位移，根據(jù)存在差異的H譜裂分情況、C譜的化學位移變化、HSQC以及H-H COSY的相關，可以判斷雜質(zhì)3是那他霉素三元氧環(huán)開環(huán)后脫去羥基形成的雙鍵產(chǎn)物。

雜質(zhì)1～3的結(jié)構式見圖4。

3 討論

那他霉素是納塔爾鏈霉菌或褐黃孢鏈霉菌等微生物的次級代謝產(chǎn)物，從發(fā)酵液中提取純化后獲得，工藝雜質(zhì)的研究及控制對于產(chǎn)品質(zhì)量控制尤為重要。本研究應用制備色譜純化技術，探索了那他霉素粗品中關鍵雜質(zhì)的分離提純方法，并通過質(zhì)譜和核磁共振波譜等分析手段，確定了雜質(zhì)的結(jié)構，其中雜質(zhì)1為那他霉素的C2位差向異構體；雜質(zhì)2為那他霉素的C18位甲氧基取代產(chǎn)物；雜質(zhì)3為那他霉素三元氧環(huán)開環(huán)后脫去羥基形成的雙鍵產(chǎn)物。經(jīng)檢索，3個雜質(zhì)未見文獻報道，為首次分離鑒定。

在進行那他霉素雜質(zhì)流程研究時發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)1～3均為那他霉素發(fā)酵代謝產(chǎn)物。其中，雜質(zhì)2和3在提取精制過程中，所占比例逐漸降低，成品中占比均小于0.1%，對產(chǎn)品質(zhì)量影響較低。雜質(zhì)1在粗提過程中占比有波動，堿溶酸沉步驟略有增長，且對pH比較敏感，精制結(jié)晶過程可有效去除，成品中未檢出。因此，在那他霉素發(fā)酵及提取過程中，避免高pH條件，可減少雜質(zhì)1的生成。該研究為更加精準控制那他霉素產(chǎn)品質(zhì)量和指導生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供了可靠的依據(jù)。

參 考 文 獻

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國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. （2020年版第二部）. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020： 498-499.

收稿日期：2022-12-28

基金項目：河北省科技研發(fā)平臺建設專項（No. 22567651H）

作者簡介：李曉露，女，生于1974年，碩士，正高級工程師，主要從事微生物藥物分離純化，E-mail： luncpc@163.com

*通信作者， E-mail： yulan2680@163.com