項(xiàng)仁鑫?孫鵬?楊小虎?潘玲玲?方佳雙?應(yīng)靈萍?徐倩

摘要：目的 篩選PF1022A高產(chǎn)菌株，并優(yōu)化發(fā)酵條件，以提高發(fā)酵水平。方法 以PF1022A產(chǎn)生菌座堅(jiān)殼菌（Rosellinia sp.）HS-NF-1412Z（3050 mg/L）為出發(fā)菌株，采用紫外誘變育種，再在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合Box-behnken（BB）響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件。 結(jié)果 獲得一株產(chǎn)PF1022A的高產(chǎn)穩(wěn)定菌株HS-NF5-86-5-88，發(fā)酵水平較出發(fā)菌株提高了19%。采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糊精163.0 g/L，酵母抽提物19.7 g/L，棉籽餅粉25.0 g/L，豆油5.0 g/L時(shí)，硫酸鎂2.0 g/L，氯化鈉2.0 g/L，碳酸鈣2.0 g/L，菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量5978 mg/L。結(jié)論 通過(guò)菌種誘變選育與配方優(yōu)化，PF1022A的搖瓶產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了96%，具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：座堅(jiān)殼菌；PF1022A；菌種選育；響應(yīng)面分析法；發(fā)酵

中圖分類號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Mutation breeding and optimization of fermentation medium of PF1022A producing strain

Xiang Renxing， Sun peng， Yang Xiaohu， Pan Linlin， Fang Jiashuang， Ying Lingping， and Xu qian

（Zhejiang Key Laboratory of Antifungal Drugs， Zhejiang Hisun pharmaceutical Co. Ltd.， Taizhou 318000）

Abstract Objective To optimize PF1022A fermentation conditions to improve the titer of fermentation by screening of PF1022A high-producing strain. Methods The PF1022A-producing Rosellinia sp. HS-NF-1412Z （3050 mg/L）， was used as the starting strain and treated by UV. The fermentation conditions were optimized by the single-factor experiment and the Box Behnken （BB） response surface method. Results A high producing and stable strain HS-NF5-86-5-88 was obtained. The yield of fermentation increased 19% compared with the starting strain in shake flask cultures. The optimized fermentation medium consists of maltodextrin 163.0 g/L， yeast extract 19.7 g/L， cottonseed meal 25.0 g/L， soybean oil 5.0 g/L， magnesium sulphate 2.0 g/L， sodium chloride 2.0 g/L， and calcium carbonate 2.0 g/L. The titer of PF1022A achieved 5，978 mg/L in the optimized media. Conclusion The titer of PF1022A was increased by 96% compared to the original strain through mutation breeding and optimization of fermentation medium， which is promising for industrial applications.

Key words Rosellinia sp; PF1022A; Strain selection; Response surface method; Fermentation

寄生蟲(chóng)病是目前最為嚴(yán)重的人畜共患病之一，嚴(yán)重影響著畜牧業(yè)的健康發(fā)展與人類的生命安全。艾默德斯（emodepside）是一種24元環(huán)8縮酚酸肽化合物，對(duì)無(wú)脊柱動(dòng)物（如線蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)）等有殺傷作用[1]。拜爾動(dòng)物保健公司已研制出emodepside分別與吡喹酮（profender）及妥曲珠利（procox）的組合物用于貓和狗的驅(qū)腸蟲(chóng)藥，profender（與吡喹酮聯(lián)用）已于2007年在美國(guó)上市。2014年12月， DNDi與拜耳公司合作開(kāi)發(fā)emodepside，用于治療潛在的絲蟲(chóng)病及盤(pán)尾絲蟲(chóng)病（人用藥），于2016年進(jìn)入健康志愿者I期研究，2017年完成了單次遞增劑量研究，2018年底完成了多次遞增劑量研究[2]。

PF1022A（圖1）[3]作為emodepside化學(xué)合成關(guān)鍵前體原料，具有非常好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前PF1022A的合成有生物合成方法和固相合成法[3-6]。固相合成法步驟繁瑣、工藝復(fù)雜，不適于大規(guī)模生產(chǎn)，而關(guān)于PF1022A發(fā)酵生產(chǎn)報(bào)道比較少，PF1022A是座堅(jiān)殼菌菌株Rosellinia sp. PF1022產(chǎn)生的N-甲基-CODP（環(huán)狀縮肽）類化合物，是1種對(duì)動(dòng)物低毒、防治譜廣、效果好的驅(qū)蟲(chóng)藥物，其是繼大環(huán)內(nèi)酯類驅(qū)蟲(chóng)藥后，最有潛力的用于牲畜和寵物的一類驅(qū)蟲(chóng)藥[7-8]。根據(jù)公開(kāi)的資料[8-11]，其整體產(chǎn)PF1022A 的能力較低。

本課題組在進(jìn)行微生物新藥篩選過(guò)程中，于浙江麗水遂昌山的土壤樣品中成功分離得到1株產(chǎn)PF1022A 的座堅(jiān)殼菌HS-NF-1412Z[12]，本文通過(guò)對(duì)其菌種誘變選育、單因素試驗(yàn)，同時(shí)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方[13-14]，提高了PF1022A的發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本，有利于實(shí)現(xiàn)該項(xiàng)目的產(chǎn)業(yè)化。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

座堅(jiān)殼菌HS-NF-1412Z菌株保藏于浙江海正藥業(yè)股份有限公司菌種鑒定保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯（去皮）200，葡萄糖20，瓊脂18，pH 6.0。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，玉米可溶性淀粉20，酵母抽提物15，棉籽餅粉20，硫酸鎂2，氯化鈉2，碳酸鈣2， pH 6.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：玉米淀粉120（淀粉酶0.024），大豆油10，棉籽餅粉25，酵母粉10，硫酸鎂2，氯化鈉2，碳酸鈣2，pH 6.0。

1.3 主要儀器與試劑

搖床：美國(guó)NBS INNOVA-5000搖床系統(tǒng)；分析型高效液相色譜儀：Shimadu，SPD-20A；分析色譜柱：大連依利特科學(xué)儀器有限公司，Hypersil ODS2柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；PF1022A標(biāo)準(zhǔn)品由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，純度達(dá)99.0%以上。

2 方法與結(jié)果

2.1 培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)：將保存的菌種接種至斜面培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)6～9 d。

種子培養(yǎng)：取菌種斜面轉(zhuǎn)接于裝量25 mL/250 mL種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min，培養(yǎng)72 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以5%移種量轉(zhuǎn)移至裝量25 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min，培養(yǎng)9 d。

2.2 PF1022A的含量測(cè)定

吸取0.5 mL發(fā)酵液，加入12倍體積甲醇超聲30 min，4000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)濾，濾液測(cè)HPLC。色譜條件：Hypersil ODS2柱（5 μm，4.6 mm×

250 mm），流動(dòng)相為乙腈：水（80：20， V/V），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL，樣品出峰時(shí)間約9.5 min。根據(jù)對(duì)照品濃度計(jì)算發(fā)酵液中PF1022A的含量。

2.3 菌種誘變與篩選

紫外（UV）誘變：將培養(yǎng)好的斜面菌種用無(wú)菌水洗脫制成菌懸液，吸取5 mL置滅菌的9cm培養(yǎng)皿中，在15 W紫外燈下，距離25 cm處分別照射30、60和120 s。照射后的菌懸液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度稀釋，取0.1 mL涂布于固體培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7 d，得到紫外誘變后的單菌落。結(jié)果顯示，UV照射60 s，座堅(jiān)殼菌的致死率為90%，挑取單菌落至固體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，按“2.1”項(xiàng)方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，從中挑選發(fā)酵產(chǎn)素提高的高產(chǎn)突變株，經(jīng)過(guò)連續(xù)幾輪UV誘變后，篩選得到2株高產(chǎn)突變菌株HS-NF4-39和HS-NF5-86，并對(duì)這2株高產(chǎn)突變株進(jìn)行自然分離，分別得到HS-NF4-39-3-42和HS-NF5-86-5-88，PF1022A的產(chǎn)量分別為3639 mg/L和3670 mg/L，相對(duì)出發(fā)菌株HS-NF-1412Z（3050 mg/L）提升19%以上。

將HS-NF4-39-3-42和HS-NF5-86-5-88高產(chǎn)菌株分別接種至斜面培養(yǎng)基連續(xù)傳代5次，分別按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果如表1所示，連續(xù)傳代3次高產(chǎn)突變株P(guān)F1022A產(chǎn)量都沒(méi)有顯著降低，繼續(xù)傳代2次，HS-NF4-39-3-42菌株P(guān)F1022A產(chǎn)量顯著降低，HS-NF5-86-5-88菌株P(guān)F1022A產(chǎn)量相對(duì)穩(wěn)定，表明菌株HS-NF5-86-5-88的傳代穩(wěn)定性較好，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

2.4.1 碳源單因素試驗(yàn)

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用麥芽糖、麥芽糊精、糖蜜、蔗糖、甘油替代玉米淀粉作為碳源，濃度為120 g/L，按“2.1”項(xiàng)下方法發(fā)酵培養(yǎng)9 d后測(cè)定PF1022A，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2）。

由結(jié)果可知，該菌株對(duì)上述多種碳源利用情況不同，蔗糖與糖蜜為碳源時(shí)，PF1022A產(chǎn)量最低，麥芽糊精為碳源時(shí)，PF1022A產(chǎn)量達(dá)4350 mg/L，可能與其含有的維生素、微量元素有關(guān)，故最優(yōu)碳源為麥芽糊精。

2.4.2 麥芽糊精添加量對(duì)PF1022A產(chǎn)量的影響

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)麥芽糊精進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)（8%、10%、12%、14%、16%和18%），考察其對(duì)PF1022A產(chǎn)量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3），麥芽糊精添加量為8%～16%，PF1022A產(chǎn)量隨著麥芽糊精添加量的增加總體呈上升趨勢(shì)，繼續(xù)提升麥芽糊精的濃度，PF1022A產(chǎn)量開(kāi)始降低。根據(jù)上述結(jié)果初步確定麥芽糊精的濃度為16%。

2.4.3 氮源單因素試驗(yàn)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別考察花生餅粉、小麥胚芽粉、黃豆餅粉、豆粉、魚(yú)粉、酵母抽提物和棉籽餅粉替代酵母粉作為氮源，濃度均為10 g/L，按“2.1”項(xiàng)方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)9 d后測(cè)量PF1022A的產(chǎn)量。結(jié)果顯示（圖4），菌株對(duì)酵母抽提物的利用程度最高，以酵母抽提物為氮源時(shí)PF1022A產(chǎn)量達(dá)到5313 mg/L。

2.4.4 酵母抽提物添加量對(duì)PF1022A產(chǎn)量的影響

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)酵母抽提物進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%），考察其對(duì)PF1022A產(chǎn)量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖5），酵母抽提物添加量0.5%～1.5%，PF1022A產(chǎn)量隨著酵母抽提物的添加量加大逐步提升，最高達(dá)5580 mg/L，后續(xù)再提高酵母抽提物濃度，發(fā)酵產(chǎn)量呈一定的下降趨勢(shì)，根據(jù)上述結(jié)果初步確定酵母抽提物的濃度為1.5%。

2.4.5 棉籽餅粉添加量對(duì)PF1022A產(chǎn)量的影響

根據(jù)上述結(jié)果，進(jìn)一步考察了組合氮源中棉籽餅粉的添加量（2.25%、2.5%、2.75%和3%）對(duì)PF1022A產(chǎn)量的影響。結(jié)果顯示（圖6），棉籽餅粉添加量在2.25%～3%對(duì)PF1022A產(chǎn)量無(wú)顯著差異，2.5%棉籽餅粉PF1022A產(chǎn)量相對(duì)較高，初步確定棉籽餅粉濃度為2.5%。

2.4.6 油類單因素試驗(yàn)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別用菜籽油、油酸甲酯、肉豆蔻酸異丙酯與豆油進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比，濃度均為10g/L，

按“2.1”項(xiàng)方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)9d后測(cè)量PF1022A的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖7），豆油與肉豆蔻酸異丙酯的利用情況較好，由于豆油相對(duì)肉豆蔻酸異丙酯價(jià)格低廉，更有利于商業(yè)化生產(chǎn)，故更優(yōu)選為豆油。

2.4.7 豆油添加量對(duì)PF1022A產(chǎn)量的影響

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)豆油進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)（0.5%、0.75%、1%、1.25%和1.5%），考察其對(duì)PF1022A產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖8），豆油添加量0.5%～0.75%，PF1022A的產(chǎn)量具有一定的提升，最高達(dá)5748 mg/L，繼續(xù)提升豆油添加量后，PF1022A的產(chǎn)量呈逐漸下降趨勢(shì)，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步確定豆油添加量為0.75%。

2.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化

響應(yīng)面分析法是通過(guò)對(duì)響應(yīng)面等值線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)面之間函數(shù)關(guān)系的1種統(tǒng)計(jì)方法[15-19] 。

根據(jù)上述各發(fā)酵因素對(duì)PF1022A產(chǎn)量的影響程度，從中選取3個(gè)影響較為顯著的因素：麥芽糊精（A）、酵母抽提物（B）和豆油（C），應(yīng)用Design Expert8.06軟件，采用Box-Behnken方法對(duì)座堅(jiān)殼菌HS-NF5-86-5-88產(chǎn)PF1022A發(fā)酵工藝進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，以麥芽糊精（A）、酵母抽提物（B）、豆油（C）為自變量，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面二次回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y效價(jià)=5736.67-88.38A+132.00B-136.38C+176.25AB-82.50AC-65.25BC-526.08A2-119.33B2-25.58C2

并對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，回歸模型的P=0.0002，失擬P為0.1521＞0.05，因此該模型顯著，失擬不顯著。該模型的校正系數(shù)ADJ R2=0.9376，R2=0.9775，該模型方程與實(shí)際擬合好，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的相關(guān)性好，模型響應(yīng)值的變異系數(shù)CV值1.11%較低，表明實(shí)驗(yàn)操作是可信的，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由回歸方程各項(xiàng)方差分析表明，麥芽糊精、酵母抽提物、豆油對(duì)產(chǎn)PF1022A影響顯著，麥芽糊精與酵母抽提物、麥芽糊精與豆油之間的交互作用顯著，其響應(yīng)面圖及等高線圖如圖所示（圖9～10），對(duì)上述模型求最大值，通過(guò)分析可得，麥芽糊精163.0 g/L、酵母抽提物19.7 g/L、豆油5.0 g/L，菌株HS-NF5-86-5-88產(chǎn)PF1022A的最大值為5939 mg/L，優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基成分：麥芽糊精163.0 g/L，酵母抽提物19.7 g/L，豆油5.0 g/L，棉子餅粉25.0 g/L，硫酸鎂2.0 g/L，氯化鈉2.0 g/L，碳酸鈣2.0 g/L。

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3瓶，實(shí)測(cè)值為5978 mg/L，與理論值5939 mg/L偏差約0.65%，實(shí)際測(cè)量值與預(yù)測(cè)值相接近，可見(jiàn)該模型能夠較好的預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

3? ? 結(jié)論

通過(guò)對(duì)出發(fā)菌株座堅(jiān)殼菌HS-NF-1412Z進(jìn)行連續(xù)UV誘變及自然選育，最終獲得一株高產(chǎn)菌株HS-NF5-86-5-88，發(fā)酵水平具有一定幅度的提升，再通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽糊精163.0 g/L，酵母抽提物19.7 g/L，棉籽餅粉25.0 g/L，豆油5.0 g/L時(shí)，硫酸鎂2.0 g/L，氯化鈉2.0 g/L，碳酸鈣2.0 g/L，菌株搖瓶PF1022A的發(fā)酵水平達(dá)5978 mg/L，較出發(fā)菌株（3050 mg/L）提高了96%。

Emodepside作為高端獸用驅(qū)蟲(chóng)藥目前尚未在國(guó)內(nèi)上市，關(guān)于其前體PF1022A菌種和發(fā)酵工藝的報(bào)道也比較少，除本研究外，王昆蓉等[10]對(duì)菌株SIIA-16-1#采用麥芽糖為主要碳源，PF1022A發(fā)酵水平最高達(dá)1810 mg/L，陳少欣等[7]對(duì)菌株NBRC-33096采用葡萄糖、山梨醇、玉米淀粉為主要碳源，發(fā)酵罐補(bǔ)加麥芽糖，PF1022A發(fā)酵水平最高達(dá)到1481 mg/L，本研究對(duì)菌株HS-NF-1412Z進(jìn)行選育[12]，高產(chǎn)突變株HS-NF5-86-5-88采用麥芽糊精為主要碳源進(jìn)行發(fā)酵，其PF1022A發(fā)酵產(chǎn)量遠(yuǎn)高于目前文獻(xiàn)所報(bào)道的水平。另外，全合成Emodepside路線長(zhǎng)，工藝復(fù)雜，控制條件要求高，工藝路線實(shí)現(xiàn)比較困難，不利于大規(guī)模生產(chǎn)，而從前體PF1022A出發(fā)，通過(guò)半合成制備emodepside，合成步驟縮減，工藝實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單，前體發(fā)酵水平提高后生產(chǎn)成本大幅降低。因此，本研究為后期工業(yè)化放大生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

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收稿日期：2022-09-13

作者簡(jiǎn)介：項(xiàng)仁鑫，男，生于1991年，工程師，主要研究方向?yàn)槲⑸锼幬?，E-mail： rxxiang@hisunpharm.com

*通信作者，E-mail： tzxuqian@hisunpharm.com