黃浩龍　田勛　劉佳樂　張夢瑩　胡海峰

摘要：目的 提高星形孢菌素的產(chǎn)量。方法 本研究以星形孢菌素產(chǎn)生菌（Streptomyces sp. ST-07）為出發(fā)菌株，采用電轉(zhuǎn)化方法和應(yīng)用PCR擴增星形孢菌素生物合成的調(diào)控基因staR，成功構(gòu)建含不同啟動子（kasO*p和ermE*p）的加強表達staR基因的重組工程菌，分別命名為ST-D-5和ST-H-23。結(jié)果 通過對電轉(zhuǎn)化條件的甘氨酸濃度、電場強度、菌絲體濃度、質(zhì)粒濃度、孵育時間和孵育溫度等關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化，使電轉(zhuǎn)化的效率從4×106提高至9.6×108（CFU/?g DNA）；工程菌搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，與星孢菌素原始菌株ST-07相比，采用kasO*p 啟動子構(gòu)建的工程菌ST-D-5星形孢菌素的產(chǎn)量提高了17%，最高單位可達923 mg/L。結(jié)論 本文系統(tǒng)摸索了星形孢菌素產(chǎn)生菌的電轉(zhuǎn)化條件，顯著提高了電轉(zhuǎn)化效率，不但為該菌株的高產(chǎn)遺傳改造奠定了基礎(chǔ)，而且對其他放線菌的遺傳操作體系建立提供了有益借鑒。

關(guān)鍵詞：星形孢菌素；電轉(zhuǎn)化；staR基因；kasO*p；啟動子；高產(chǎn)菌

中圖分類號：R9文獻標志碼：A

Optimization of electrotransformation of staurosporine producing Streptomyces sp. and construction of high-yield mutants

Huang Haolong1，2， Tian Xun1，2， Liu Jiale1，2， Zhang Mengying1，2，? and Hu Haifeng1，2

（1 Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， China State Institute of Pharmaceutical Industry， Shanghai 200040;

2 Sinopharm Health Industry Institute Co.， Ltd.， Shanghai 201203）

Abstract Objective To improve the production of staurosporine. Methods In this study， Streptomyces sp. ST-07 was used as the starting strain， and its staR gene was amplified by electrotransformation and PCR. Engineered strains containing the staR gene overexpressed under the control of different promoters （kasO* pand ermE*p） were successfully constructed and named ST-D-5 and ST-H-23. Results The electrotransformation method was used to improve the efficiency of transformation from 4×106 to 9.6×108 （CFU/μg DNA） by optimizing key parameters such as the glycine concentration， the electric field intensity， the mycelia concentration， the plasmid concentration， incubation time and temperature. Shaking flask fermentation showed that the yield of staurosporine of engineered strain ST-D-5 with the kasO*p promoter was increased by 17%， and the highest titer reached 923 mg/L. Conclusion In this paper， the electrotransformation conditions of the bacteria producing staurosporine were explored systematically， and the electrotransformation efficiency was significantly improved. It not only laid a foundation for the genetic modification of high yield of this strain， but also provided a useful reference for the establishment of genetic manipulation system of other actinomyces.

Key words Staurosporine; Electrotransformation; StaR gene; kasO*p; Promoter; High-yield mutants

星形孢菌素（staurosporine，STA），最初發(fā)現(xiàn)于Streptomyces staurosporeus（AM-2282）菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中，具有抗真菌、抗細菌、抗腫瘤和血小板凝聚等多種生物活性[1]，尤其對蛋白激酶C有強效抑制作用，可以誘導(dǎo)多類細胞的凋亡，具有廣譜的抗腫瘤活性。但其選擇性差、毒性大等特點，限制了其作為藥物在臨床方面的直接應(yīng)用[3]。目前越來越多的星形孢菌素的衍生物被發(fā)現(xiàn)，主要有UCN-01和米哚妥林，米哚妥林是由星形孢菌素通過化學(xué)合成得到，于2017年美國FDA批準用于治療急性髓性白血病。目前星形孢菌素主要通過微生物發(fā)酵的方式獲得[1-2]，但是已報道的產(chǎn)生菌株的發(fā)酵單位較低，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

Onaka等[4]報道了菌株Streptomyces sp. TP-A0274合成星形孢菌素的生物過程，Salas等[5]在S. albus體內(nèi)完整重建STA的合成路徑通過雙質(zhì)粒系統(tǒng)方法。星形孢菌素的生物合成主要由吲哚咔唑環(huán)的合成和糖基的修飾二部分構(gòu)成。

電轉(zhuǎn)化是在電場脈沖的作用下使菌體的細胞壁上產(chǎn)生微孔通道，從而使外源DNA分子經(jīng)該通道與裸露的細胞膜接觸，進而進入到受體細胞內(nèi)部，發(fā)生基因重組。使用電轉(zhuǎn)化方法不僅可以避免胞外核酸酶對體內(nèi)DNA的降解，還可以減少宿主對外源DNA的限制性修飾作用[6-7]。本研究嘗試了電轉(zhuǎn)化的方法并取得成功，但是轉(zhuǎn)化效率不高。為了進一步提高轉(zhuǎn)化效率，又對電轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化，從而建立了一套高效的遺傳操作體系，為研究該菌株的合成代謝途徑、調(diào)控機理、遺傳改良等方面奠定了基礎(chǔ)。

根據(jù)相關(guān)文獻報道，在星形孢菌素的生物合成基因簇中存在一個調(diào)控基因staR。staR基因?qū)儆贚uxR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因[6，8]，LuxR家族蛋白是一種廣泛存在于革蘭陰性菌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以特異性地與目的基因啟動子的特定序列結(jié)合，從而增強或抑制目的基因的表達[9-10]。因此，本研究采用不同強度的啟動子來構(gòu)建staR基因的加強表達質(zhì)粒，為提高星形孢菌素的產(chǎn)量做出有益探索[15]。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

MiniAmp PCR儀（賽默飛世爾科技）；Waters2998型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；EPS300型電泳儀（上海天能科技有限公司）；1652100型電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-rad公司）。

氨芐西林（Amp）、安普霉素（Apr）、卡那霉素（Kan）和氯霉素（Cm）（上海源聚生物科技有限公司）；DNA聚合酶、DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（美國Thermo Scientific公司）；星形孢菌素標準品（上海Sigma-Aldrich有限公司，批號W2351A）；黃豆餅粉（青島科瑞生物技術(shù)有限公司，批號200612）、玉米漿干粉（山東西王糖業(yè)有限公司，批號20220910）、酵母粉（安琪酵母股份有限公司，批號LP0021）、其他試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 菌株、質(zhì)粒以及引物

本試驗所涉及到的菌株見表1，涉及的質(zhì)粒見表2，涉及的引物見表3。

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物 5，胰蛋白胨 10，氯化鈉 10，pH 7.0。

ISP2培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 4，酵母提取物 4，麥芽浸粉 10，瓊脂粉 20，pH 7.0。

TSB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 15，大豆蛋白胨 5，氯化鈉 5，pH （7.2±0.2）。

種子培養(yǎng)基（g/L）：玉米淀粉 4，玉米漿干粉 5，葡萄糖 15，大豆蛋白胨 5，碳酸鈣 2，酵母粉 4，pH 7.0。

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 40，五水硫酸亞鐵 0.5，黃豆餅粉 15，五水硫酸銅 0.5，酵母粉 5，玉米淀粉10，碳酸鈣 4.0，七水硫酸鎂 1.5，棉籽餅粉 17，磷酸二氫銨 0.5，pH 6.3。

2 方法

2.1 培養(yǎng)方法

平板培養(yǎng)：將甘油管保存菌株稀釋1000倍，涂布于ISP2平板上，28℃培養(yǎng)6～7 d。

種子培養(yǎng)：從平板刮取1 cm×1 cm接種到30/250 mL種子培養(yǎng)基中，28℃、250 r/min培養(yǎng)2 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：按10 %接種量將種子液轉(zhuǎn)入30/250 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、250 r/min培養(yǎng)7 d。

2.2 含量測定方法

取“2.1”項發(fā)酵培養(yǎng)7 d的培養(yǎng)物2 mL，加入95%乙醇2 mL，混勻，超聲（250 W）30 min，取1 mL，12000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 ?m有機膜過濾后，HPLC測定星形孢菌素含量。

色譜條件：色譜柱Nova-Pak? C18-4 ?m （3.9 mm×150 mm）（Waters）；流動相A（乙腈）：流動相B（0.02 mol/L乙酸鈉溶液）；流動相比例A： B=46： 54（V/V）等度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長292 nm；進樣量10 ?L。根據(jù)標準品的濃度計算發(fā)酵液中星形孢菌素的含量。

2.3 電轉(zhuǎn)菌絲體的制備

取25 μL孢子懸液接種于25 mL/250 mL TSB 培養(yǎng)基中，28℃-220 r/min，搖床震蕩培養(yǎng) 10～12 h；再將其以10 %的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的TSB培養(yǎng)基中，搖床震蕩培養(yǎng)8～10 h，A600在2.0～3.5之間。用50 mL無菌離心管分裝菌液，4℃-6000 r/min，離心10 min，棄上清用相同體積提前預(yù)冷的去離子水重懸菌體沉淀，離心，重復(fù)1次。最后加入1 mL預(yù)冷的10%甘油溶液重懸菌絲體，以每管100 μL（菌絲體濃度約為1×109個/mL，（注：后續(xù)實驗為了簡化，菌絲體濃度統(tǒng)一用菌絲體體積來表述）分裝至預(yù)冷的10 mL EP管中，液氮速凍，-80℃冷凍備用。

2.4 電轉(zhuǎn)化步驟

將無菌電轉(zhuǎn)杯放在冰上預(yù)冷10 min左右，取出-80℃保藏的ST-07電轉(zhuǎn)感受態(tài)菌絲體，置于冰上融化，加入1 μL pSET152質(zhì)粒（μg/μL），輕輕吹打均勻，冰上靜置10 min。將ST-07電轉(zhuǎn)感受態(tài)菌絲體及 pSET152 質(zhì)粒的混合物轉(zhuǎn)至預(yù)處理過的電轉(zhuǎn)杯中，并用吸水紙將電轉(zhuǎn)杯外壁的水吸干，再放入電轉(zhuǎn)儀中進行電轉(zhuǎn)（電轉(zhuǎn)參數(shù)設(shè)置為：電壓12 kV/cm，電阻200 Ω，電流25 μF）。電擊完成后立刻加入800 μL TSB 培養(yǎng)液，吹打混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，28℃，220 r/min，搖床振蕩培養(yǎng)2 h。將菌液涂布于 ISP2 平板培養(yǎng)基上（Apr終濃度：50 μg/mL），28℃倒置培養(yǎng)5～6 d。

3 結(jié)果

3.1 Streptomyces sp. ST-7電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

本實驗以Streptomyces sp. ST-07菌株為遺傳操作對象，探索該菌株的電轉(zhuǎn)化體系，并對相關(guān)的電轉(zhuǎn)化條件（甘氨酸濃度、電場強度、菌絲體濃度、質(zhì)粒濃度、孵育時間及孵育溫度）進行優(yōu)化，從而建立了一套高效的遺傳操作體系，電轉(zhuǎn)化效率參照文獻計算[7]。

3.1.1 安普霉素對ST-07的MIC

優(yōu)化ST-07電轉(zhuǎn)化體系條件的前提是對其安普霉素的MIC確定。在ISP2平板中加入不同濃度的安普霉素進行試驗。表4結(jié)果顯示，安普霉素對ST-07的MIC為30 ?g/mL，最終選擇50 ?g/mL安普霉素作為轉(zhuǎn)化子的篩選濃度。

3.1.2 ST-07生長曲線的確定

將ST-07的孢子懸液接種于TSB培養(yǎng)基中，每隔2 h取樣測A600值。根據(jù)實驗結(jié)果圖1所示，在0～2 h時處于遲緩期，對數(shù)生長期為2～22 h，穩(wěn)定期為22～38 h。其中ST-07在8～14 h的生長狀態(tài)處于最佳時期，適合制備成菌絲體進行電轉(zhuǎn)化實驗。

3.1.3 甘油/甘露醇溶液的濃度比對電轉(zhuǎn)化效率的影響

密度梯度離心常用的梯度介質(zhì)為甘油、蔗糖和甘露醇等，結(jié)果表明（圖2A）使用20%甘油/1.5%甘露醇溶液重懸星孢菌絲體，使其菌絲體處于一定濃度的滲透溶液中，維持菌絲體內(nèi)外的滲透壓平衡，增加菌絲體的存活率，使電轉(zhuǎn)化效率的進一步提高。

3.1.4 不同質(zhì)量濃度的細胞壁弱化劑對電轉(zhuǎn)化的影響

在細胞壁合成過程中，甘氨酸作為細胞壁弱化劑可以替代細胞壁中肽聚糖層的D-丙氨酸，從而形成較松散的肽聚糖層，使得外源DNA更容易進入，但是當甘氨酸濃度過高時則會抑制菌絲生長。結(jié)果顯示（圖2B），甘氨酸濃度為2%時對電轉(zhuǎn)化效率的改善效果最好。

3.1.5 不同電場強度對電轉(zhuǎn)化的影響

電場強度和菌絲體大小共同決定了在菌絲體形成的電壓降，這是電轉(zhuǎn)化中電壓的主要表現(xiàn)形式，電穿孔和細胞修復(fù)是相互制約的關(guān)系，因此，選擇一個合適的電場強度對電轉(zhuǎn)化效率提高有很大的影響。結(jié)果顯示（圖2C），電轉(zhuǎn)化的電場強度為9 kV/cm，電轉(zhuǎn)化效率較高。

3.1.6 不同ST-07濃度對電轉(zhuǎn)化的影響

在電轉(zhuǎn)化過程中，一定范圍的ST-07菌絲體可以提高電轉(zhuǎn)化的效率。因此，本研究選擇不同濃度的ST-07進行電轉(zhuǎn)化以獲得最高的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示（圖2D），當ST-07濃度為150 ?L時候，電轉(zhuǎn)化效率較高。

3.1.7 不同質(zhì)粒濃度對電轉(zhuǎn)化的影響

在鏈霉菌的電轉(zhuǎn)化試驗中，質(zhì)粒濃度越大，與感受態(tài)細胞碰撞的幾率越大，能提高質(zhì)粒進入“親水孔”的概率。但質(zhì)粒濃度超過一定范圍，反而會增大電轉(zhuǎn)化過程中電轉(zhuǎn)杯擊穿的概率，降低電轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果表明（圖2E），當質(zhì)粒濃度為1 ?g時，電轉(zhuǎn)化效率較高。

3.1.8 不同孵育時間對電轉(zhuǎn)化的影響

在電轉(zhuǎn)化的過程中，細胞容易受損，需要一定時間來自我修復(fù)損傷的膜結(jié)構(gòu)，如果復(fù)蘇時間不夠長，也會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的降低。結(jié)果表明（圖2F），最佳的孵育時間為6 h，電轉(zhuǎn)化效率為9.6×108（CFU/?g DNA）。

3.1.9 不同孵育溫度對電轉(zhuǎn)化的影響

在電轉(zhuǎn)化過程中，低溫條件對細胞壁與細胞膜的脆性有一定影響，在瞬時的高電壓條件下在細胞表面更容易形成局部的瞬態(tài)孔隙，使得外源 DNA 更容易電轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)部。結(jié)果表明（圖2G），當溫度為37℃時，其電轉(zhuǎn)化效率僅為0.4×108 CFU/?g DNA，而當溫度保持在0～4℃時，其電轉(zhuǎn)化效率可達10.2×108 CFU/?g DNA，即0～4℃時的電轉(zhuǎn)化效率比37℃時提高了約26倍。

3.1.10 優(yōu)化前后電轉(zhuǎn)化效率的對比

通過上述條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)電轉(zhuǎn)強度、孵育時間和孵育溫度是影響電轉(zhuǎn)效率的主要因素，并建立了適合該菌株的最優(yōu)電轉(zhuǎn)參數(shù)：甘油/甘露醇溶液的濃度為20%/1.5%，甘氨酸濃度為2%，電場強度為9 kV/cm，星孢菌絲體濃度為150 μL，質(zhì)粒濃度為1 ?g，孵育時間為6 h及孵育溫度為0～4℃。電轉(zhuǎn)效率從4×106提高至9.6×108 （CFU/?gDNA）。本試驗結(jié)果為后續(xù)的構(gòu)建表達質(zhì)粒提供了遺傳操作基礎(chǔ)。

3.2 工程菌的構(gòu)建

3.2.1 質(zhì)粒pSET152-staR-ermE*p和pSET152-staR-kasO*p的構(gòu)建

以星形孢菌素產(chǎn)生菌ST-07的基因組為模板，用staR-F/R引物通過在體外通過PCR擴增得到，得到2.8 kb大小的staR基因片段。2個不同的啟動子ermE*p和kasO*p，分別以pIJermE和pSBJ153為模板，以erm*E-F/R和kasO*P-F/R為引物通過PCR分別得到220和100 bp大小的片段。將獲得的2種不同的啟動子片段分別和staR基因片段與用NotINdeI酶切的pSET152質(zhì)粒連接，獲得pSET152-staR-ermE*p和pSET152-staR-kasO*p質(zhì)粒（圖3）。

3.2.2 ST-A-1、ST-D-5和ST-H-23工程菌的構(gòu)建

按“2.1”中的平板培養(yǎng)對星孢產(chǎn)生菌ST-07進行培養(yǎng)，制備星孢菌絲體，將重組的質(zhì)粒pSET152、pSET152-staR-kasO*p和pSET152-staR-ermE*p與DH5α感受態(tài)進行轉(zhuǎn)化，抽提質(zhì)粒，按照“3.1.10”優(yōu)化好的電轉(zhuǎn)化條件將重組質(zhì)粒導(dǎo)入目標菌株ST-07中，從含有50 ?g/mL安普霉素的ISP2平板中分別挑取多個轉(zhuǎn)化子進行搖瓶發(fā)酵，經(jīng)HPLC檢測效價，分別得到3種質(zhì)粒的 ST-A-1、ST-D-5和ST-H-23高產(chǎn)工程菌。

3.2.3 工程菌的驗證

將獲得的ST-A-1、ST-D-5、ST-H-23菌株接種至含有50 ?g/mL安普霉素的ISP2平板，28℃培養(yǎng)5～7 d，均生長狀況良好。將ST-A-1、ST-D-5、ST-H-23菌株進行PCR擴增驗證（圖4），PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測序分析，確認為質(zhì)粒pSET152、pSET152-staR-kasO*p和pSET152-staR-ermE*p。結(jié)果表明構(gòu)建好不同啟動子控制下的調(diào)控基因staR工程菌。

3.3 工程菌株發(fā)酵

按照“2.1”項下的方法進行發(fā)酵試驗，使用ISP2平板培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、初始發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果見圖5。可見，ST-A-1菌株的星孢發(fā)酵單位與初始菌株ST-07相差無幾，ST-D-5和ST-H-23菌株的星孢發(fā)酵單位與初始菌株ST-07分別提高17%和9%，其中ST-D-5星孢的最高單位可達923 mg/L，說明staR基因?qū)儆谡{(diào)控基因，強啟動子kasO*p效果更好，對該staR基因進行加強表達可以提高星形孢菌素的產(chǎn)量。

4 討論

星形孢菌素主要通過微生物發(fā)酵獲得，目前文獻報道的星形孢菌素的產(chǎn)生菌株較多[11-13]，但是發(fā)酵單位較低，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。傳統(tǒng)的菌種選育方法很難解除微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成過程中的限速步驟。通過基因工程的手段，可以定向并且理性的對菌株進行改造。本試驗優(yōu)化了電轉(zhuǎn)化的條件，電轉(zhuǎn)效率從4×106提高至9.6×108（CFU/?g DNA），為星形孢菌素產(chǎn)生菌的基因工程改造奠定了基礎(chǔ)。在星孢產(chǎn)生菌電轉(zhuǎn)入不同啟動子的加強表達staR基因，獲得工程菌ST-D-5、ST-H-23，其中ST-D-5菌株的星形孢菌素發(fā)酵單位比初始菌株ST-07提高了17%，最高單位可達923 mg/L。本試驗通過構(gòu)建不同啟動子控制下的staR調(diào)控基因，提高了星形孢菌素的發(fā)酵單位，在后續(xù)研究中一方面可以考慮增加調(diào)控基因的拷貝數(shù)，篩選具有較高潛力的工程菌來進一步提高發(fā)酵單位。另一方面可以進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝，加強發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)、菌體濃度、溶氧、pH等參數(shù)的檢測和調(diào)節(jié)，可進一步提高星形孢菌素的產(chǎn)量，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻

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收稿日期：2022-09-27

作者簡介：黃浩龍，男，生于1999年，在讀碩士研究生，主要研究方向為微生物與生化藥學(xué)，E-mail： huanghaolong@126.com

*通信作者，E-mail： haifenghu88@163.com