張雪麗,張金江,王宏圖,冷婧,趙穎婕,胡建軍,敖維平*

(1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)(2 阿圖什市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,新疆 阿圖什 845350)(3 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)

豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)又稱為豬接觸傳染性胸膜肺炎,是一種能引起豬高度接觸性的呼吸道傳染病,其病原為豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP),舊稱胸膜肺炎嗜血桿菌(haemophiluspleuropneumoniae)或副溶血嗜血桿菌(H.parahaemolyticus)。該病主要表現(xiàn)為高度傳染性、致死性,已成為危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一[1-2]。世界各養(yǎng)豬國家均有此病的報(bào)道,我國于1987年首次在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)本病存在。

根據(jù)APP在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)是否依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD),可將其分為生物Ⅰ型(NAD依賴型)、生物Ⅱ型(非NAD依賴型)2種生物型。其中,生物Ⅰ型具有極強(qiáng)的溶血活性和細(xì)胞毒性,毒力強(qiáng),危害大;與金黃色葡萄球菌一起培養(yǎng)時(shí),可為其提供必需的生長(zhǎng)因子。根據(jù)莢膜多糖、LPS的抗原差異性,APP可分為19個(gè)血清型[3-4],不同血清型菌株的毒力存在差異,其中1、5、9及11型毒力最強(qiáng),3、6型毒力弱[5]。APP血清型1型是最近頻繁報(bào)道的血清型,毒力強(qiáng),危害大。

國內(nèi)多位學(xué)者報(bào)道了APP血清型及其流行情況,APP血清型主要包括1、2、3、4、5、7、8、9、10型,但不同地域血清型可能存在差異,血清型的感染率也存在差異[6-7]。2007年,韓文星等[8]從新疆某豬場(chǎng)分離到APP并進(jìn)行了部分生物學(xué)特性研究,但未確定APP血清型。2012年,王忠山等[9]在新疆北疆某墾區(qū)64個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)進(jìn)行了部分豬疫病血清學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)APP存在與其他疫病混合感染且感染率高的情況。2019年,鄭培等[10]在新疆昌吉市和奇臺(tái)縣規(guī)?；i場(chǎng)分離得到APP血清型5型菌株,該菌株已成為新疆流行的優(yōu)勢(shì)菌株。在國外,STRINGER O W 等[3]通過APP血清型19型特異性引物對(duì)來自不同地區(qū)的病豬進(jìn)行了豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌鑒定,其中來自丹麥的菌株7213384-1豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌被建議作為血清型19型的參考株。

目前,世界上不同國家及地區(qū)APP流行菌株的血清型、生物型、流行率不盡一致,同時(shí)各血清型間交叉保護(hù)力弱[2]。另外,APP對(duì)抗菌藥出現(xiàn)耐藥性或多重耐藥性的現(xiàn)象,給該病的預(yù)防、治療、凈化等帶來了一定的難度。因此,對(duì)APP進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、血清型分型、藥敏試驗(yàn)等尤為必要。新疆南疆某規(guī)模豬場(chǎng)疑似爆發(fā)APP,為減少養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失,本試驗(yàn)通過臨床剖檢、病理觀察、細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、PCR鑒定以及藥敏試驗(yàn)和動(dòng)物致病性試驗(yàn)來確定該疾病病原、血清型及耐藥性,為PCP的防治、疫苗選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

2021年9月中旬,新疆南疆某規(guī)模豬場(chǎng)3 d內(nèi)連續(xù)死亡10頭體重約50 kg的4～5月齡育肥豬,病程短,病豬體溫升高。病理觀察見胸腔有明顯的纖維素滲出,肺與胸膜粘連,肺臟腫大、變性、出血、淤血,耳朵發(fā)紺,口鼻流涎帶有血絲。經(jīng)獸醫(yī)流行病學(xué)調(diào)查得知該豬場(chǎng)有引進(jìn)后備種豬的記錄史,初診為疑似豬傳染性胸膜肺炎。無菌操作采集發(fā)病死亡豬的肺臟、淋巴結(jié)等組織病料,低溫保存并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.1.2 主要試劑

胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA-YE)、胰蛋白胨大豆酵母肉湯培養(yǎng)基(TSB-YE)、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)購自北京索萊寶科技有限公司;BHI培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;抗生素藥敏試驗(yàn)紙片購自杭州微生物試劑有限公司;2×Taq PCR MasterMix、DL-2 000 Marker購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 引物

apxI、apxⅡ、apxⅢ、apxIV基因特異性引物、血清型分型引物借鑒文獻(xiàn)[3-4,11-14](如表1、表2所示),所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 APP apx基因特異性引物

表2 APP血清型PCR鑒定引物

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離

無菌采取病料接種于含10 μg/mL NAD的TSA-YE瓊脂培養(yǎng)基和不含NAD的TSA-YE瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24～48 h。觀察劃線細(xì)菌生長(zhǎng)狀況及菌落形態(tài),挑取疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,觀察其形態(tài)特征。挑取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～18 h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 NAD依賴試驗(yàn)

挑取單菌落分別劃線接種于NAD陽性(10 μg/mL NAD,5%牛血清)、NAD陰性(不含有NAD,5%牛血清)的TSA-YE瓊脂培養(yǎng)基。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h,觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.3 “衛(wèi)星”現(xiàn)象試驗(yàn)

將分離株在含5%新鮮綿羊血的TSA-YE瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)劃線,再用金黃色葡萄球菌劃一直線,垂直(不相交)于金黃色葡萄球菌劃線接種分離的APP,37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.4 CAMP 試驗(yàn)

用金黃色葡萄球菌在含5%新鮮綿羊血的TSA-YE培養(yǎng)基上劃一橫線,在此橫線下方約0.3～0.5 cm處,用NAD陽性APP分離菌株垂直劃線接種,但不接觸橫線,37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.5 生化試驗(yàn)

挑取分離株純培養(yǎng)物接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管,37 ℃培養(yǎng)18～24 h。明膠生化反應(yīng)若在18～24 h為陰性,可繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h,轉(zhuǎn)冰箱2～8 ℃培養(yǎng)30 min,觀察結(jié)果。

1.2.6 APP分離株P(guān)CR鑒定

分離菌株經(jīng)apxIV特異性引物(見表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系(25 μL)為2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,10 μmol/L上下游引物各1 μL,模板1 μL,ddH2O補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,回收陽性PCR產(chǎn)物,送上海賽恒生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.7 APP血清型分型PCR鑒定

根據(jù)APP種的PCR鑒定結(jié)果,以APP血清型分型引物(表2)進(jìn)行PCR鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,回收陽性PCR產(chǎn)物,送上海賽恒生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.8apx毒力基因PCR鑒定

以apx毒力基因特異性引物(見表1)進(jìn)行PCR檢測(cè),PCR反應(yīng)體系為25 μL,PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),回收陽性PCR產(chǎn)物,送上海賽恒生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.9floR耐藥基因PCR檢測(cè)

floR耐藥基因引物[15]floR-F:5′-CGACGCCCGCTATGATCCAACTC-3′,floR-R:5′-CCCAAAAAGCCGGACTCGCGAAG-3′。PCR反應(yīng)體系(25 μL):2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,2種引物各1 μL,模板2 μL,ddH2O補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,63.5 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。目標(biāo)片段長(zhǎng)度約510 bp。

1.2.10 藥敏試驗(yàn)(K-B紙片法)

用PBS將菌液濃度調(diào)至含菌量約1.5×108CFU/mL[16],取200 μL涂布于含NAD的TSA-YE培養(yǎng)基上,無菌操作將藥敏片貼在培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)18～24 h,測(cè)量每個(gè)藥敏紙片抑菌圈的直徑大小。根據(jù)杭州微生物試劑有限公司《藥敏實(shí)驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)》中嗜血桿菌的藥敏紙片抑菌標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.2.11 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

20只小鼠隨機(jī)分為2組(試驗(yàn)組、對(duì)照組),每組10只,試驗(yàn)組10只小鼠接種細(xì)菌的劑量為1.5×109CFU/只,對(duì)照組接種同體積的生理鹽水。接種后觀察并記錄各組小鼠臨床癥狀,發(fā)病和死亡時(shí)間及數(shù)量,剖檢變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀和病理學(xué)觀察

臨床觀察見病豬精神沉郁、咳嗽、高熱和腹式呼吸等癥狀。急性發(fā)病豬可見鼻孔流血、耳朵發(fā)紺,口鼻流涎帶有血絲,快速死亡。剖檢死亡豬只,肺臟兩側(cè)邊緣出現(xiàn)紫紅色,肺臟淤血、充血,呈現(xiàn)紫紅色,肺表面覆蓋一層黃色纖維素性滲出物,肺與胸壁、縱隔呈纖維素性粘連(如圖1所示)。胸腔內(nèi)大量積液,呈現(xiàn)典型的纖維素性出血性胸膜肺炎癥狀。腹股溝淋巴結(jié)、肺淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)腫大(如圖2所示)。

圖1 纖維素性粘連

圖2 腸系膜淋巴結(jié)腫大

2.2 細(xì)菌分離結(jié)果

在含10 μg/mL NAD的TSA-YE培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上均可見圓形隆起、光滑、半透明、直徑為1～2 mm的濁白色小菌落(如圖3所示)。在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)生β溶血。

圖3 APP菌落形態(tài)

革蘭染色鏡檢可見革蘭陰性小球桿菌(如圖4所示)。不含NAD的TSA-YE培養(yǎng)基上細(xì)菌生長(zhǎng)不良,甚至無菌落生長(zhǎng)。

圖4 APP菌體形態(tài)(革蘭染色,1 000×)

2.3 NAD依賴試驗(yàn)及“衛(wèi)星”現(xiàn)象試驗(yàn)結(jié)果

分離株在含有NAD的TSA-YE培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好,而在不含有NAD的培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。在TSA-YE培養(yǎng)基上呈典型“衛(wèi)星”現(xiàn)象,越靠近金黃色葡萄球菌處,分離株菌落生長(zhǎng)越大,反之越小,甚至不見菌落生長(zhǎng);與生物Ⅰ型APP的生長(zhǎng)特征一致(如圖5所示)。

圖5 分離株“衛(wèi)星”現(xiàn)象

2.4 CAMP試驗(yàn)結(jié)果

APP能產(chǎn)生CAMP因子,可促進(jìn)金黃色葡萄球菌β-溶血素活性。在血瓊脂平板上2種細(xì)菌交界處溶血能力增強(qiáng),形成箭頭狀的溶血區(qū)(如圖6所示)。

圖6 分離株CAMP試驗(yàn)現(xiàn)象

2.5 生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果:葡萄糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、蜜二糖、阿拉伯糖,甘露醇、肌醇、山梨醇和VP反應(yīng)等均呈陰性;脲酶、硫化氫、吲哚、明膠生化反應(yīng)呈陽性,符合豬胸膜肺炎放線桿菌的生化特性。

2.6 PCR鑒定結(jié)果

APPapxIV通用引物可PCR擴(kuò)增出約346 bp的目的片段(圖7),與預(yù)期目的條帶大小一致。利用APP血清型分型引物,其中,APP血清型1型引物可PCR擴(kuò)增出約754 bp的目的片段(圖8),而其他APP血清型分型引物未擴(kuò)增出目的條帶,特別是APP血清型19型特異性引物也未擴(kuò)增出目的條帶。利用apxI、apxⅡ、apxIV的特異性引物,對(duì)APP分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別獲得了826 bp、1 069 bp、346 bp的目的片段,而apxⅢ基因特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)未擴(kuò)增出目的片段(圖9)。floR基因檢測(cè)引物可PCR擴(kuò)增出約510 bp的目的條帶(圖10)。

M:DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:陰性對(duì)照;2:apxIV PCR產(chǎn)物。

M:DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:陰性對(duì)照;2:APP血清型19型PCR產(chǎn)物;3:APP血清型1型PCR產(chǎn)物。

M:DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:陰性對(duì)照;2:apxI PCR產(chǎn)物;3:apxⅡ PCR產(chǎn)物;4:apxⅢ PCR產(chǎn)物;5:apxIV PCR產(chǎn)物。

M:DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:陰性對(duì)照;2: floR PCR產(chǎn)物。

2.7 核苷酸同源性分析

采用apxIV基因特異性引物進(jìn)行PCR鑒定,測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,與APP參考株(GenBank登錄號(hào):AF021919、AF188859、HM021153、AF188861)核苷酸同源性達(dá)99.7%以上。確定該分離株為APP,命名為APP-7T-1。

用APP血清型分型引物對(duì)APP-7T-1分離株進(jìn)行PCR鑒定,僅APP血清型1型引物PCR擴(kuò)增出目的條帶。經(jīng)測(cè)序、BLAST比對(duì),分離株與APP血清型1型參考株(GenBank登錄號(hào):AF021919)核苷酸同源性達(dá)100%。同時(shí),采用APP血清型19型特異性引物[3]進(jìn)行PCR鑒別,沒有擴(kuò)增出目的條帶,進(jìn)一步證實(shí)APP-7T-1分離株為APP血清型1型,而不是APP血清型19型。

apxI、apxⅡ、apxIV、floR基因經(jīng)PCR擴(kuò)增、測(cè)序、BLAST比對(duì),與APP參考株核苷酸同源性均達(dá)99.5%以上。

2.8 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

用APP-7T-1分離株對(duì)喹諾酮類(環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星)、β-內(nèi)酰胺類(頭孢噻呋、頭孢唑林、頭孢拉定)、氨基糖苷類(卡那霉素、慶大霉素、丁胺卡那、氨芐西林、青霉素)、大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、阿奇霉素)、四環(huán)素類(四環(huán)素、多西環(huán)素)、磺胺類(復(fù)方新諾明)、酰胺醇類(氟苯尼考)等進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果顯示,APP-7T-1分離株對(duì)喹諾酮類(環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星)具有敏感性,對(duì)其他藥物不敏感或低敏感(表3)。

2.9 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠均表現(xiàn)出反應(yīng)遲鈍,閉眼縮脖,呆立角落,被毛扎立,活動(dòng)停止,3 d內(nèi)全部死亡,剖檢可見肺臟彌散性出血、脾臟腫大等癥狀。無菌采集發(fā)病死亡小鼠肺臟、脾臟,均可分離出豬胸膜肺炎放線桿菌,空白對(duì)照組小鼠全部正常(圖11)。

A:試驗(yàn)組致病小鼠;B:對(duì)照組正常小鼠。

3 討論

當(dāng)前國內(nèi)尚未有對(duì)APP血清型19型的公開報(bào)道,因此,本研究在鑒定APP血清型1、2、3、5、6、7、8、12型的基礎(chǔ)上,還開展了對(duì)血清型19型的鑒定。通過鑒定,確認(rèn)了本次新疆南疆發(fā)病豬場(chǎng)發(fā)生的是APP血清型1型。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查,該豬場(chǎng)發(fā)病前2個(gè)月曾從北疆某豬場(chǎng)引進(jìn)后備種豬,此次發(fā)病是否與引種有關(guān)系,仍需做進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果與公開報(bào)道的新疆南、北疆鑒定的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型存在差異,因此以何種血清型為主要流行優(yōu)勢(shì)菌株仍需要做大量的流行病學(xué)調(diào)查。

APP的毒力因子有多種,如溶血外毒素(Apx)、菌毛、莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白、蛋白酶、黏附因子等。其中,溶血外毒素是APP導(dǎo)致豬發(fā)病的主要毒力因子。盡管脂多糖能引起肺部炎性細(xì)胞滲出,但不足以誘發(fā)胸膜肺炎的特征性病變。而溶血外毒素是本菌最重要的毒力因子,不同APP的血清型菌株可產(chǎn)生4種不同的細(xì)胞毒素,分別為ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ。這些毒素具有細(xì)胞毒性或溶血性,是一種穿孔毒素,屬于含重復(fù)子毒素(repeats-in-toxin,RTX)家族[5]。不同的APP血清型含有的毒素不盡相同,APP血清型中1、5、9、11型可產(chǎn)生ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅣ。ApxⅠ毒素具有很強(qiáng)的溶血活性、細(xì)胞毒性,而ApxⅡ毒素、ApxⅣ毒素則相對(duì)較弱。本研究中分離株被鑒定為APP血清型1型,且檢測(cè)到分離株中含有apxⅠ、apxⅡ、apxⅣ基因,致病性試驗(yàn)中該分離株可引起試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病、死亡,證實(shí)該分離株具有致病性。

氟苯尼考(florfenicol,FFC)是用于APP治療的常用抗生素藥物之一,不同地域分離獲得的APP分離株耐藥性存在一定的差異。近年來臨床上已檢測(cè)到其相關(guān)耐藥基因floR[17],給APP的治療帶來一定難度。本研究中藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離株對(duì)氟苯尼考具有耐藥性,同時(shí),在分離株中檢測(cè)出floR耐藥基因,耐藥基因的檢出與藥敏試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

目前,免疫接種疫苗依然是APP防控的重要手段之一,由于地域差異、血清型不同,各型間交叉保護(hù)力存在差異,因此,選擇合適疫苗顯得尤為重要。對(duì)于已感染豬場(chǎng)或流行率較高的豬場(chǎng),幸存豬多半為帶菌豬,很難控制,因而豬場(chǎng)在引種時(shí)應(yīng)十分謹(jǐn)慎,杜絕從疫區(qū)引種,最好從疫苗接種完全、從未發(fā)病的豬場(chǎng)引種。

4 結(jié)論

經(jīng)病原學(xué)、分子生物學(xué)鑒定分析,證實(shí)該豬場(chǎng)發(fā)病死亡豬主要是由APP所致,且該分離株為生物I型(依賴NAD)、血清型1型豬胸膜肺炎放線桿菌。