楊 楠 洪玉燕 潘夢婷 許 文 徐惠龍 范世明

三葉青(Tetrastigmahemsleyanum.Diels et Gilg)為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤,別名金線吊葫蘆、石猴子等[1],即福建、浙江習用傳統(tǒng)中藥“一粒珠”[2],也是福建省特色畬藥[3]。三葉青含有酚酸類、黃酮類等成分,具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等作用[4,5]。三葉青藥用價值高,其塊根市場供不應求,其葉產量較為穩(wěn)定,但不同采收期對其活性成分累積影響較大。研究不同采收期對明確三葉青葉中有效成分的變化規(guī)律具有重要意義。目前三葉青采收期研究主要集中在塊根,且1～4月均可采收[6]。本研究建立UPLC-MS/MS法同時測定三葉青葉中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素鼠李糖苷、異葒草素鼠李糖苷、葒草素鼠李糖苷、綠原酸、隱綠原酸和新綠原酸的含量。以有效成分與生物量為評價指標,結合熵權TOPSIS法對不同采收期的三葉青葉進行評估,為三葉青葉質量評價和開發(fā)利用研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司),Xevo TQ-S三重四級桿質譜(美國Waters公司),CPA225D型半微量天平(德國Sartorius公司),BSA224S萬分之一天平(賽多利斯科學儀器有限公司),KQ-500E臺式超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司),FY135型中藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司),HC-2068高速離心機(安徽中佳科學儀器有限公司)。

1.2 材料本研究樣品采自福建中醫(yī)藥大學藥用植物園,由福建中醫(yī)藥大學范世明正高級實驗師鑒定為葡萄科植物三葉崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)的葉片。對照品牡荊苷(MUST-16030811)、異牡荊苷(MUST-15071112)、葒草苷(MUST-13070502)、異葒草苷(MUST-13100902)購于成都曼思特生物科技有限公司,牡荊素鼠李糖苷(Y130506)、異牡荊素鼠李糖苷(64820991)、葒草素鼠李糖苷(44257931)、異葒草素鼠李糖苷(50993776)、綠原酸(327979)、新綠原酸(906332)、隱綠原酸(905997)購于北京賽百草科技有限公司。內標甘草苷(MUST-14100910)購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈(色譜純);其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱:Waters CORTECS?UPLC?C18(2.1 mm×100 mm,1.6 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%甲酸水(B);梯度洗脫(0～0.5 min,A=5%;0.5～1.5 min,5%A→9%A;1.5～4.5 min,9%A→11%A;4.5～6.5 min,11%A→12.5%A;6.5～9.6 min,A=12.5%;9.6～10.4 min,12.5%A→20%A;10.4～10.5 min,20%A→5%A;10.5～12 min,A=5%);進樣量:2 μl;流速:0.25 ml/min;柱溫:45 ℃。

2.2 質譜條件電噴霧正負離子模式;毛細管電壓3.5 kV(正離子模式)和2.5 kV(負離子模式);脫溶劑氣流(氮氣)流速800 L·Hr-1;脫溶劑溫度500 ℃;離子源溫度150 ℃;錐孔氣流(氮氣)流速50 L·h-1;二級錐孔萃取電壓:3.00 V;停留時間:5 ms;碰撞氣體氬氣;載氣:氮氣。采用MRM定量模式,11種分析物及內標的質譜分析條件參數(shù)見表1。

表1 11個成分及內標的質譜測定條件

2.3 對照品溶液的制備分別精密稱取牡荊苷、異牡荊苷、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素鼠李糖苷、葒草素鼠李糖苷、異葒草素鼠李糖、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸對照品適量,用甲醇制成濃度約為1.259、0.985、1.468、0.966、0.879、0.942、0.886、1.251、0.752、0.794、1.510 mg/ml的單一對照品儲備液,其他不同濃度對照品溶液由10%甲醇稀釋得到,內標液為甘草苷(100 ng/ml)。

2.4 供試品溶液的制備將三葉青葉粉碎,過40目篩,精密稱取0.1 g,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 ml,密塞,稱定重量,超聲(功率250 W,頻率50 kHz)提取30 min,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補足減失重量,搖勻,取適量提取液12 000 r/min離心10 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜,濾液為樣品溶液和內標液按1∶9(100 μl∶900 μl)混合均勻進行測定。

2.5 熵權TOPSIS法模型的建立建立原始評價矩陣:以三葉青中酚酸類成分含量、黃酮類成分含量、生物量為評價指標,原始矩陣公式為:

A=(χij)m×n

(1)

χij為第j個指標下第i個項目的評價值,m為采收月份(m=12),n為評價指標(n=3)。2)建立標準歸一化決策矩陣:本研究中的3個指標均為正向化指標,但各指標量綱不一,需進行歸一化處理,公式為:

(2)

3)熵權法[7]:以歸一化數(shù)據(jù)計算各指標的信息熵(ej)、信息效用值(hj)、熵權系數(shù)(Wj),公式分別為:

(3)

hi=1-ej

(4)

(5)

4)建立TOPSIS法[7]:首先確定評價指標的正理想解(A+)和負理想解(A-):

(6)

接著計算出各評價指標分別與正負理想解的距離值D+和D-,最終計算得出評價指標與最優(yōu)方案的接近度(Ci值),根據(jù)Ci值大小排序來評定三葉青葉的最佳采收期。計算公式如下:

(7)

(8)

2.6 方法學考察

2.6.1 質譜測定方法三葉青樣品和混合對照品溶液按照上述色譜及質譜條件下分析得三葉青的UPLC-MS/MS色譜圖,11種化合物和內標均能在各自通道中分離良好。見圖1。

注:1.新綠原酸;2.綠原酸;3.隱綠原酸;4.異葒草苷;5.葒草苷;6.牡荊苷;7.異牡荊苷;8.異葒草素鼠李糖苷;9.葒草素鼠李糖苷;10.甘草苷11.牡荊素鼠李糖苷;12.異牡荊素鼠李糖苷。圖1 空白(A)對照品(B)三葉青葉(C)色譜圖

2.6.2 線性與范圍取各對照品儲備液,用10%甲醇稀釋系列梯度濃度的對照品混合溶液,測定前對照品溶液和內標溶液按1∶9混合均勻測定。以對照品峰面積與內標峰面積的比值(Y)對分析物濃度(X)作線性回歸,繪制標準曲線,得到回歸方程和相關系數(shù),并以信噪比10計算定量限(LOQ),以信噪比3計算檢測限(LOD)。見表2。

2.6.3 精密度實驗精密吸取線性最低濃度點、低、中、高混合對照品溶液1 μl,一天內連續(xù)進樣6 次,及連續(xù)6 天測定,根據(jù)標準曲線計算濃度,其日內精密度和日間精密度RSD均在1.13%～4.78%,表明儀器精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性實驗精密稱取同一批(201601)三葉青葉6份,按供試品制備方法進行制備,分別在室溫下放置0、4、8、12、18和24 h進行測定,根據(jù)標準曲線計算濃度,其RSD均在3.58%～4.92%,表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.6.5 重復性實驗精密稱取同一批(201601)三葉青葉6份,按供試品制備方法進行制備,依法測定,11種成分含量的RSD均在4.53%以內,表明重復性良好。

2.6.6 回收率實驗精密稱取重復性實驗已知含量三葉青葉約0.05 g,近似1∶1分別加入11個對照品,重復6次,按供試品制備方法進行制備,依法測定,計算各個成分回收率范圍在98.09%～101.16%,其RSD范圍均在2.22%～3.20%,表明方法回收率符合分析要求。

2.7 不同采收期的酚類含量與生物量的動態(tài)變化11種成分在12個采收期呈不同的變化規(guī)律(見圖2),牡荊苷和異牡荊苷變化趨勢為1月份開始急速上升,2月份達到峰值后下降,6月份后含量最低,均小于0.0562 mg/g;異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素鼠李糖苷均在3～5月份含量較高,隨后含量逐漸下降。葒草素鼠李糖苷、異葒草素鼠李糖、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸積累趨勢基本趨于一致,5月份含量最高,6月份突然降低即出現(xiàn)上升后下降的循環(huán)。三葉青葉生物量累積在4～6月份呈上升趨勢,6月份出現(xiàn)峰值,7～11月份保持較高水平。

注:不同小寫字母表示不同月份之間的比較,P<0.05。圖2 不同月份采收的三葉青葉中11個成分含量及生物量動態(tài)變化

2.8 熵權TOPSIS法綜合評價分析熵權TOPSIS法是以標準化處理的評價指標為基礎通過計算權重,來體現(xiàn)各指標的重要程度,同時將無量綱化的指標通過計算正負理想解和相對貼近度綜合評價最佳采收期[8,9]。各指標權重結果為信息熵值e={0.8602,0.8984,0.8532};信息效用值h={0.1398,0.1016,0.1468};權重系數(shù)Wj={36.02%,26.17%,37.81%};說明生物量是采收期評價分析中的重要因素。TOPSIS法計算得到D+、D-及評價指標與最優(yōu)方案的接近度(Ci值),結果見表3,排名靠前為5月、6月、4月,7月,因此三葉青葉的采收期以4～7月份為最佳。

表3 不同采收期三葉青葉綜合評價排序

3 小結

課題組前期通過研究三葉青葉中有效成分發(fā)現(xiàn)葉中酚類成分含量較高,尤其是總黃酮[10,11]。因此本研究對8個黃酮類成分和3個酚酸類成分的含量進行測定,結果牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素鼠李糖苷、葒草素鼠李糖苷和綠原酸在三葉青葉中含量均較高,牡荊苷、異牡荊苷、異葒草苷和隱綠原酸含量相對較低。11種成分含量隨時間變化有所差異,但基本符合3～5月份含量最高,其他月份含量較低。三葉青從11月下旬至次年2月進入休眠期,基本停止生長,從3月下旬開始逐漸萌發(fā)新枝葉,此階段三葉青逐步解除休眠,抽發(fā)新芽,確保植株的正常生長,有效成分積累較高,到5月達到峰值,6～8月份為夏季,三葉青生長旺盛,進入快速生長階段[12]。在實際采收過程中6月份生物量最高,黃酮類和酚酸類成分含量在3～5月份較高,符合植物生長規(guī)律。為了更好地分析三葉青葉的最佳采收期,利用熵權TPOSIS法對葉片有效成分和生物量進行綜合評價,三葉青葉在5月份采收最優(yōu),4、6、7月份采收次之,中藥材適宜采收期的確立既要重視指標性化學成分體系的選擇,同時也要注重其藥用部位的生物產量,以實現(xiàn)藥材生產的質量最優(yōu)和產量最大化原則。故建議在4～7月份采收最佳。