于東瑾 辛蕊 馬永正 牛志廣

摘要：青銅小單胞菌MCCC 1K05785分離自海洋近岸沉積物。作為天然產物的來源，它同時表現(xiàn)出了對多種抗生素的耐藥性。本研究對該菌株進行了表征，并通過對菌株進行全基因組測序，在基因水平上探索了其潛在含有的耐藥相關蛋白，以明確該菌株的耐藥機制。首先在實驗室環(huán)境下培養(yǎng)菌株并測定其生長曲線，再通過對菌株進行藥敏實驗和全基因組測序，挖掘菌株耐藥相關蛋白、潛在合成的次級代謝產物以及其他特性。結果表明，MCCC 1K05785菌落呈橙紅色，60～108 h為菌株對數(shù)生長期。菌株對氨芐西林、磺胺甲惡唑、利福平、氯霉素、萬古霉素、紅霉素耐藥。菌株基因組全長為6861996 bp，GC含量為72.79%。共預測到6136個基因。預測基因序列總長度為6196530 bp。KEGG數(shù)據(jù)庫注釋到336個基因參與次級代謝產物合成，antiSMASH預測到23個基因簇。分析耐藥蛋白發(fā)現(xiàn)，外排泵是菌株表達豐富耐藥性的主要機制。揭示了MCCC 1K05785是具有多重抗生素耐藥性的菌株，同時具有合成新穎次級代謝產物的潛力。

關鍵詞：青銅小單胞菌；耐藥蛋白；全基因組測序；次級代謝產物；抗生素

中圖分類號：R978 ?文獻標志碼：A

Study on the growth characteristics and drug resistance related proteins of Micromonospora chalcea MCCC 1K05785

Yu Dongjin1 ， Xin Rui1 ， Ma Yongzheng1 ， and Niu Zhiguang1， 2

（1 School of Marine Science and Technology， Tianjin 300072; 2 International Research Institute of Tianjin University， Fuzhou 350207）

Abstract Micromonospora chalcea MCCC 1K05785 was isolated from offshore sediments. As a source of natural products， it also displayed drug resistance to multiple antibiotics. Armed with whole genome sequencing， this study characterized the strain and explore the potential drug-resistant-related proteins at the genetic level so that to make clear the drug-resistant mechanism of this strain. Firstly， we cultivated the strain in the laboratory environment and determined growth curve. Then， drug sensitivity experiments and whole genome sequencing were conducted to explore the drug-resistant related proteins， potential synthesized secondary metabolites and other characteristics of the strain. Our results show that， the colony of MCCC 1K05785 is orange red. The logarithmic growth period is about 60-108 h. The strain is resistant to ampicillin， sulfamethoxazole， rifampicin， chloramphenicol， vancomycin and erythromycin. The total length of the strain genome is 6861996 bp and the GC content is 72.79%. A total of 6136 genes are predicted. The predicted total length of the gene sequence is 6196530 bp. The KEGG database indicates that 336 genes participate in the synthesis of secondary metabolites and antiSMASH predicts there are 23 gene clusters in this strain. Furthermore， the efflux pumps might play an important the role in the emergence of drug resistance. As a novel strain with multiple antibiotic-resistance， it might be a potential source to discover the new secondary metabolites.

Key words Micromonospora chalcea; Drug-resistant proteins; Whole genome sequencing; Secondary metabolites; Antibiotics

隨著世界重大公共衛(wèi)生事件頻發(fā)，抗生素濫用導致細菌耐藥問題加劇[1]，為了應對這一環(huán)境問題，從源頭出發(fā)研究細菌耐藥生化機制已迫在眉睫。放線菌是一種高G+C含量的革蘭氏陽性菌，是最大的細菌門之一，存在于陸地及海洋沉積物中[2]。海洋環(huán)境獨特，可使放線菌產生新穎的活性化合物。海洋放線菌包含一系列編碼代謝產物的基因，這些產物已被證實具有抗菌、抗腫瘤及特殊的酶活性[3]，約70%的天然抗生素由放線菌產生。因此，放線菌也必然表達豐富的抗生素耐藥性以保護自己免受自產抗生素的攻擊。

小單孢菌屬（Micromonospora）在自然界中廣泛分布于不同的地理棲息地：土壤、紅樹林沉積物、海洋沉積物和極端棲息地等。小單孢菌屬是革蘭陽性菌、由孢子形成的需氧放線菌，具有獨特的形態(tài)特征，單孢子呈球形或橢圓形，直徑為0.7～1.5 ?m[4]，好氧，為非酸性和嗜溫微生物[5]，其菌絲體具有類胡蘿卜素，使其菌落呈現(xiàn)黃色、橙色、紅色或紫色[6]。長期以來，小單胞菌屬是次級代謝產物的重要來源[7]。環(huán)境中的微生物通過水平轉移的方式使其成為宿主菌表達耐藥性，其耐藥機制多為基因變化的結果[8]。

隨著高通量測序及全基因組測序技術的發(fā)展，已經有越來越多的微生物基因組完成測序[9]。納米孔測序技術（nanopore sequencing（ONT））是一種檢測納米孔單分子的實時電信號測序方法[10]。經過精確匹配，能夠準確確定特定的堿基類型，從而實現(xiàn)快速、準確的序列測量。小單胞菌屬作為稀有放線菌屬，其生產天然產物的潛力僅次于鏈霉菌屬，7%的天然產物來源于小單胞菌屬[11]。青銅小單胞菌可以產生雷克西丁衍生物[12]、慶大霉素、西索米星、新型抗真菌劑Turbinmicin[13]等，具有抗細菌、抗腫瘤和抗真菌等功效[14]。有關青銅小單孢菌的全基因組數(shù)據(jù)研究較少涉及，因此本研究選擇青銅小單孢菌MCCC 1K05785，對其進行前期培養(yǎng)觀察菌株生長性質并進行全基因組測序，為后續(xù)深入研究海洋放線菌的耐藥機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株來源及培養(yǎng)方法

本研究中使用的青銅小單胞菌MCCC 1K05785購買自中國海洋微生物菌種保藏管理中心。該菌株使用2216E培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為：蛋白胨：5.0 g、酵母粉1.0 g、檸檬酸鐵0.1 g、氯化鈉19.45 g、氯化鎂5.98 g、硫酸鈉3.24 g、氯化鈣1.8 g、氯化鉀0.55 g、碳酸鈉0.16 g、溴化鉀0.08 g、氯化鍶0.034 g、硼酸0.022 g、硅酸鈉0.004 g、氟化鈉0.0024 g、硝酸鈉0.0016 g、磷酸氫二鈉0.008 g。

1.1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：2216E培養(yǎng)基、Mueller-Hinton（MH）培養(yǎng)基購買自青島海博有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、酵母粉葡萄糖氯霉素瓊脂（YDC）培養(yǎng)基、ISP Medium No.4（ISP4）培養(yǎng)基、ISP Medium No.3（ISP3）培養(yǎng)基、放線菌（改良高氏1號）培養(yǎng)基均購買自天津為科生物技術有限公司。在配置上述培養(yǎng)基時需使用pH值為7.2～7.5的海水，以維持菌株良好生長。藥敏紙片購買自常德比克曼生物科技有限公司，紙片所含抗生素種類包括：氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻吩、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、磺胺甲惡唑、利福平、氯霉素、萬古霉素、多黏菌素B、紅霉素。

主要儀器：尼康TS2倒置生物顯微鏡、Thermo臺式高速冷凍離心機、生物恒溫培養(yǎng)箱、場發(fā)射掃描電子顯微鏡（型號：Regulus8100）等。

1.2 方法

1.2.1 MCCC 1K05785菌株的培養(yǎng)與形態(tài)觀察

劃線純化MCCC 1K05785的單菌落于2216E固體培養(yǎng)基上。固體培養(yǎng)后，用接種環(huán)刮取適量菌體于裝有100 mL液體2216E培養(yǎng)基的帶擋板搖瓶中，150 r/min，

30 ℃搖床培養(yǎng)5～7 d獲得液體菌液。分別取200 μL上述菌液涂布于TSB、PDA、YDC、ISP4、ISP3、高氏一號培養(yǎng)基、2216E固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落形態(tài)、顏色及產孢情況。

將培養(yǎng)5 d的MCCC 1K05785單菌落用接種環(huán)從平板中刮下轉移至酒精擦拭過干凈的無菌載玻片上，將草酸銨結晶紫滴加到細菌涂片上并染色1 min，使用經過高壓滅菌的ddH2O將多余的染液洗去。將碘溶液滴加到細菌涂片中，繼續(xù)染色1 min，使用經過高壓滅菌的ddH2O將多余的碘溶液洗去。使用乙醇溶液滴加至涂片脫色30 s，再使用干凈的濾紙吸干液體。使用番紅染液復染90 s后用高壓滅菌的ddH2O洗去多余液體。涂片靜置干燥后使用倒置顯微鏡以40倍物鏡觀察菌絲體形態(tài)結構。

1.2.2 MCCC 1K05785菌株在場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）下的微觀形態(tài)觀察

取1 mL菌液接種于2216E固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)

5 d。將培養(yǎng)基表面的菌體用接種環(huán)刮下，加入2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定24 h，后用pH為7.0的0.1 M的PBS溶液漂洗菌體，重復三次，每次15 min去除戊二醛。用梯度濃度乙醇溶液（50%、70%、80%、90%、95%）依次對樣品進行脫水處理，每次處理15 min，最后無水乙醇處理兩次，每次20 min。用體積比為1：1的乙醇與醋酸異戊酯的混合液處理樣品30 min，再用純醋酸異戊酯處理樣品1.5 h，最后將樣品冷凍干燥。用鑷子夾取少量冷凍干燥后的菌體放置于導電膠上，離子濺射噴金，使用掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)并拍照。

1.2.3 MCCC 1K05785菌株生長曲線的測定

采用干重法測定菌株生長曲線。將菌株在平板上密集劃線后，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。使用打孔器打下3片菌塊，其中兩塊分別放入兩個裝有60 mL液體2216E培養(yǎng)基中的100 mL擋板搖瓶中，剩余一塊放入100 mL無菌水中，共準備36瓶培養(yǎng)基，統(tǒng)一在30 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)。每隔12 h取出兩個實驗組及一個空白對照組，最后一組培養(yǎng)時間為144 h。使用直徑為50 mm的醋酸纖維濾膜真空抽濾并收集菌絲體，置于80 ℃烘箱中烘干30 min，所得菌絲體重量即為干重。

1.2.4 MCCC 1K05785菌株的藥敏實驗

接種MCCC 1K05785菌液1 mL至固體2216E培養(yǎng)基，使用玻璃珠涂布至菌落均勻密布。貼藥敏紙片使之分布于培養(yǎng)基中央。每種抗生素設置一個對照平板以觀察菌株長滿平板所需時間。以HB101大腸桿菌作為質控菌株，置恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)7 d后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈的大小判定菌株對抗生素的敏感性。

1.2.5 MCCC 1K05785菌株的全基因組文庫構建與數(shù)據(jù)信息分析

DNA提取方法：取1 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的MCCC 1K05785菌液，加入1.5 mL離心管中，室溫8000 r/min離心1 min，棄上清，收集菌體。加入180 μL溶菌酶溶液，重懸菌液，37 ℃水浴30～60 min，再加入400 μL的Buffer Digestion，震蕩混勻。65 ℃水浴1 h至細胞完全裂解。水浴過程中，每10 min顛倒混勻1次，促進樣品裂解。混合液澄清透明證明裂解完全。加入200 μL Buffer PB，充分顛倒混勻，-20 ℃冰箱放置5 min。室溫10000 r/min離心5 min，將上清液500 μL轉移到新的1.5 mL離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒5-8次使之充分混勻，室溫放置2～3 min。室溫10000 r/min離心5 min，棄上清。加入1 mL 75%乙醇，顛倒漂洗1～3 min，10000 r/min離心2 min，棄上清。開蓋倒置5～10 min至殘留的乙醇完全揮發(fā)。得到的DNA樣本用50～100 μL TE Buffer溶解。在-20 ℃環(huán)境下將DNA樣本送至北京百邁客生物科技公司進行全基因組測序分析。

測序流程：準備DNA樣本2 μg，使用G-TUBE管使核酸片段化，使用NEBNext FFPE DNA Repair Mix和NEBNext Ultra Ⅱ End Repair/dA-Tailing Module完成核酸片段的損傷修復和末端修復加A，使用無擴增條形碼擴展試劑盒添加barcode序列并完成測序接頭的連接。用測序芯片制備試劑盒（EXP-FLP001 PRO.6）配制Flow cell Priming mix；用連接測序試劑盒（SQK-LSK109）配置上機文庫；用PromethION Flow Cells（FLO-PRO002）芯片，在PromethION48測序儀運行MinKnow軟件，開始測序。

基因組組分分析包括：重復序列、編碼基因、基因島等分析。利用軟件IslandPath-DIMOB v 0.2[15]預測細菌基因組中的基因島?；蚪M蛋白功能及耐藥相關蛋白注釋使用通用或專有數(shù)據(jù)庫，如：GO[16]、KEGG[17]、eggNOG[18]、SwissProt[19]、TCDB[20]等。基因組圖譜分析：利用已得基因組信息應用軟件Circos v 0.66[21]繪制基因組圈圖。使用antiSMASH v5.0.0[22]鑒定和分析細菌基因組序列中生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Clusters，BGCs）。

2 結果

2.1 MCCC 1K05785菌株的最適培養(yǎng)基及生長形態(tài)

MCCC 1K05785在2216E固體培養(yǎng)基上生長狀態(tài)最佳，在其余幾種培養(yǎng)基下生長狀態(tài)見表1。其中，+++表示生長狀態(tài)良好，++表示生長狀態(tài)較好，+表示生長狀態(tài)不佳，—表示不生長。

從菌株出現(xiàn)至完全成熟時間約為5～7 d，生長初期菌落呈橙紅色，表面干燥不透明，單菌落呈圓形且面積較小，見圖1A。菌株在倒置生物顯微鏡的40倍物鏡下的形態(tài)見圖1B，菌株沿纖細的菌絲體分散生長。

MCCC 1K05785在SEM下的形態(tài)見圖2。觀察到小單胞菌菌株單個孢子直徑約為400 μm，孢子表面光滑或有突起，菌絲體細長，細密纏繞形成孢子。

2.2 MCCC 1K05785菌株的生長曲線

MCCC 1K05785的生長曲線見圖3。菌株呈典型指數(shù)生長特征。菌株的生長遲緩期為0～60 h；菌株的對數(shù)生長期為60～108 h，108 h之后菌株進入生長穩(wěn)定期及衰亡期。

2.3 MCCC 1K05785菌株的藥敏實驗

采用10類15種抗生素藥敏紙片進行實驗，結果見表2。MCCC 1K05785對β-內酰胺類藥物：氨芐西林，磺胺類藥物：磺胺甲惡唑，利福霉素類藥物：利福平，氯霉素類藥物：氯霉素，糖肽類藥物：萬古霉素，大環(huán)內酯類藥物：紅霉素表達耐藥性；對四環(huán)素中度敏感。

2.4 MCCC 1K05785菌株的基因組組分分析

2.4.1 MCCC 1K05785基因組信息

菌株經原始數(shù)據(jù)處理及組裝后，得到菌株基因組相關信息，見表3。全基因組數(shù)據(jù)NMDC60046431已經存儲在國家微生物科學數(shù)據(jù)中心（NMDC），鏈接為https：//nmdc.cn/resource/genomics/genome/detail/NMDC60046431。

2.4.2 MCCC 1K05785基因島預測

細菌的基因島是參與水平轉移并具有功能的，長度在10～200 kb左右的基因序列的集合。耐藥性基因島可以使細菌攜帶耐藥蛋白表達耐藥性，有助于細菌適應環(huán)境。使用軟件IslandViewer 4中的IslandPath-DIMOB預測并篩選得到菌株的14個基因島。注釋到3個基因島上含有N-乙酰轉移酶家族（GNAT family N-acetyltransferase），該家族可以調節(jié)蛋白質乙?；瘜е旅敢种茝亩咕昃哂心退幮?。此外，還注釋到1個基因島上含有TetR/AcrR family transcriptional regulator，該家族過表達外排泵能力賦予菌株多重耐藥性[23]。其可視化結果如圖4所示。

2.4.3 MCCC 1K05785蛋白編碼基因功能注釋

利用預測得到的基因序列與GO、KEGG、eggNOG、Swiss-Prot、TrEMBL等通用功能數(shù)據(jù)庫做BLAST v2.2.29比對，得到的基因功能注釋統(tǒng)計結果見表4。

GO數(shù)據(jù)庫用于預測生物功能，包括：細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）。菌株基因組GO功能注釋分類統(tǒng)計圖見圖5，藍色部分為CC、紅色部分為MF、綠色部分為BP。結果表明，CC類中基因主要負責細胞膜生成，MF類中基因主要負責完成催化反應，BP類中共有9類基因得到注釋，占比前三位分別為代謝過程（metabolic process）、細胞過程（cellular process）和單生物代謝過程（single-organism process）。參與代謝過程的基因有2088個，參與細胞過程的基因有1331個，參與單生物代謝過程的基因有1269個。

eggNOG數(shù)據(jù)庫注釋結果見圖6，圖中橫坐標為eggNOG各分類內容，縱坐標為相應功能基因數(shù)目所占相對含量。結果表明，注釋到的5089個基因分布于23個類別中。其中1665個功能基因參與物質代謝，包括[C]、[E]、[F]、[G]、[H]、[I]、[P]、[Q]，在物質代謝中存在149個基因參與次生代謝產物的生物合成、運輸和分解代謝，占比為2.88%。

菌株基因組的KEGG注釋分類中一級分類共3大類，分別為：紫色代表環(huán)境因素（environmental information processing）、綠色代表新陳代謝（metabolism）、紅色代表遺傳信息處理（genetic information processing）；二級分類共48類，具體注釋情況見圖7。分析發(fā)現(xiàn)，菌株含有4個全局型代謝通路，其中共有706個基因參與代謝途徑、336個基因參與次生代謝產物的生物合成、224個基因參與不同環(huán)境中的微生物代謝、294個基因參與抗生素的生物合成。在環(huán)境因素中基因主要負責ABC轉運，新陳代謝中基因參與數(shù)量占比前三位的是：碳代謝、氨基酸的生物合成和嘌呤代謝，遺傳信息處理中基因負責核糖體合成。參與抗生素的生物合成的基因數(shù)量占總體注釋基因的16.94%，其中有19條代謝通路參與合成鏈霉素、有12條代謝通路參與合成安莎霉素、有10條代謝通路參與合成萬古霉素、有5條代謝通路參與合成四環(huán)素、有4條代謝通路參與合成新生霉素、有3條代謝通路參與合成井崗霉素。

對MCCC 1K05785菌株繪制基因組圈圖，見圖8。圖中最外圈表示基因組大?。坏?圈和第3圈分別是基因組正鏈和負鏈上的基因大??；第4圈是重復序列；第5圈中藍色是tRNA、紫色是rRNA；第6圈是GC含量；最里圈為GC-skew，深灰色表示G含量大于C，紅色表示C含量大于G。

2.4.4 MCCC 1K05785次級代謝產物合成基因簇分析

使用軟件antiSMASH v5.0.0鑒定和分析MCCC 1K05785中的BGCs結果見表5。共預測到23個次級代謝產物BGCs，基因簇總長度為1075266 bp，其中合成二氮喹霉素H/J（Diazaquinomycin H/Diazaquinomycin J）的同源性為94%，合成利福霉素（Rifamycin）的同源性為35%。

2.4.5 耐藥相關蛋白序列的注釋

TCDB數(shù)據(jù)庫共注釋到1347個轉運蛋白，其一級分類家族包括386個ATP結合盒轉運蛋白超家族（ATP binding cassette，ABC）、69個主要協(xié)同轉運蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS）和3個多重耐藥轉運VanZ家族。耐藥蛋白具體為：氯霉素耐藥蛋白、Bcr/CflA耐藥轉運蛋白、EmrB/QacA耐藥轉運蛋白、VanZ耐藥轉運蛋白、柔紅霉素抗性ATP結合蛋白DrrA和替瑞霉素C（TcmC）耐藥蛋白。注釋統(tǒng)計結果見表6，表中耐藥蛋白綜合比對得分均在280以上。

SwissProt數(shù)據(jù)庫注釋到了MCCC 1K05785菌株含有10種耐藥蛋白，分別為：多重耐藥蛋白：Mmr、EmrB、MdtL、Stp；氯霉素耐藥蛋白CmlR、四環(huán)素耐藥蛋白TetA和萬古霉素耐藥蛋白VanB。具體結果見表7。

與上述藥敏實驗結果對比發(fā)現(xiàn)，氯霉素耐藥蛋白使菌株對氯霉素表達耐藥性。VanZ家族和耐藥蛋白VanB使菌株對糖肽類抗生素如萬古霉素產生耐藥性。Bcr/CflA家族耐藥轉運蛋白的表達使菌株對磺胺類藥物產生具有耐藥性[24]。Mmr蛋白和TetA蛋白作用于外排泵使菌株對大環(huán)內酯類和四環(huán)素類抗生素產生耐藥性。

3 討論

小單孢菌屬是具有巨大潛力的抗生素產生菌，其產生的化合物多具有抗真菌、抗細菌、抗腫瘤等活性。Iznaga等[25]描述分離自土壤的放線菌具有顯著的抗真菌活性，其中的小單孢菌多產生大環(huán)內酯類抗生素。Schulze等[26]提到小單孢菌屬可以產生利福霉素的異構體：Isorifamycin S，抑制枯草芽孢桿菌的生長。經過全基因組測序和藥敏實驗發(fā)現(xiàn)，MCCC 1K05785菌株不僅具有多種BGCs，可以潛在合成多種抗生素，另外菌株還對6類抗生素產生耐藥性。證明該菌株耐藥性豐富，其耐藥性產生機制值得深入挖掘。

微生物對抗生素的耐藥機理復雜且多樣，包括形成滅活酶、改變靶位基因、細胞膜滲透性變化或孔蛋白孔徑變窄、外排泵機制清空細菌體內藥物等[27]。

作為產生抗生素的細菌，它們一般存在著多重耐藥機理，以保證自己能夠在生成抗菌化合物的環(huán)境下繼續(xù)生存。本研究中藥敏實驗結果發(fā)現(xiàn)MCCC 1K05785菌株對6類抗生素產生耐藥性，分別為：β-內酰胺類、大環(huán)內酯類、糖肽類、磺胺類、利福霉素類和氯霉素類。大環(huán)內酯類抗生素的耐藥機制通過兩種方式降低藥物親和力而導致藥物失效：

①細菌可以修飾核糖體，從而降低藥物的親和力；②由于細菌膜的滲透性發(fā)生改變或是表達了外排泵機制，導致大環(huán)內酯類抗生素從細菌中流出。細菌對糖肽類抗生素的耐藥機制根據(jù)菌株的耐藥蛋白對細胞壁合成過程中五肽末端修飾結構的不同，主要分為D-Ala-D-Lac和D-Ala-D-Ser兩種類型，耐藥蛋白包括VanA、VanB、VanN和VanZ等，防止抗生素對細菌細胞壁的合成產生干擾[28]。氯霉素類抗生素的耐藥機制有2種，包括通過基因調控合成乙?；D移酶使氯霉素轉化為無抑菌活性的代謝產物或是通過位于細菌內膜的Cml等耐藥蛋白主動泵出顯著減少氯霉素的含量[29]。藥物泵出系統(tǒng)主要由四種家族組成：主要協(xié)同轉運蛋白超家族（MFS家族）、RND家族、小多重耐藥家族（SMR家族）和ATP結合盒轉運蛋白超家族（ABC家族）[30]。在MCCC 1K05785菌株中共注釋到3個外排泵家族與其耐藥性形成有關，分別為ABC家族、MFS家族和SMR家族。耐藥蛋白Cml、VanZ和VanB、Mmr和TetA分別使菌株對氯霉素、萬古霉素、紅霉素和四環(huán)素產生耐藥性。Bcr/CflA家族和EmrB/QacA亞家族的多重耐藥蛋白和調控細胞膜結構的SMR家族同時賦予了MCCC 1K05785菌株豐富耐藥性。此外，該菌株還具有博來霉素耐藥蛋白、柔紅霉素耐藥蛋白和替曲霉素C耐藥蛋白，推測菌株會對博來霉素、蒽環(huán)類抗生素如柔紅霉素以及替曲霉素產生耐藥性。通過分析MCCC 1K05785菌株的全基因組測序結果，發(fā)現(xiàn)該菌株具有多種耐藥性的主要原因可能是藥物外排泵的過量表達。

研究MCCC 1K05785菌株的代謝產物發(fā)現(xiàn)，KEGG數(shù)據(jù)庫中參與合成抗生素的基因占全部注釋基因的16.94%，菌株潛在合成的抗生素有：四環(huán)素、鏈霉素、萬古霉素、新生霉素、安莎霉素、井崗霉素等。微生物的BGCs包括三類：非核糖體肽合酶（NRPs）、聚酮合酶（PKS）、核糖體合成肽與翻譯后修飾肽（RiPP），其中NRPs和PKS主要負責合成抗生素[31]。對菌株的BGCs分析發(fā)現(xiàn)，MCCC 1K05785菌株是合成DAQ-H、DAQ-J的潛在來源，它們來源于海洋小單胞菌Micromonospora sp. B006[32]，其抗菌作用遠超普通抗生素[33]；菌株還含有作用于細胞RNA聚合酶的利福霉素BGCs[34]和作用于細胞DNA的卡里霉素BGCs[35]。其他BGCs多與不同種類抗生素合成有關，包括萘啶霉素、阿奇霉素A等[36]。此外，MCCC 1K05785另外存在8個尚未被預測的基因簇，說明其具有合成新穎次級代謝產物的潛力。

4 結論

MCCC 1K05785菌株為革蘭陽性菌，分離自海洋近岸沉積物，屬于青銅小單胞菌種，菌株基絲纖細呈橙紅色，孢子表面光滑或有突起。藥敏實驗表明菌株對6類抗生素具有耐藥性。對該菌株的全基因組進行測序結果表明，基因組總長度為6861996 bp，含有一個Scaffold序列，GC含量為72.79%，共預測到6136個基因。進一步分析發(fā)現(xiàn)，MCCC 1K05785菌株含有豐富的耐藥蛋白，蛋白編碼基因表達菌株耐藥性，其耐藥機制以外排泵為主；菌株具有合成抗生素或新穎次級代謝產物的潛力，為后續(xù)對青銅小單胞菌自抗性機制的研究提供了新方向。

參 考 文 獻

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