摘要：目的" 探究堿基錯(cuò)配修復(fù)基因Mutyh在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（ROP）中的潛在作用。方法" 取Mutyh敲除小鼠和野生型小鼠，構(gòu)建氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型，檢測(cè)視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激水平，觀察感光細(xì)胞及線粒體超微結(jié)構(gòu)，檢測(cè)相應(yīng)生物標(biāo)志物；體外應(yīng)用過(guò)氧化氫刺激小鼠感光細(xì)胞系661W，構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，檢測(cè)感光細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及線粒體功能。結(jié)果" Mutyh在小鼠氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型及661W氧化應(yīng)激模型中表達(dá)量升高，Mutyh動(dòng)物敲除和細(xì)胞敲減實(shí)驗(yàn)均顯示感光細(xì)胞和線粒體損傷加重，而體外過(guò)表達(dá)Mutyh能夠修復(fù)感光細(xì)胞和線粒體損傷。結(jié)論" Mutyh有潛力成為ROP的生物標(biāo)志物，通過(guò)提升Mutyh的表達(dá)，可能對(duì)ROP發(fā)揮治療作用。

關(guān)鍵詞：早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變；氧化應(yīng)激；氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變；感光細(xì)胞；Mutyh

中圖分類(lèi)號(hào)： R722.6" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A" 文章編號(hào)：1000-503X（2024）06-0862-10

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.16032

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金青年基金（BK20200151）和南京市衛(wèi)生科技發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目一般性課題（YKK22158）

Role of Mutyh in Oxidative Stress Damage in Retinopathy of Prematurity

LI Huijuan1，TANG Jie2，CHENG Rui1

1Department of Neonatology，2Department of Neonatal Surgery，Children’s Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210000，China

Corresponding author：CHENG Rui" Tel：025-83117500，E-mail：chengrui350@163.com

ABSTRACT：Objective" To explore the role of the base mismatch repair gene Mutyh in retinopathy of prematurity（ROP）.Methods" Mutyh（-/-）and wild-type（WT）mice were used for the modeling of oxygen-induced retinopathy.The retinal oxidative stress was examined，and the ultrastructures of photoreceptors and mitochondria were observed.The biomarkers of photoreceptors and mitochondria were tested.Furthermore，the photoreceptor cell line 661W was treated with hydrogen peroxide for the modeling of oxidative stress.In the cell model，and the oxidative stress and photoreceptor functions in the cells were measured.Results" In both the mouse and cell models，the expression of Mutyh was up-regulated.Mutyh knockout in mice and knockdown in cells exerted negative effects on photoreceptors and mitochondria.Mutyh overexpression showed protective functions in the cell model，indicating that Mutyh played a role in repairing photoreceptors and mitochondria.Conclusions" Mutyh showed the potential to become a biomarker of ROP.Increasing Mutyh expression might have therapeutic effects on ROP，which needs further validation.

Key words：retinopathy of prematurity；oxidative stress；oxygen-induced retinopathy；photoreceptor；Mutyh

Acta Acad Med Sin，2024，46（6）：862-871

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（retinopathy of prematurity，ROP）是發(fā)生于早產(chǎn)和低出生體重兒的視網(wǎng)膜血管增生性疾病［1］，是可以預(yù)防的嬰幼兒最常見(jiàn)的致盲和致低視力眼?。?］。除血管病變外，感光細(xì)胞損傷也是ROP領(lǐng)域不容忽視的方向［3］。氧化應(yīng)激是ROP重要的損傷機(jī)制之一，感光細(xì)胞因其多種特性而容易受到氧化應(yīng)激攻擊產(chǎn)生損傷［3］。早產(chǎn)兒氧化應(yīng)激水平可以作為ROP的預(yù)測(cè)因子，且ROP的病變程度隨氧化應(yīng)激嚴(yán)重程度升高而加重［4］。有研究表明ROP患兒外周血和尿液的DNA氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-羥基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）較未發(fā)生ROP的早產(chǎn)兒明顯升高，提示ROP患兒體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高［5］。

氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA損傷的主要形式之一是鳥(niǎo)嘌呤（guanine，G）被氧化為8-氧鳥(niǎo)嘌呤（8-oxoG），8-oxoG進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成8-OHdG。G應(yīng)與胞嘧啶（cytosine，C）配對(duì)，當(dāng)G被氧化生成8-oxoG后，只能與腺嘌呤（adenine，A）配對(duì)，A進(jìn)而與胸腺嘧啶（thymine，T）配對(duì)，導(dǎo)致堿基錯(cuò)配，基因突變［6］。MUTYH是人堿基錯(cuò)配切除修復(fù)系統(tǒng)的重要成員，其編碼的糖基化酶負(fù)責(zé)將與8-oxoG配對(duì)的A切除，阻止堿基錯(cuò)配的進(jìn)一步發(fā)生，從而減輕DNA氧化應(yīng)激損傷［6］。當(dāng)人MUTYH或小鼠Mutyh不能充分發(fā)揮作用時(shí)，DNA易受到氧化應(yīng)激損傷而發(fā)生堿基錯(cuò)配。MUTYH或Mutyh發(fā)生突變或拷貝數(shù)下降等已被證明與多種腫瘤及腸息肉發(fā)生相關(guān)［7］，但其在ROP的發(fā)生發(fā)展，以及感光細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷中是否發(fā)揮作用尚不明確。本研究旨在應(yīng)用Mutyh敲除（Mutyh-/-）小鼠，構(gòu)建氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變（oxygen-induced retinopathy，OIR）模型，同時(shí)利用過(guò)氧化氫刺激感光細(xì)胞系661W構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，探討Mutyh對(duì)ROP發(fā)生發(fā)展和感光細(xì)胞的影響。

1" 材料和方法

1.1" 材料

8-OHdG單克隆抗體（IM-MOG110523E）購(gòu)自日本JalCA研究所。引物（Mutyh 正向引物：5’-TGCCACCTGTGTTGTGGAGC-3’，反向引物：5’-TGTGCTGATGCTGTTCTGAGGG-3’；視紫紅質(zhì)正向引物：5’-TGCCCTTCTCCAACGTCACAG-3’，反向引物：5’-AGGGCGATTTCACCTCCAAGT-3’；細(xì)胞色素c氧化酶第I亞基正向引物：5’-TTGGTCCCCTCCTCCAGC-3’，反向引物：5’-CCAGTGCTAGCCGCAGGCA-3’；細(xì)胞色素b正向引物：5’-GCCACCTTGACCCGATTCT-3’，反向引物：5’-TTGCTAGGGCCGCGATAAT-3’；β-actin正向引物：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，反向引物：5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’）購(gòu)自北京擎科生物科技股份有限公司。RNA提取試劑盒（RC112-01）、高特異性染料法定量PCR檢測(cè)試劑盒（Q131-02/03）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047Q）購(gòu)自日本Takara公司。661W細(xì)胞購(gòu)自浙江明舟生物科技公司。DMEM高糖培養(yǎng)基（PM1502 10）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。過(guò)氧化氫（7722-84-1）購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司。LipofectamineTM 3000（L3000015）購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司。Mutyh過(guò)表達(dá)、敲減（shRNA）以及空載質(zhì)粒購(gòu)自武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司。8-OHdG ELISA試劑盒（ab201734）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。ATP檢測(cè)試劑盒（S0026）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。

1.2" 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡Mutyh（-/-）C57BL/6小鼠來(lái)源于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2021-0001］，6～8周齡野生型C57BL/6小鼠購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中［SYXK（蘇）2018-0020］。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審批。

1.2.2" 動(dòng)物模型構(gòu)建及分組

取6～8周齡Mutyh（-/-）C57BL/6和野生型C57BL/6飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中。根據(jù)經(jīng)典小鼠OIR模型構(gòu)建方法［8］，取出生后第7天（postnatal 7，P7）新生鼠，與乳鼠共同置于高氧實(shí)驗(yàn)箱中5 d（P7～P12），然后置于常氧環(huán)境（氧濃度21%）中繼續(xù)飼養(yǎng)5 d（P12～P17），構(gòu)建OIR模型。設(shè)立以下4組動(dòng)物：野生型常氧組、野生型OIR組、Mutyh（-/-）常氧組及Mutyh（-/-）OIR組，每組18只。6只用于視網(wǎng)膜8-OHdG免疫組織化學(xué)染色，6只用于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞及線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察，6只用于視網(wǎng)膜實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定感光細(xì)胞及線粒體標(biāo)志分子。

1.2.3" 視網(wǎng)膜8-OHdG免疫組織化學(xué)染色

取P17小鼠，多聚甲醛心臟灌注后獲取眼球，將眼球浸入眼球固定液固定，依次進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、封閉、8-OHdG一抗以及二抗孵育、3，3’-二氨基聯(lián)苯胺顯色、復(fù)染細(xì)胞核等步驟，最終在顯微鏡下觀察拍照。每組隨機(jī)選取4張圖片，應(yīng)用Image J圖像軟件定量分析8-OHdG含量，采用單因素方差分析進(jìn)行4組之間的比較，多組間兩兩比較采用LSD法。

1.2.4" 視網(wǎng)膜感光細(xì)胞及線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

取P17小鼠，戊二醛灌注后取視網(wǎng)膜，制備電子顯微鏡標(biāo)本，于透射電子顯微鏡下觀察感光細(xì)胞和內(nèi)部線粒體的數(shù)目、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等。

1.2.5" 視網(wǎng)膜實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定感光細(xì)胞及線粒體標(biāo)志分子

取P17小鼠，生理鹽水灌注后取視網(wǎng)膜，采用RNA提取試劑盒從視網(wǎng)膜組織勻漿中提取總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)感光細(xì)胞標(biāo)志物視紫紅質(zhì)以及線粒體標(biāo)志物，即線粒體編碼的細(xì)胞色素c氧化酶第I亞基（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COX Ⅰ）和細(xì)胞色素b（cytochrome b，Cytb）的mRNA表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3" 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1" 感光細(xì)胞661W氧化應(yīng)激模型構(gòu)建、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組

Muyth過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、敲減質(zhì)粒及空載質(zhì)粒由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成。轉(zhuǎn)染前接種并培養(yǎng)661W細(xì)胞，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)匯合度達(dá)到70%～90%；使用Opti-MEMTM培養(yǎng)基稀釋LipofectamineTM 3000并充分混勻；使用Opti-MEMTM稀釋質(zhì)粒DNA制備預(yù)混液，然后添加P3000TM并充分混勻；在每管已稀釋的LipofectamineTM 3000中加入質(zhì)粒DNA預(yù)混液，制備質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物；將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細(xì)胞中；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。根據(jù)經(jīng)典方法，予1 mmol/L 過(guò)氧化氫刺激661W細(xì)胞12 h，建立氧化應(yīng)激模型［9-10］。設(shè)立過(guò)氧化氫+空載質(zhì)粒組、過(guò)氧化氫+Mutyh過(guò)表達(dá)組及過(guò)氧化氫+Mutyh敲減組。

1.3.2" 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定661W線粒體標(biāo)志分子

取各組細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)COX I和Cytb的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3" 感光細(xì)胞8-OHdG及ATP測(cè)定

取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞8-OHdG含量；按照ATP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組細(xì)胞ATP含量：吸除培養(yǎng)基，加入裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 g離心5 min后取上清液，利用ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，配置ATP工作液加入上清液中，應(yīng)用發(fā)光檢測(cè)儀［普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司］測(cè)定數(shù)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ATP產(chǎn)量。

1.4" 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)Shapiro-Wilk法明確符合正態(tài)分布后，方差齊性的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD法。雙側(cè)Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2" 結(jié)果

2.1" 小鼠視網(wǎng)膜8-OHdG免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

野生型OIR組較野生型常氧組小鼠視網(wǎng)膜8-OHdG平均光密度值顯著升高（P=0.001），Mutyh（-/-）OIR組8-OHdG較Mutyh（-/-）常氧組顯著升高（P=0.005），Mutyh（-/-）常氧組較野生型常氧組顯著升高（Plt;0.001），Mutyh（-/-）OIR組較野生型OIR組顯著升高（Plt;0.001）（圖1）。

2.2" 感光細(xì)胞及線粒體形態(tài)變化

野生型常氧組感光細(xì)胞的膜盤(pán)層狀結(jié)構(gòu)正常，野生型OIR組膜盤(pán)層狀結(jié)構(gòu)松散、紊亂、減少，Mutyh（-/-）常氧組膜盤(pán)層狀結(jié)構(gòu)變性、減少，Mutyh（-/-）OIR組膜盤(pán)層狀結(jié)構(gòu)寬大、松散、紊亂（圖2）。野生型常氧組感光細(xì)胞線粒體形態(tài)正常；野生型OIR組感光細(xì)胞出現(xiàn)線粒體空泡化；Mutyh（-/-）常氧組線粒體基質(zhì)不均，結(jié)構(gòu)致密，嵴局部斷裂；Mutyh（-/-）OIR組線粒體基質(zhì)不均，嵴局部缺失、蜷曲、膜隆起或破損，局部空泡化（圖3）。野生型OIR組感光細(xì)胞的外核層中細(xì)胞核分布相對(duì)稀疏，體積小于Mutyh（-/-）OIR組，胞質(zhì)大多均勻，個(gè)別細(xì)胞核周?chē)[；Mutyh（-/-）OIR組感光細(xì)胞的外核層中細(xì)胞核數(shù)量多，周?chē)|(zhì)水腫區(qū)相對(duì)較大，呈低電子密度區(qū)；野生型OIR組感光細(xì)胞的內(nèi)節(jié)層胞質(zhì)輕度水腫，線粒體整體損傷程度較低，個(gè)別線粒體基質(zhì)不均，嵴局部斷裂缺失，胞內(nèi)存在部分細(xì)胞器空泡；Mutyh（-/-）OIR組感光細(xì)胞的內(nèi)節(jié)層胞質(zhì)均勻，線粒體少部分基質(zhì)均勻，較多線粒體損傷嚴(yán)重，基質(zhì)不均，嵴局部缺失、蜷曲、膜隆起或破損，局部空泡化，Mutyh（-/-）OIR組線粒體損傷程度較野生型OIR組更高；野生型OIR組感光細(xì)胞的外節(jié)層膜盤(pán)結(jié)構(gòu)存在輕度或中度損傷，損傷較輕者結(jié)構(gòu)尚可，層狀結(jié)構(gòu)排列整齊、較致密，損傷重者局部結(jié)構(gòu)松散、變性，線粒體結(jié)構(gòu)尚可，基質(zhì)均勻，嵴排列整齊；Mutyh（-/-）OIR組感光細(xì)胞的外節(jié)層的膜盤(pán)結(jié)構(gòu)損傷較重，層狀結(jié)構(gòu)松散、紊亂、變性、減少（圖4）。

2.3" 感光細(xì)胞及線粒體標(biāo)志物變化

野生型OIR組視網(wǎng)膜Mutyh表達(dá)量較野生型常氧組顯著升高（P=0.023）（圖5A）；野生型OIR及Mu-tyh（-/-）常氧組視網(wǎng)膜的視紫紅質(zhì)表達(dá)量較野生型常氧組均顯著升高（P=0.049，P＜0.001），Mutyh（-/-）OIR較Mutyh（-/-）常氧組的視紫紅質(zhì)表達(dá)量顯著升高（P=0.014）（圖5B）；野生型 OIR組及Mutyh（-/-）常氧組視網(wǎng)膜線粒體編碼的COX Ⅰ表達(dá)量較野生型常

氧組均顯著降低（P=0.010，P=0.003），Mutyh（-/-）OIR組較Mutyh（-/-）常氧組的COX Ⅰ表達(dá)量顯著降低（P=0.029）（圖5C）；野生型OIR組及Mutyh（-/-）常氧組視網(wǎng)膜的Cytb表達(dá)量較野生型常氧組均顯著降低（P=0.048，P=0.009），Mutyh（-/-）OIR組較Mutyh（-/-）常氧組的Cytb表達(dá)量顯著降低（P=0.003）（圖5D）。

2.4" 661W細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建及驗(yàn)證

過(guò)氧化氫組661W細(xì)胞的Mutyh表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高（P=0.033）；COX Ⅰ及Cytb表達(dá)量較對(duì)照組均顯著降低（P=0.042，P=0.011）（圖6）。

2.5" Mutyh過(guò)表達(dá)及敲減對(duì)661W細(xì)胞線粒體和氧化應(yīng)激水平的影響

在正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的對(duì)照組，Mutyh過(guò)表達(dá)和敲減未對(duì)COX Ⅰ和Cytb的表達(dá)產(chǎn)生影響，在培養(yǎng)基中加入了過(guò)氧化氫的過(guò)氧化氫組，Mutyh過(guò)表達(dá)減輕了線粒體損傷，表現(xiàn)為COX Ⅰ和Cytb較空載質(zhì)粒組均顯著上升（P=0.017，P=0.040），而Mutyh敲減加劇了線粒體損傷，表現(xiàn)為COX Ⅰ和Cytb較空載質(zhì)粒組均顯著下降（P=0.047，P=0.030），Mutyh過(guò)表達(dá)相比敲減組，對(duì)線粒體發(fā)揮了顯著的保護(hù)性作用，表現(xiàn)為COX Ⅰ和Cytb表達(dá)水平的顯著升高（Plt;0.001，P=0.001）（圖7A、7B）；在正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的對(duì)照組，Mutyh敲減組與空載質(zhì)粒組和過(guò)表達(dá)組相比，ATP產(chǎn)量顯著下降（P均lt;0.001），在氧化應(yīng)激條件下，Mutyh敲減組與空載質(zhì)粒組和過(guò)表達(dá)組相比，ATP產(chǎn)量均顯著下降（P均lt;0.001），過(guò)表達(dá)組ATP較空載質(zhì)粒組顯著上升（P=0.012）（圖7C）；在正常培養(yǎng)條件下，Mutyh敲減組與空載質(zhì)粒組和過(guò)表達(dá)組相比，8-OHdG含量均顯著上升（P=0.006，P=0.004），在氧化應(yīng)激條件下，Mutyh敲減組與空載質(zhì)粒組和過(guò)表達(dá)組相比，8-OHdG含量均顯著上升（P=0.026，P=0.003），過(guò)表達(dá)組8-OHdG較空載質(zhì)粒組有下降的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.169）（圖7D）。

3" 討論

ROP是早產(chǎn)兒常見(jiàn)并發(fā)癥之一［2］。我國(guó)多中心臨床研究表明，在胎齡lt;28周或出生體重lt;1000 g的早產(chǎn)兒中，ROP發(fā)病率超過(guò)50%，重癥ROP的發(fā)病率接近10%［11］。隨著三胎政策的落實(shí)，早產(chǎn)和低出生體重兒特別是極/超早產(chǎn)兒，極/超低出生體重兒的比例升高［12］，ROP的防治必將成為更加重要的議題。

氧化應(yīng)激是ROP最重要的損傷機(jī)制之一［4，13］。早產(chǎn)兒從宮內(nèi)的低氧環(huán)境被迫提前進(jìn)入出生后的相對(duì)高氧環(huán)境，經(jīng)歷高濃度氧氣復(fù)蘇以及生命支持，加上早產(chǎn)兒抗氧化系統(tǒng)建立尚未成熟，導(dǎo)致早產(chǎn)兒暴露于氧化應(yīng)激的環(huán)境中［14］。早產(chǎn)兒氧化應(yīng)激水平可以作為ROP的預(yù)測(cè)因子，且ROP的嚴(yán)重程度隨氧化應(yīng)激嚴(yán)重程度升高而加重［4］。8-oxoG是G氧化應(yīng)激的直接產(chǎn)物，8-氧-7，8-二氫-2’-脫氧鳥(niǎo)苷和8-OHdG是8-oxoG的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，8-OHdG是目前最常用的DNA氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物［15］。薈萃分析顯示，ROP等眾多新生兒常見(jiàn)并發(fā)癥如支氣管、肺發(fā)育不良等［16］均與氧化應(yīng)激相關(guān)，在這些研究中，普遍應(yīng)用8-OHdG作為氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物［13］。既往研究表明，ROP患兒外周血和尿液的8-OHdG較未發(fā)生ROP早產(chǎn)兒顯著升高，提示ROP患兒體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高［5］。

G應(yīng)與C配對(duì)，當(dāng)G被氧化生成8-oxoG后，與A發(fā)生錯(cuò)配，A進(jìn)而在之后的復(fù)制中與T配對(duì)。因此，當(dāng)發(fā)生DNA氧化應(yīng)激損傷時(shí)，G轉(zhuǎn)變?yōu)?-oxoG，G-C堿基對(duì)在DNA鏈復(fù)制過(guò)程中，逐漸轉(zhuǎn)換為A-T堿基對(duì)，導(dǎo)致堿基錯(cuò)配，基因突變［6］。人MUTYH基因編碼兩種糖基化酶，Ⅰ型作用于線粒體DNA，Ⅱ型作用于細(xì)胞核DNA。該糖基化酶負(fù)責(zé)將與8-oxoG配對(duì)的A切除，阻止堿基錯(cuò)配的進(jìn)一步發(fā)生，從而減輕DNA氧化應(yīng)激損傷［17］。當(dāng)人MUTYH或鼠Mutyh因突變等不能充分發(fā)揮作用時(shí)，DNA受到氧化應(yīng)激損傷，缺乏組蛋白保護(hù)的線粒體DNA更加脆弱。MUTYH或Mutyh發(fā)生突變/拷貝數(shù)下降等，已被證實(shí)與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)［18-20］，但其在ROP的發(fā)生發(fā)展以及感光細(xì)胞的損傷中是否發(fā)揮作用尚不明確。

在ROP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，感光細(xì)胞的損傷值得重視。感光細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝最活躍的細(xì)胞，是視網(wǎng)膜數(shù)量最多的細(xì)胞，其包含的線粒體占據(jù)了視網(wǎng)膜線粒體總量的75%。有研究表明，感光細(xì)胞是視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激及促炎因子的主要來(lái)源［21］，本身對(duì)氧化應(yīng)激易感，且在ROP起病階段恰巧處于生長(zhǎng)的指數(shù)期［22］，此時(shí)無(wú)疑成為氧化應(yīng)激的重點(diǎn)打擊對(duì)象，進(jìn)入自我損傷且損傷其他細(xì)胞的惡性循環(huán)［23］，是ROP病理改變的起始事件。

有研究表明藥物或激光治療后的ROP患兒視網(wǎng)膜功能仍存在嚴(yán)重缺陷，嚴(yán)重的ROP會(huì)阻礙視網(wǎng)膜的重塑以及功能恢復(fù)，即使是不需要藥物或激光治療的ROP患兒，仍存在視網(wǎng)膜功能障礙［3］。另有研究表明，在OIR模型小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞連接纖毛出現(xiàn)組蛋白脫乙?；?過(guò)表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致連接纖毛結(jié)構(gòu)障礙，是OIR的早發(fā)事件，提示感光細(xì)胞損傷在ROP中的重要性［8］；當(dāng)阻斷組蛋白脫乙?；?時(shí)，能夠減輕感光細(xì)胞連接纖毛結(jié)構(gòu)損傷，減輕ROP相關(guān)病變，減輕視網(wǎng)膜感光細(xì)胞功能損傷［24］。

本研究表明在野生型小鼠OIR模型中，視網(wǎng)膜Mutyh的表達(dá)量顯著升高。在Mutyh（-/-）小鼠OIR模型中，感光細(xì)胞及感光細(xì)胞線粒體的氧化應(yīng)激損傷較野生型小鼠更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為超微結(jié)構(gòu)異常，以及標(biāo)志分子視紫紅質(zhì)、Cytb和COX Ⅰ的表達(dá)量降低。進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，在過(guò)氧化氫構(gòu)建的661W細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，Mutyh的表達(dá)量升高。Mutyh敲減會(huì)進(jìn)一步加劇感光細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)為氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-OHdG含量升高，ATP產(chǎn)量下降，線粒體標(biāo)志分子Cytb、COX Ⅰ的表達(dá)量降低；而Mutyh過(guò)表達(dá)則能減輕感光細(xì)胞損傷，減輕線粒體損傷，表現(xiàn)為保護(hù)性作用。

綜上，無(wú)論是在ROP動(dòng)物模型，還是在感光細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，感光細(xì)胞Mutyh均出現(xiàn)了表達(dá)量升高，且表達(dá)增多的Mutyh能夠發(fā)揮保護(hù)及修復(fù)感光細(xì)胞和線粒體的作用，提示通過(guò)提升視網(wǎng)膜局部或感光細(xì)胞的Mutyh表達(dá)，可能對(duì)ROP發(fā)揮治療作用。

利益沖突" 所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明" 李慧娟、唐杰：設(shè)計(jì)并實(shí)施實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，撰寫(xiě)論文；李慧娟：提供基金支持；程銳：指導(dǎo)研究，修改論文

參" 考" 文" 獻(xiàn)

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（收稿日期：2024-02-04）