摘 要：為評價實時熒光PCR法檢測 T 細胞受體剪切環(huán)（TREC）時，標準曲線法或自動閾值法對不同操作批次重復(fù)檢測結(jié)果穩(wěn)定性的影響，采用同一批次TREC檢測試劑盒重復(fù)檢測標準質(zhì)粒中內(nèi)參基因與靶標TREC的Ct值，同時重復(fù)檢測一組TREC低值樣本的Ct值；分別采用標準曲線法和自動閾值法對檢測結(jié)果進行分析，比較兩種分析方法得到結(jié)果（Ct值）的穩(wěn)定性。對標準質(zhì)粒和TREC低值樣本的檢測結(jié)果表明，兩種分析方法得到的Ct值與兩個靶標的標稱濃度（log10）均呈線性相關(guān)，R²為1.00。兩種方法獲得標準質(zhì)粒中內(nèi)參基因Ct平均值，標準曲線法較自動閾值法平均低1.26，標準質(zhì)粒中TREC基因Ct平均值，前者較后者平均低0.96。對TREC低值樣本重復(fù)檢測結(jié)果表明，同一樣本標準曲線法獲得的兩種靶標Ct值的變異系數(shù)（CV）和極差均低于自動閾值法。表明在以實時熒光PCR法檢測TREC靶標從而進行重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的篩查時，標準曲線法的分析結(jié)果穩(wěn)定性優(yōu)于自動閾值法。

關(guān)鍵詞：重癥聯(lián)合免疫缺陷；T細胞受體剪切環(huán)；實時熒光PCR；標準曲線

中圖分類號：Q819

文獻標志碼：A

Influence of standard curve method and automatic threshold method on the stability of TREC test results

XU Weijia， SHI Lin， ZHAO Shumin， LU Daru

（School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200433， China）

Abstract： To evaluate the effects of standard curve method or automatic threshold method on the results stability of repeated detection in different batches when real-time fluorescent PCR was used to detect T-cell receptor excision circles （TREC）. Ct values of reference gene and target TREC in standard plasmid were repeatedly detected with the same batch of TREC detection kit， and Ct values of a group of samples with low TREC value were repeatedly detected. Standard curve method and automatic threshold method were used to analyze the detection results respectively， and the stability of the results （Ct value） obtained by the two analysis methods was compared. The detection results of standard plasmid and TREC samples with low value show that the Ct values obtained by the two analysis methods were linearly correlated with the nominal concentration （log10） of the two targets， R² was 1.00. The average Ct values of reference genes in standard plasmid were obtained by the two methods. The average Ct values of TREC gene in standard plasmid using standard curve method were 1.26 lower than those using automatic threshold method， and the average Ct values of TREC gene in standard plasmid using standard curve method were 0.96 lower than those using automatic threshold method. The results of repeated detection of low-value TREC samples show that the coefficient of variation （CV） and range of Ct values of two targets obtained by standard curve method in the same sample were lower than those obtained by automatic threshold method. The findings indicate that the stability of the standard curve method was better than the automatic threshold method when the TREC target was detected by real-time fluorescent PCR for screening severe combined immunodeficiency （SCID）.

Key words： severe combined immunodeficiency （SCID）; T-cell receptor excision circles （TREC）; real-time fluorescent PCR; standard curve

在T細胞成熟過程中，每產(chǎn)生一種T細胞受體（TCR），均伴隨一個TCR剪切環(huán)（TREC）的形成，且TREC不隨細胞的分裂而復(fù)制［1-2］。因此，TREC檢測（TREC assay）被廣泛應(yīng)用于T細胞缺陷相關(guān)的新生兒先天性重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的篩查［2-4］。在T細胞缺陷相關(guān)的SCID中，由于T細胞成熟障礙， TCR受體形成受阻，在新生兒血樣中往往無法檢出足量的TREC［3，5］。目前已有相應(yīng)的商品化TREC檢測試劑盒，如PE公司的EnLiteTM Neonatal TREC Kit ［6］，ThermoFisher公司的TaqManTM SCID/SMA Plus 測定試劑盒［7］，但學(xué)界在TREC的量綱以及檢測技術(shù)方法等諸多方面仍存在爭議。如KWOK等［8］探討了TREC檢測中，兩種不同量綱（copies/μL、copies/106cells）的合理性。在方法學(xué)上，EnLiteTM Neonatal TREC Kit對待檢樣本中內(nèi)參基因和TREC同時進行絕對定量的方法，并以copies/105 cells為量綱進行結(jié)果報告［9］；而TaqManTM SCID/SMA Plus 測定試劑盒是以定性方式進行結(jié)果報告，即以TREC無法檢出作為陽性結(jié)果［10］。國內(nèi)亦有公司開發(fā)了基于多重實時熒光定量PCR的TREC試劑盒。對于大部分基于實時熒光PCR平臺的IVD產(chǎn)品，例如SARS-COV-2檢測試劑盒，檢測中是以擴增信號陽性作為臨床陽性結(jié)果，當Ct值大于35時判為陰性；而SCID的檢測與此相反，患兒通常存在TREC缺失，則在實時熒光PCR檢測時以加入足夠擴增模板的情況下Ct值仍大于35作為陽性結(jié)果［11］。因此，對TREC檢驗結(jié)果進行判斷時，不同的分析方案（如使用標準曲線法，或采用熒光PCR儀的自動閾值分析法）對最終檢測結(jié)果判定的影響可能將無法忽略。在本研究中，采用一種TREC檢測試劑盒，評估了在基于實時熒光PCR平臺的TREC檢測中，兩種不同分析方案對標準質(zhì)粒以及TREC低值樣本檢驗結(jié)果的穩(wěn)定性，以期為TREC在新生兒SCID篩查的方法學(xué)構(gòu)建提供一定借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

試劑采用TREC-KREC 聯(lián)合檢測試劑盒（實時熒光定量PCR法）（上海晶準生物醫(yī)藥有限公司），儀器選取實時熒光定量PCR儀（ThermoFisher Scientific Inc.，型號Applied Biosystems^TM 7500）。

1.2 實驗方案

1.2.1 標準品質(zhì)粒的制備及檢測方案

該試劑盒包含一個內(nèi)參基因與TREC拷貝比為1∶1的標準質(zhì)粒。依據(jù)質(zhì)粒的質(zhì)量濃度和分子量，將標準品質(zhì)粒稀釋至2×10⁷ copies/μL，并命名為S7。將S7和水按1∶10的比例進行梯度稀釋，分別稀釋至2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³和2×10² copies/μL，依次命名為S6、S5、S4、S3、S2，每個PCR反應(yīng)加入1 μL標準質(zhì)粒。各梯度標準質(zhì)粒均進行3個技術(shù)重復(fù)，4個實驗批次，6個標準品質(zhì)粒濃度梯度共計可測得72個檢測數(shù)據(jù)。

1.2.2 低值樣本制備及檢測方案

本研究所涉及的TREC低值樣本信息與檢測方案見表1。其中TL1人組織樣本DNA中不含TREC，而TL2成年志愿者外周血DNA中的TREC水平低于試劑盒標示的最低檢出限，二者均與標準品質(zhì)粒稀釋液S2進行混合，制備成終質(zhì)量濃度為100 ng/μL TREC低值樣本。剩余4例樣本所用的成年人志愿者外周血DNA均已進行TREC定量檢測，根據(jù)TREC檢測值分別使用人組織樣本DNA進行稀釋，制備成終質(zhì)量濃度為100 ng/μL的TREC中低值樣本。制備完成的6例樣本DNA質(zhì)量濃度均為100 ng/μL，以保證每例樣本檢測中，內(nèi)參基因定量結(jié)果基本一致。依據(jù)產(chǎn)品說明書，每個PCR反應(yīng)起始模板量為200 ng，按1 ng基因組DNA約150個細胞［12］，則每個PCR反應(yīng)中的內(nèi)參基因的理論值約為6×10⁴拷貝/反應(yīng)。每次測試都設(shè)置空白對照，空白對照每次上機做3個技術(shù)重復(fù)。

1.3 獲得Ct值

1.3.1 標準曲線法

以S2至S7共6個梯度的質(zhì)粒樣本作為標準品，使用軟件Real-Time PCR Software v2.4構(gòu)建標準曲線。水平閾值線設(shè)定在標準曲線的決定系數(shù)R²為1.000且空白對照（H₂O）的Ct值大于35或無信號，由此得到樣本TL1～TL6的Ct值，記作Ct-SC?；€的設(shè)置采用AUTO模式。

1.3.2 自動閾值法

將S2至S7共6個梯度的質(zhì)粒樣本與樣本TL1～TL6均作為待測樣本，水平閾值線、基線范圍設(shè)置均采用熒光定量PCR儀的自動分析模式，此時得到的各檢測樣本的Ct值記作Ct-AUTO。自動分析模式下，NTC（H₂O）的Ct值均大于35或無信號。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 標準質(zhì)粒檢測結(jié)果分析

分別計算標準質(zhì)粒在標準曲線法和自動閾值法下獲得的Ct值的均值與標準差，采用GraphPad Prism（版本號8.0.2.263）對兩種分析方法得到的Ct值與各標準質(zhì)粒的標稱濃度作線性相關(guān)分析，得到兩種分析方法下的擴增標準曲線，根據(jù)標準曲線計算相應(yīng)的擴增效率。

1.4.2 TREC低值樣本檢測結(jié)果的穩(wěn)定性分析

分別計算每個TREC低值樣本在4個操作批次共20次測量中，兩種分析方法得到的內(nèi)參基因與TREC的Ct值的變異系數(shù)（CV），并計算各樣本根據(jù)兩種分析方法得到的4個操作批間Ct值的極差。

2 實驗結(jié)果

2.1 兩種分析方法得到的標準品質(zhì)粒樣本的檢測結(jié)果

各標準質(zhì)粒的Ct-SC與Ct-AUTO的均值（AVE）、標準差（SD）與變異系數(shù)（CV）見表2、表3。對于內(nèi)參基因IR，各標準質(zhì)粒的Ct-AUTO相較Ct-SC平均增加1.26；對于TREC，各標準質(zhì)粒的Ct-AUTO相較Ct-SC平均增加0.96。依據(jù)表2、表3，分別獲得標準曲線法與自動閾值法分析模式下的擴增標準曲線（圖1）。依據(jù)擴增標準曲線斜率，計算內(nèi)參基因在標準曲線法和自動分析模式下的擴增效率分別為100.5%和100.1%，TREC的擴增效率分別為100.1%和99.3%，高濃度標準品S7起始模板量2×107 拷貝/反應(yīng)及低濃度標準品S2起始模板量2×10² 拷貝/反應(yīng)均在正常擴增范圍內(nèi)。

2.2 不同分析方法對低值樣本Ct值CV影響

6例TREC低值樣本，每例樣本各20次測量，兩種靶標測量結(jié)果（以Ct值表示）的CV見圖2。

兩種不同的分析方案，同一樣本、兩種靶標、不同分析方法、操作批間的Ct值CV均＜5%，這一結(jié)果符合我國對實時熒光定量PCR檢測試劑盒穩(wěn)定性的基本要求［13-14］。標準曲線分析模式下內(nèi)參基因IR的Ct值的CV均小于1%，在AUTO模式下內(nèi)參基因IR的Ct值的CV均介于2%～3%之間，各樣本中，相同靶標，標準曲線法獲得的Ct值CV均小于自動閾值法獲得Ct值的CV。

2.3 不同分析方法對Ct值變化的影響

TL1～TL6樣本各20次測量，不同分析方法對兩種靶標Ct值測量結(jié)果的影響見表4和圖3。對內(nèi)參基因IR，SC分析模式下，各樣本不同操作批間均值的極差介于0.33～0.46之間；AUTO分析模式下，各樣本不同操作批間均值的極差介于1.42～1.62之間。對于靶標TREC，SC分析模式下，各樣本不同操作批間均值的極差介于0.44～1.18之間；AUTO分析模式下，各樣本不同操作批間均值的極差介于2.15～3.03之間。

3 討論

實時熒光 PCR 技術(shù)因其操作簡便、成本低廉，而被廣泛應(yīng)用于臨床診斷試劑盒的開發(fā)［15-17］，采用這一技術(shù)方案所開發(fā)的試劑盒，依據(jù)其檢測目的分為定量檢測和定性檢測兩大類［18］。以病毒核酸的檢測，如2019-nCoV的核酸定性檢測為例，由于病毒核酸相對于感染宿主為外源核酸［19］，在定性檢測時通常以Ct值小于35為陽性［11］；在定量檢測時則需要制備相應(yīng)的標準曲線，如HBV［20］、HCV［21］以及甲型與乙型流感病毒［12］的定量檢測，通過標準曲線對病毒核酸的拷貝數(shù)進行絕對定量［18］。

研究表明，TREC作為一種游離于基因組DNA之外的內(nèi)源核酸靶標，在SCID的篩查中具有重要的應(yīng)用價值［3，8，22-23］。但與病毒等外源核酸以檢出靶核酸信號作為陽性判斷結(jié)果不同，在新生兒樣本中，當TREC含量極低或無TREC信號時，代表可能患有T細胞缺陷相關(guān)的SCID［3，5，24］。這對基于實時熒光定量PCR法的TREC檢測的靈敏度與穩(wěn)定性提出了更高的要求，因為熒光擴增信號陰性既與反應(yīng)體系中是否加入足夠的待測模板有關(guān)，又與熒光擴增信號的判斷，尤其是水平閾值線的確定方法密切相關(guān)，對于擴增信號處于臨界水平的樣本更是如此。

本研究首先以梯度稀釋的標準品質(zhì)粒評價了一種TREC檢測試劑盒的線性范圍以及對內(nèi)參基因IR和TREC的擴增效率。結(jié)果顯示這一實時熒光定量檢測系統(tǒng)，在標準曲線法以及自動水平閾值分析模式下，標準質(zhì)粒的內(nèi)參基因IR與靶基因TREC的擴增效率無顯著差異。無論是對IR還是TREC，自動閾值法得到的Ct均值大于標準曲線法得到的Ct均值。Ct值的增加意味著對相應(yīng)靶標定量結(jié)果的低估，對最終定性結(jié)果可能存在影響。

為進一步評價不同分析方法對實際樣本檢測結(jié)果的影響，采用成年志愿者外周血DNA以及人組織DNA與低值標準品質(zhì)粒稀釋液模擬了TREC的低值樣本，通過技術(shù)重復(fù)與操作批間重復(fù)，比較了標準曲線法與自動閾值法兩種分析方案對檢測結(jié)果穩(wěn)定性的影響。兩種分析方案下，各樣本內(nèi)參基因IR與靶基因TREC的Ct值的CV均滿足我國對實時熒光定量PCR檢測試劑盒穩(wěn)定性的基本要求［13-14］。但IR靶標和TREC靶標的同一樣本由標準曲線法得到結(jié)果的CV均小于由自動閾值法得到結(jié)果的CV，且不同樣本初始模板量（均為200 ng/反應(yīng)）相同，不同樣本的內(nèi)參基因IR的檢測結(jié)果理論值應(yīng)相同，標準曲線分析模式下內(nèi)參基因IR的Ct值的CV均小于AUTO模式下的CV，這種分析結(jié)果的差異唯一影響因素是分析方法，反映出不同分析方法對檢測結(jié)果穩(wěn)定性的影響。

為進一步研究分析方法對操作批間穩(wěn)定性的影響，比較了同一樣本不同操作批間不同分析方案得到的Ct值均值的極差的變化，不論是內(nèi)參基因IR還是靶基因TREC，SC分析模式下得到結(jié)果的極差均小于AUTO分析模式下結(jié)果的極差。對于內(nèi)參基因IR的Ct值，AUTO分析模式下的極差介于1.42～1.62之間，由于內(nèi)參基因IR是用于標定加入反應(yīng)體系中的細胞數(shù)量，這一結(jié)果表明，即使是同一樣本，AUTO分析模式下不同的操作批間獲得的細胞數(shù)量的標定結(jié)果也將相差2～3倍。而對于TREC的Ct值，AUTO分析模式下的極差介于2.15～3.03之間，每差一個Ct值代表PCR相差一個擴增循環(huán)，基因拷貝數(shù)會呈倍數(shù)變化，這表明即使是對于同一樣本，AUTO分析模式下不同的操作批間靶基因的定量（拷貝數(shù)）也將相差4～8倍。更重要的是，對于TREC低值樣本，AUTO分析模式下的這樣的批間差，將可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明，對于類似TREC的內(nèi)源基因組以外的靶基因的檢測，以擴增信號陰性作為陽性判斷結(jié)果時，配備標準曲線，通過標準曲線確定擴增熒光信號的水平閾值線，對檢測結(jié)果的判斷是必要的，有利于降低假陽性結(jié)果的發(fā)生。

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