【摘 要】目的：探索豐富環(huán)境（environmental enrichment，EE）干預(yù)對缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）幼鼠神經(jīng)功能、腦室旁白質(zhì)及海馬髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法：取7 d SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組+標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組（HIBD+SE組）及模型組+豐富環(huán)境組（HIBD+EE組），采用Rice-Vannucci法制備HIBD模型。Sham組及HIBD+SE組不予任何干預(yù)飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，HIBD+EE組于術(shù)后8 d至術(shù)后18 d予以豐富環(huán)境干預(yù)處理。術(shù)后18 d采用Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)測定平臺(tái)區(qū)穿梭次數(shù)，采用Western blot檢測腦室旁白質(zhì)及海馬區(qū)髓鞘生成相關(guān)蛋白尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶8（recombinant UDP glycosyltransferase 8，UGT8）、少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2（oligodendrocyte transcription factor 2，OLIG2）的表達(dá)，采用RT-qPCR檢測腦室旁白質(zhì)及海馬區(qū)UGT8、OLIG2、糖脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glycolipid transfer protein，GLTP）、髓鞘轉(zhuǎn)錄因子（myelinregulatory factor Gene，MYRF）的表達(dá)水平，采用免疫組化法檢測神經(jīng)元核（neuronal nuclei antigen，NeuN）表達(dá)水平，采用免疫熒光檢測胼胝體髓鞘標(biāo)志（myelin basic protein，MBP）表達(dá)水平。結(jié)果：術(shù)后18 d，與HIBD+SE組比較，HIBD+EE組穿越平臺(tái)次數(shù)增多（Plt;0.01），HIBD+EE組較HIBD+SE組腦室旁白質(zhì)及海馬區(qū)UGT8 mRNA及蛋白表達(dá)升高（Plt;0.05），腦室周圍白質(zhì)及海馬區(qū)OLIG2、GLTP、MYRF mRNA表達(dá)升高（Plt;0.05），海馬CA1區(qū)NeuN表達(dá)水平高于HIBD+SE組（Plt;0.05），胼胝體MBP平均熒光強(qiáng)度高于HIBD+SE組（Plt;0.05）。結(jié)論：豐富環(huán)境能促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系分化、髓鞘發(fā)育，改善學(xué)習(xí)記憶能力，可能與上調(diào)腦室周圍白質(zhì)及海馬區(qū)UGT8蛋白表達(dá)，增加神經(jīng)元分化成熟細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】豐富環(huán)境；腦白質(zhì)損傷；空間記憶能力

【中圖分類號(hào)】R72 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-01-08

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemicbrain damage，HIBD）是圍產(chǎn)期新生兒因?qū)m內(nèi)缺氧、分娩時(shí)（或）出生后缺氧和腦血流減少（或）暫停所引起的神經(jīng)功能障礙的腦部疾病，進(jìn)而對兒童神經(jīng)發(fā)育造成不良遠(yuǎn)期結(jié)局[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，患兒生存率升高，只有約60%的患兒能在新生兒期存活，約30%的患兒會(huì)出現(xiàn)長期神經(jīng)功能障礙，對兒童自身、家庭、社會(huì)造成不良影響[1-2]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，少突膠質(zhì)細(xì)胞生成髓鞘后包裹軸突，促進(jìn)動(dòng)作電位的快速傳播和相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能。髓鞘生成障礙會(huì)損傷神經(jīng)傳導(dǎo)和認(rèn)知運(yùn)動(dòng)功能，將導(dǎo)致各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦室周圍白質(zhì)軟化等[3]。海馬與白質(zhì)是神經(jīng)突觸、髓鞘富集的部位，且易受缺氧缺血的影響，導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞系分化、成熟障礙，髓鞘發(fā)育障礙，進(jìn)而影響神經(jīng)功能。豐富環(huán)境（environmental enrichment，EE）指將動(dòng)物飼養(yǎng)在空間較大、動(dòng)物數(shù)量較多的環(huán)境中，內(nèi)置多種物體而創(chuàng)造新奇感，并每日更換以保持新奇感，能提供較多的感官刺激和運(yùn)動(dòng)機(jī)會(huì)[4]。而標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境的空間較小，動(dòng)物數(shù)量相對較少，且不設(shè)任何物體。EE是一種結(jié)合體育活動(dòng)、社會(huì)互動(dòng)和持續(xù)探索學(xué)習(xí)的綜合體，以非侵入性的方式豐富大腦中的運(yùn)動(dòng)、感覺和認(rèn)知來刺激大腦，調(diào)節(jié)大腦可塑性，進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及功能，其在一定程度可以解釋基因和環(huán)境之間的相互作用，這種影響甚至可以貫穿整個(gè)生命周期[5]。研究已發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境能促進(jìn)大腦的發(fā)育，增加大腦的大小和重量，且證實(shí)其可調(diào)節(jié)缺氧缺血腦損傷后神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)因子、細(xì)胞及認(rèn)知行為學(xué)的變化，改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能[5-6]。

因此，本研究通過制備幼鼠HIBD模型，檢測豐富環(huán)境干預(yù)后大鼠神經(jīng)功能、尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶8（recombinant UDP glycosyltransferase 8，UGT8）蛋白及少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系分化生成少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2（oligodendrocyte transcription factor 2，OLIG2）、糖脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glycolipid transfer protein，GLTP）、髓鞘轉(zhuǎn)錄因子（myelin regulatory factor gene，MYRF）表達(dá)的變化，海馬區(qū)成熟神經(jīng)元相關(guān)神經(jīng)元核（neuronal nuclei antigen，NeuN）表達(dá)水平，胼胝體髓鞘標(biāo)志（myelin basic protein，MBP）表達(dá)水平，旨在探索豐富環(huán)境干預(yù)對髓鞘發(fā)育及神經(jīng)功能的影響，為HIBD所致各種神經(jīng)發(fā)育性殘疾患兒早期豐富環(huán)境干預(yù)策略的制定提供可能的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)Sprague-Dawley孕鼠（孕21 d，由重慶恩斯維爾生物科技有限公司提供）飼養(yǎng)至分娩，幼鼠全部成活。于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)至7 d齡后，進(jìn)行數(shù)字編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為Sham組（n=24）、模型組+標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組（HIBD+SE組）（n=24）及模型組+豐富環(huán)境組（HIBD+EE組）（n=24）。整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照國際動(dòng)物保護(hù)和使用指南的規(guī)定進(jìn)行。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

UGT8（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，17982-1-AP）；OLIG2、GAPDH、β-actin、山羊抗兔二抗（成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司，R380740，R24404，700068，511203）；GAPDH、UGT8、OLIG2、GLTP、MYRF microRNA 引物（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒、SYBRGreen Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR 試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，貨號(hào)：AG11728）、Au11702；NeuN（Abcam公司，貨號(hào)：ab177487）；MBP（Abcam公司，貨號(hào)：ab209328）。

1.3 動(dòng)物模型制備：HIBD模型制備

Sham 組、HIBD+SE 組及HIBD+EE 組均采用Rice Van?nucci法[7]制備HIBD模型：將7 d齡SD大鼠吸入異氟烷麻醉后，固定于操作臺(tái)上，常規(guī)酒精消毒頸部皮膚后，于頸部左側(cè)頸總動(dòng)脈處切口，游離左側(cè)頸總動(dòng)脈并行雙層永久性結(jié)扎，縫合切口，回籠中休息1 h后置于37 ℃恒溫加熱墊上的密閉常壓低氧艙內(nèi)，給予8%氮氧混合氣（8%氧氣、92%氮?dú)猓? h。幼鼠模型制備結(jié)束后放回母鼠籠中母乳哺喂。缺氧后可以觀察到明顯運(yùn)動(dòng)障礙。根據(jù)Bederson標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分[8]判斷模型建造成功，即幼鼠麻醉恢復(fù)后神經(jīng)行為評(píng)分在1分及以上則視為造模成功。Sham組、HIBD+SE組及HIBD+EE組均造模成功。Sham組僅進(jìn)行異氟烷麻醉后頸部切開、左側(cè)頸動(dòng)脈分離并縫合切口，不作結(jié)扎和缺氧處理，而后放回母鼠籠中母乳喂養(yǎng)。Sham組、HIBD+SE組及HIBD+EE組均造模成功。新生大鼠術(shù)后均未使用抗生素，所有組新生大鼠全部存活。

1.4 豐富環(huán)境的設(shè)計(jì)及干預(yù)

1.4.1 豐富環(huán)境的設(shè)計(jì) 參照Ismail TR 等[4]研究定制長50 cm、寬50 cm、高25 cm的半透明聚乙烯豐富環(huán)境籠盒，其中放置水、食物、墊料以及各種“玩具”，例如不同形狀、顏色、大小的塑料球、滾輪、通道、木制或塑料旋轉(zhuǎn)圓盤、秋千、橋、梯子、房子、毛球、鈴鐺、碗、杯子等，每天更換物品位置或形狀，每2 d更換一次豐富環(huán)境干預(yù)物品并清理籠內(nèi)衛(wèi)生。

1.4.2 豐富環(huán)境干預(yù)方法 HIBD+SE組：Sham組和HIBD+SE 組缺氧后置于無特殊刺激的標(biāo)準(zhǔn)籠中（長40 cm× 高20 cm×寬30 cm）飼養(yǎng)，僅放置墊料、食物和水，定期換籠。予以同等條件抓取，自由進(jìn)食、進(jìn)水，保持環(huán)境清潔。HIBD+EE組：缺氧后置于無特殊刺激的標(biāo)準(zhǔn)籠中飼養(yǎng)，予以同等條件抓取，自由進(jìn)食、進(jìn)水，術(shù)后8 d開始予以豐富環(huán)境干預(yù)，全天置于定制豐富環(huán)境籠盒中飼養(yǎng)，予以同等條件抓取，自由進(jìn)食、進(jìn)水，保持環(huán)境清潔。每2 d更換豐富環(huán)境干預(yù)物品時(shí)，交換HIBD+SE組與HIBD+EE組母鼠，全程母乳喂養(yǎng)至21 d斷奶，取出母鼠分籠飼養(yǎng)。兩種飼養(yǎng)環(huán)境均提供相同的晝夜變化，室溫（23±2） ℃。豐富環(huán)境干預(yù)從生后15 d持續(xù)至生后25 d。

1.5 取材及冰凍切片制備

于造模后18 d，將幼鼠經(jīng)：0.2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg），常規(guī)消毒，剪開胸腔，充分暴露心臟，將灌注針從左心室進(jìn)入并推至主動(dòng)脈口處，剪開右心耳，依次勻速灌注100 mL PBS溶液及4%多聚甲醛溶液。灌注結(jié)束后，快速斷頭取腦，分離腦組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定。常規(guī)用包埋劑包埋，制作8～15 μm厚度的冰凍切片備用。

1.6 Morris水迷宮試驗(yàn)

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)使用直徑為150 cm的Morris水迷宮，由圓形水池、圖像自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)組成。計(jì)算機(jī)將圓形水池均分為4個(gè)象限，平臺(tái)放于第4象限，距水面1～2 cm，此象限為平臺(tái)象限，并用外置攝像頭同步跟蹤定位大鼠游行軌跡，計(jì)算機(jī)記錄并計(jì)時(shí)，水溫維持在（23±1） ℃，測試時(shí)避光，保持環(huán)境安靜。利用Morris水迷宮設(shè)備及分析軟件進(jìn)行分析，檢測各組大鼠的空間記憶能力。將幼鼠于Morris水迷宮入水點(diǎn)放入水中，系統(tǒng)即開始自動(dòng)記錄大鼠尋找隱藏平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。每日按順序依次在4個(gè)象限進(jìn)行試驗(yàn)，每次試驗(yàn)間隔30 min，連續(xù)5 d，并計(jì)算每日的平均逃避潛伏期。若受試大鼠在60 s內(nèi)未找到隱藏平臺(tái)，則引導(dǎo)其登上平臺(tái)停留15 s后放回，并將逃避潛伏期記為60 s。第6 d，去掉平臺(tái)，分別在平臺(tái)對側(cè)象限及平臺(tái)象限進(jìn)行試驗(yàn)，自由游行60 s，記錄平臺(tái)區(qū)域穿越次數(shù)。

1.7 Western blot檢測

于建模后18 d，予以：0.2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg），剪開胸腔，充分暴露心臟，將灌注針從左心室進(jìn)入并推至主動(dòng)脈口處，剪開右心耳，勻速灌注100 mL PBS 溶液。灌注結(jié)束后，快速斷頭取腦，參照Paxi-nos-Watson圖譜，分離左側(cè)海馬及左側(cè)腦室旁白質(zhì)，凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。?0 mg腦組織中加入100 μL強(qiáng)效裂解液，于冰上用超聲勻漿機(jī)研磨后4 ℃離心10 min（12 000 r/min，r=8 cm），取上清，采用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）測定蛋白濃度，調(diào)整上樣量。剩余樣品以樣品量：上樣緩沖液=4∶1比例混勻，金屬浴100 ℃蒸煮10 min，冷卻后置于-80 ℃冰箱保存。取50 μg樣品蛋白，以常規(guī)方法完成十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜上。室溫下快速封閉液封閉15 min，加入U(xiǎn)GT8抗體（1∶1 500）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；規(guī)格：50 μL/瓶；貨號(hào)：17982-1-AP）、OLIG2抗體（1∶1 000）（成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司；規(guī)格：20 μL/瓶；貨號(hào)：R380740）4 ℃搖床過夜孵育，加入對應(yīng)二抗（1∶10 000）（成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司；規(guī)格：100 μL/瓶；貨號(hào)：511203）室溫?fù)u床孵育1.5 h。將PVDF膜置于圖像掃描儀上，避光配制顯影液并覆蓋PVDF膜，曝光顯影，顯影圖像以Image J分析系統(tǒng)處理并分析。將目的條帶灰度值與內(nèi)參基因條帶灰度值比值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 RT-PCR

收集各組腦組織后使用RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，并測定濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。UGT8引物序列：上游引物：AGCAAACAATCCTAACACCCTCA，下游引物：GGTTCACTGCCAACTTTCTGC；OLIG2：上游引物：AAAGGTGTGGATGCTTAACAGAGAC，下游引物：CCGGAGACGATCTAGGCTTTC；GLTP：上游引物：ACACCTCACCCAGCAAAGAA，下游引物：CGCCTCCATTGTCCTTCAAAC；MYRF：上游引物：TGGCACTCCCTTCCTCTCTT，下游引物：ACGCTCTATGAACACGCAGG。GAPDH引物序列：上游引物：GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG，下游引物：ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA。使用SYBR Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR 試劑盒Ⅱ進(jìn)行檢測。PCR 反應(yīng)體系（10 μL）：2XSYBR Green Pro Taq HS Premix Ⅱ25 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，Total RNA 2 μL，RNaseFree dH2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。引物序列由湖南艾科瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)。

1.9 免疫組化檢測

冰凍切片烘干，加入3% H2O2溶液阻斷活內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加一抗（NeuN，1∶200），4 ℃過夜（陰性對照滴加PBS 溶液）；隔日室溫下復(fù)溫，滴加生物素化二抗工作液，37 ℃孵育10～15 min，而后滴加辣根酶標(biāo)記10～15 min；以DAB顯色，蘇木素復(fù)染，分化、返藍(lán)、脫水、封片后掃描。光鏡下觀察NeuN陽性細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色。通過Image J圖像分析軟件進(jìn)行平均光密度（mean optical density，MOD）分析，隨機(jī)選取每只大鼠3張海馬切片，在400倍光學(xué)顯微鏡下，觀察海馬CA1區(qū)NeuN表達(dá)情況，每張選取5個(gè)不重復(fù)視野，記錄MOD值，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.10 免疫熒光

獲取腦組織，多聚甲醛低溫固定，30%蔗糖沉降脫水，OCT包埋后冰凍切片機(jī)里切片；將切片放于EDTA抗原修復(fù)液中加熱，隨后置于PBS中洗滌3次，5 min/次；使用免化筆畫圓圈包圍組織，滴加牛血清白蛋白，室溫下封閉35 min；甩掉封閉液，切片上滴加用PBS 稀釋的Anti-MBP（Abcam，1∶200稀釋），放入濕盒內(nèi)，冰箱中孵育12 h以上；加二抗和細(xì)胞核染色，PBS洗滌3次，6 min/次；加對應(yīng)的二抗和DAPI染液，室溫下避光孵育60 min；PBS洗滌3次，6 min/次，滴加自發(fā)熒光淬滅劑，靜置6 min，然后沖洗9 min；抗熒光淬滅后封片。共聚焦熒光顯微鏡下采集圖像；導(dǎo)出圖像后利用ImageJ 軟件進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Graphpad Prism 8.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）形式表達(dá)，非正態(tài)計(jì)量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）即[Md（P25，P75）]表示。多組間采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey的多重比較檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 豐富環(huán)境干預(yù)后HIBD幼鼠的神經(jīng)功能的影響

Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組大鼠的逃避潛伏期總體隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而縮短，且經(jīng)過訓(xùn)練，第5 dHIBD+EE組的逃避潛伏期較HIBD+SE組有所縮短，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組第6 d 去掉平臺(tái)后試驗(yàn)，結(jié)果顯示HIBD+SE組較Sham組穿越平臺(tái)次數(shù)減少（P=0.006），HIBD+EE組較HIBD+SE組穿越平臺(tái)次數(shù)增多（P=0.000）（圖1）。

2.2 豐富環(huán)境干預(yù)后HIBD幼鼠腦室旁白質(zhì)及海馬區(qū)UGT8蛋白及mRNA的表達(dá)

Western blot檢測UGT8結(jié)果顯示，在病灶側(cè)（左側(cè)）腦室旁白質(zhì)及海馬組織中，HIBD+SE組明顯低于Sham組（海馬P=0.015，腦室旁白質(zhì)P=0.041），HIBD+EE 組明顯高于HIBD+SE組（海馬P=0.024，腦室旁白質(zhì)P=0.016），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

檢測UGT8 在腦室旁白質(zhì)及海馬區(qū)UGT8 基因表達(dá)水平，采用RT-qPCR 檢測UGT8 mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果顯示HIBD+SE 組UGT8 mRNA 表達(dá)水平低于Sham 組（海馬Plt;0.001，腦室旁白質(zhì)P=0.001），HIBD+EE 組高于HIBD+SE 組（海馬P=0.048，腦室旁白質(zhì)P=0.049），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

2.3 豐富環(huán)境干預(yù)后HIBD幼鼠海馬CA1區(qū)NeuN的表達(dá)

免疫組化檢測海馬CA1區(qū)NeuN的表達(dá)，結(jié)果顯示，光鏡下觀察NeuN陽性細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色，紅色方框?yàn)榉糯蟛糠?。與Sham 組比較，HIBD+SE 組海馬CA1 區(qū)NeuN表達(dá)降低（P=0.019），HIBD+EE 組NeuN 表達(dá)水平高于HIBD+SE組（P=0.026），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

2.4 豐富環(huán)境干預(yù)后HIBD幼鼠腦室旁白質(zhì)及海馬區(qū)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化關(guān)鍵基因表達(dá)的變化

檢測神經(jīng)元細(xì)胞增加的具體細(xì)胞類型，采用RT-PCR檢測髓鞘形成過程中的關(guān)鍵基因OLIG2、MYRF、GLTP mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，3組之間GLTP mRNA表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Plt;0.05），HIBD+SE組腦室旁白質(zhì)及海馬區(qū)GLTPmRNA表達(dá)水平低于Sham組（海馬Plt;0.001，腦室旁白質(zhì)Plt;0.001），HIBD+EE組GLTP mRNA表達(dá)水平均高于HIBD+SE組（海馬P=0.038，腦室旁白質(zhì)P=0.047）。HIBD+SE 組腦室旁白質(zhì)及海馬區(qū)MYRF（海馬P=0.002，腦室旁白質(zhì)Plt;0.001）、OLIG2（海馬P=0.000，腦室旁白質(zhì)P=0.004） mRNA表達(dá)水平均低于Sham組，HIBD+EE組MYRF（海馬P=0.010，腦室旁白質(zhì)P=0.036）、OLIG2（海馬P=0.027，腦室旁白質(zhì)P=0.026）mRNA表達(dá)均高于HIBD+SE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。

2.5 豐富環(huán)境干預(yù)后HIBD 幼鼠腦室旁白質(zhì)及海馬區(qū)OLIG2蛋白表達(dá)的變化

Western blot檢測OLIG2結(jié)果顯示，HIBD+SE 組腦室旁白質(zhì)及海馬區(qū)OLIG2表達(dá)水平低于Sham組（海馬P=0.002，腦室旁白質(zhì)P=0.029），HIBD+EE組OLIG2蛋白表達(dá)水平高于HIBD+SE組（海馬P=0.048，腦室旁白質(zhì)P=0.004），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

2.6 豐富環(huán)境干預(yù)后HIBD幼鼠胼胝體區(qū)MBP蛋白表達(dá)的變化

通過免疫熒光檢測胼胝體區(qū)MBP蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，MBP蛋白呈紅色熒光，與Sham組比較，HIBD+SE組胼胝體區(qū)MBP蛋白表達(dá)降低（Plt;0.001），HIBD+EE組胼胝體區(qū)MBP蛋白表達(dá)水平高于HIBD+SE組（P=0.022），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7）。

3 討論

對于缺氧缺血性腦損傷，目前沒有統(tǒng)一規(guī)范的治療方案，因此探究其發(fā)病機(jī)制為治療途徑提供更多理論依據(jù)是近年來的研究重點(diǎn)，是一個(gè)重要的兒童公共健康問題。缺氧缺血性腦損傷會(huì)導(dǎo)致腦白質(zhì)及灰質(zhì)缺血缺氧，少突膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元軸突電傳導(dǎo)密切相關(guān)，在神經(jīng)突觸傳遞密集的白質(zhì)中及與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的海馬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中富集。而少突膠質(zhì)前體細(xì)胞對缺氧缺血損傷的易感性高，是主要的損傷細(xì)胞，導(dǎo)致髓鞘脫失誘發(fā)神經(jīng)軸索變性[9]，同時(shí)有星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，小膠質(zhì)細(xì)胞活化，導(dǎo)致髓鞘化障礙、腦室擴(kuò)大、神經(jīng)功能發(fā)育障礙等，進(jìn)而影響遠(yuǎn)期發(fā)育結(jié)局[10]。豐富環(huán)境是一種重要的實(shí)驗(yàn)范式，它在一定程度上解釋環(huán)境與基因的相互影響，進(jìn)而改變大腦結(jié)構(gòu)和功能，這種影響甚至可以貫穿整個(gè)生命，乃至遺傳[5]。它具有非侵入性、低風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)點(diǎn)，具有一定臨床可操作性。目前許多關(guān)于豐富環(huán)境的研究表明，豐富環(huán)境可以促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)生、緩解炎癥、增加小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用等[11-12]，但其對髓鞘發(fā)育及突觸可塑性的作用機(jī)制研究尚不完全清楚。

本研究通過建立HIBD動(dòng)物模型進(jìn)行豐富環(huán)境干預(yù)，HIBD+EE組在空間和內(nèi)部設(shè)置上可以提供豐富的刺激來源，包括感官、運(yùn)動(dòng)和社交刺激。而HIBD+SE組空間狹小，各種感官刺激和活動(dòng)非常有限，群體成員少，社交機(jī)會(huì)遭到剝奪。因此豐富環(huán)境干預(yù)會(huì)促使腦缺氧缺血幼鼠出現(xiàn)髓鞘的修復(fù)和記憶功能的改善。結(jié)合Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，HIBD可損傷幼鼠與海馬密切相關(guān)的空間記憶功能，而豐富環(huán)境確實(shí)改善了HIBD幼鼠所損害的空間記憶功能，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[12-13]。NeuN是成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物[14]，可以反映成熟神經(jīng)元數(shù)量，NeuN還參與神經(jīng)發(fā)生和突觸發(fā)生[15]，而學(xué)習(xí)記憶功能本質(zhì)與突觸可塑性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[16]。本研究中免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HIBD+EE 組海馬CA1 區(qū)NeuN表達(dá)高于HIBD+SE組，該結(jié)果提示豐富環(huán)境可增加海馬CA1區(qū)成熟神經(jīng)元數(shù)量，提示HIBD幼鼠空間記憶功能的恢復(fù)可能與海馬區(qū)成熟神經(jīng)元數(shù)量的增加以及突觸發(fā)生密切相關(guān)。

少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成的起源。髓鞘調(diào)節(jié)因子（myelin regulatory factor，MYRF）是調(diào)控突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）和髓鞘形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[17]。在本研究中，HIBD+SE 組MYRF mRNA 以及MBP 表達(dá)水平的下降。DuncanGJ等[18]同樣在脫髓鞘動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)MYRF 的表達(dá)降低，導(dǎo)致髓鞘形成減少。Emery B等[19]也證實(shí)，MYRF基因敲除后，OPCs可以分化到髓鞘形成前狀態(tài)，但無法繼續(xù)發(fā)育并發(fā)生凋亡。因此，MYRF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。在本研究中，發(fā)現(xiàn)EE可以通過提高M(jìn)YRF的mRNA表達(dá)水平來減少HIBD對髓鞘形成的影響，從而確保EE可以觸發(fā)OPCs分化，從而促進(jìn)髓鞘的形成。

髓鞘中富含脂質(zhì)，這些脂質(zhì)對髓鞘的形成至關(guān)重要。任何導(dǎo)致脂質(zhì)含量改變的干擾都會(huì)阻礙髓鞘的發(fā)育。包括CERS 2、SPLTC 2、UGT8 和GLTP在內(nèi)的酶對鞘脂代謝和髓鞘的維持至關(guān)重要[20]。其中，GLTP在運(yùn)輸髓鞘發(fā)育所必需的脂質(zhì)中起著關(guān)鍵作用[21]。GLTP不僅介導(dǎo)脂質(zhì)合成，還會(huì)促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞形成髓鞘。在本研究中，HIBD+SE 組UGT8、GLTP以及MBP表達(dá)水平下降。之前的研究發(fā)現(xiàn)UGT8敲除的小鼠表現(xiàn)為低髓鞘化[22]，與本研究結(jié)果一致。相比之下，HIBD+EE組顯示UGT8和GLTP以及MBP表達(dá)水平的增加，這表明EE可以挽救HIBD造成的損傷，并通過促進(jìn)這些基因的表達(dá)增強(qiáng)來維持髓鞘形成。

在其他各種腦損傷的模型的研究中，豐富環(huán)境可能通過某種調(diào)控因子促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，進(jìn)而促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞再生成熟，髓鞘發(fā)育及神經(jīng)功能的恢復(fù)[6，23]；同時(shí)，可能通過某些途徑減輕神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷[6]，或調(diào)控某些神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，例如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等，調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡與自噬[5，24-25]，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活等多種途徑提高了神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量。然而，這些從體外到體內(nèi)的具體調(diào)控機(jī)制及調(diào)控因子的研究目前尚不完善，還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究。本課題組將以此繼續(xù)深入研究。此外，本實(shí)驗(yàn)缺乏對動(dòng)物腦組織大體的進(jìn)一步分析，以及干預(yù)過程中腦血流量的監(jiān)測。

綜上所述，豐富環(huán)境可改善HIBD后的空間記憶功能，并通過某種或多種途徑增加神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)一步促進(jìn)OLIG2、MYRF、GLTP、UGT8的表達(dá)，增加髓磷脂膜可塑性所需的蛋白合成，促進(jìn)髓鞘生成，改善神經(jīng)功能。另外，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，本研究僅處于初步探討階段，將在后續(xù)試驗(yàn)中將繼續(xù)完善。

參考文獻(xiàn)

[1] Min YJ，Ling EG，Li F. Immunomodulatory mechanism and poten?

tial therapies for perinatal hypoxic-ischemic brain damage[J]. Front

Pharmacol，2020，11：580428．

[2] Zhao J，He L，Yin LL. lncRNA NEAT1 binds to miR-339-5p to in?

crease HOXA1 and alleviate ischemic brain damage in neonatal mice[J].

Mol Ther Nucleic Acids，2020，20：117-127．

[3] Liu ZX，Yan MB，Liang YJ，et al. Nucleoporin Seh1 interacts with

Olig2/Brd7 to promote oligodendrocyte differentiation and myelination

[J]. Neuron，2019，102（3）：587-601.

[4] Ismail TR，Yap CG，Naidu R，et al. Enrichment protocol for rat

models[J]. Curr Protoc，2021，1（6）：e152．

[5] Kempermann G. Environmental enrichment，new neurons and the

neurobiology of individuality[J]. Nat Rev Neurosci，2019，20（4）：

235-245．

[6] Thamizhoviya G，Vanisree AJ. Enriched environment enhances the

myelin regulatory factor by mTOR signaling and protects the myelin

membrane against oxidative damage in rats exposed to chronic immobili?

zation stress[J]. Neurochem Res，2021，46（12）：3314-3324．

[7] Rice JE 3rd，Vannucci RC，Brierley JB. The influence of immatu?

rity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat[J]. Ann Neurol，1981，

9（2）：131-141．

[8] Bieber M，Gronewold J，Scharf AC，et al. Validity and reliability of

neurological scores in mice exposed to middle cerebral artery occlusion

[J]. Stroke，2019，50（10）：2875-2882．

[9] Xie Y，Zhang XH，Xu PF，et al. Aberrant oligodendroglial LDL re?

ceptor orchestrates demyelination in chronic cerebral ischemia[J]. J Clin

Invest，2021，131（1）：e128114．

[10] Schneider J，Miller SP. Preterm brain Injury：white matter injury

[J]. Handb Clin Neurol，2019，162：155-172．

[11] Harlow HF，Suomi SJ. Nature of love：simplified[J]. Am Psychol，

1970，25（2）：161-168．

[12] Ohline SM，Abraham WC. Environmental enrichment effects on

synaptic and cellular physiology of hippocampal neurons[J]. Neurophar?

macology，2019，145：3-12．

[13] Jin XH，Li T，Zhang LN，et al. Environmental enrichment im?

proves spatial learning and memory in vascular dementia rats with acti?

vation of Wnt/β-catenin signal pathway[J]. Med Sci Monit，2017，23：

207-215．

[14] Gusel’nikova VV，Korzhevskiy DE. NeuN As a neuronal nuclear

antigen and neuron differentiation marker[J]. Acta Naturae，2015，7（2）：

42-47．

[15] Wang HY，Hsieh PF，Huang DF，et al. RBFOX3/NeuN is Re?

quired for Hippocampal Circuit Balance and Function[J]. Sci Rep，

2015，5：17383．

[16] Poulos AM，Thompson RF. Localization and characterization of

an essential associative memory trace in the mammalian brain[J]. Brain

Res，2015，1621：252-259．

[17] Cahoy JD，Emery B，Kaushal A，et al. A transcriptome database

for astrocytes，neurons，and oligodendrocytes：a new resource for under?

standing brain development and function[J]. J Neurosci，2008，28（1）：

264-278．

[18] Duncan GJ，Plemel JR，Assinck P，et al. Myelin regulatory factor

drives remyelination in multiple sclerosis[J]. Acta Neuropathol，2017，

134（3）：403-422．

[19] Emery B，Agalliu D，Cahoy JD，et al. Myelin gene regulatory fac?

tor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination[J].

Cell，2009，138（1）：172-185．

[20] Davis DL，Mahawar U，Pope VS，et al. Dynamics of sphingolipids

and the serine palmitoyltransferase complex in rat oligodendrocytes dur?

ing myelination[J]. J Lipid Res，2020，61（4）：505-522．

[21] Yang F，Guan YD，F(xiàn)eng X，et al. Proteomics of the corpus callo?

sum to identify novel factors involved in hypomyelinated Niemann-Pick

Type C disease mice[J]. Mol Brain，2019，12（1）：17．

[22] Dupree JL，Suzuki K，Popko B. Galactolipids in the formation and

function of the myelin sheath[J]. Microsc Res Tech，1998，41（5）：431-

440．

[23] Forbes TA，Goldstein EZ，Dupree JL，et al. Environmental enrich?

ment ameliorates perinatal brain injury and promotes functional white

matter recovery[J]. Nat Commun，2020，11（1）：964．

[24] 苑愛云，孫向峰，侯 梅，等. 豐富環(huán)境對缺氧缺血腦損傷幼鼠

空間記憶能力及海馬區(qū)BDNF、自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)的影響[J]. 中

國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2020，35（11）：1296-1301．

Yuan AY，Sun XF，Hou M，et al. Effects of environmental enrichment on

the expressions of brain-derived neurotrophic factor and microtubuleassociated

protein 1 light chain 3 type in the hippocampus of immature

rats with hypoxic-ischemic brain damage[J]. Chin J Rehabil Med，2020，

35（11）：1296-1301．

[25] 宋名楊，朱路文，葉 濤，等. 豐富環(huán)境對缺血缺氧腦損傷新生

大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國康復(fù)

醫(yī)學(xué)雜志，2017，32（7）：750-755．

Song MY，Zhu LW，Ye T，et al. Effects of enriched environment inter?

vention on brain-derived neurotrophic factor expression and apoptosis

in hippocampus of hypoxic ischemic brain damaged neonatal rats[J].

Chin J Rehabil Med，2017，32（7）：750-755．

（責(zé)任編輯：周一青）