【關鍵詞】高脂飲食；胰島素抵抗；RNA m6A甲基化修飾；胰島素信號轉導通路

2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）是最常見的慢性代謝性疾病之一，困擾著人的健康和安全，嚴重影響生活質量，增加經(jīng)濟負擔[1-2]。T2DM發(fā)病主要病因是胰島素調(diào)控葡萄糖代謝能力的下降，又稱胰島素抵抗（insulin resistance，IR），同時伴隨胰島β細胞功能缺陷所導致的胰島素分泌相對減少[3-4]。其中IR是T2DM的核心機制，胰島素信號轉導異常是IR的關鍵環(huán)節(jié)[3，5-7]。因此，越來越多的研究從胰島素信號轉導通路入手，對T2DM的發(fā)病機制進行研究。

近年來，RNA的m6A甲基化修飾在IR和T2DM中的作用引起了廣泛關注。RNA的m6A甲基化修飾是一種廣泛存在于RNA上的堿基修飾行為，影響RNA 的翻譯效率、穩(wěn)定性、可變剪接、轉運和定位等[8-9]。已有文獻報道，肥胖者與健康個體相比較，不同部位組織m6A甲基化水平有差異，例如肝[10-12]、脂肪[13-14]、心臟[15-16]、空腸[17]、動脈組織[18]以及巨噬細胞[19]等。但差異趨勢因組織類型有別，其中對于m6A 甲基化修飾在脂肪組織中的作用尚不夠明確：大部分學者認為高脂組m6A 修飾整體水平升高[20-21]，但也有學者等認為，高脂飲食誘導m6A修飾降低，脂肪量和肥胖相關基因（Fat Mass andObesity-associated Protein，F(xiàn)TO）表達增加[22]?？傊?，高脂飲食誘導下，脂肪組織m6A修飾變化和具體功能尚存爭議，關于m6A修飾在胰島素敏感性中的作用尚待厘清，尤其是圍繞白色脂肪組織的胰島素抵抗，國內(nèi)外少見報道。

本研究旨在建立高脂飲食誘導的小鼠IR模型中，脂肪組織mRNA m6A 甲基化修飾圖譜；圍繞胰島素信號轉導通路，篩選并驗證發(fā)生m6A修飾的主要差異基因，并明確調(diào)控該差異基因m6A修飾的甲基轉移酶，為m6A甲基化修飾作為IR的新型診療靶點提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本納入標準及知情同意 收集2020年12月至2021年12月，因良性病變在山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（山東省千佛山醫(yī)院）就醫(yī)，且需行手術治療的患者術中贅余皮下脂肪組織樣本（5例T2DM患者，5例非T2DM 患者）。納入標準：①空腹血糖≥7.0 mmol/L；②餐后2 h血糖≥11.1mmol/L或隨機血糖≥11.1 mmol/L；③伴有糖尿病典型的“三多一少”癥狀，即多飲、多尿、多食、體質量減輕。滿足上述3點的任何2項，可納入本研究，視為患有T2DM。排除標準：①肝腎功能不全患者（血肌酐、尿素氮超過正常值范圍的1.2倍）；②擬懷孕、懷孕或哺乳期的女性；③有濫用藥物、毒品或酗酒史者；④主要臟器外科手術后未滿6周患者，手術傷口愈合不良患者；⑤有免疫缺陷病史，包括人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）檢測陽性或患有其他獲得性、先天性免疫缺陷疾病，或有器官移植史者；⑥不愿意參與實驗者。本研究符合山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（山東省千佛山醫(yī)院）倫理委員會所制定的倫理學標準，于入試前獲得患者知情同意，批準號：[2022]倫審字（S079）號。

1.1.2 實驗動物 6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2021-0006，本研究符合山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院/山東省千佛山醫(yī)院倫理委員會所制定的倫理學標準，動物倫理批準號：[2021]動倫審字（S1031）號。

1.1.3 細胞株 實驗使用細胞株為3T3-L1脂肪前體細胞，購自美國ATCC細胞庫，并由課題組于液氮中凍存保存。

1.1.4 主要試劑與耗材 基礎飼料（脂含量10% kcal）和高脂飼料（脂含量60% kcal）均購自北京科奧協(xié)力生物技術有限公司。METTL3小分子抑制劑STM2457購于Selleck Chem公司（貨號S9870）；細胞培養(yǎng)用DMEM 培養(yǎng)基、新生牛血清（newborn calf serum，NBS）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青霉素-鏈霉素、谷氨酰胺等均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；細胞誘導分化用3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤（isobutylmethylxanthine，IBMX）、胰島素、地塞米松（dexamethasone，DEX）均購自美國Sigma公司。m6A抗體購于德國Synaptic Systems公司；免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）磁珠購于美國 Med Chem Express生物科技公司；RNA 結合蛋白免疫沉淀（RNA binding proteinimmunoprecipitation assay，RIP）試劑盒購于德國默克密理博公司；RNA提取、蛋白質提取及免疫組化等相關檢測試劑均為實驗室常規(guī)用品。主要耗材，如離心管、PCR八聯(lián)管購于美國Axygen 公司；細胞培養(yǎng)皿、六孔培養(yǎng)板等購于Corning 公司；Dot blot 實驗用Hybond-N 膜購于美國GEHealthcare Systems 公司。

1.2 方法

1.2.1 T2DM患者的分組及檢測 所有納入研究的臨床標本按照納排標準，分為T2DM組和健康對照組，進行2組脂肪組織中RNA 的提取以及斑點雜交實驗（Dot Blot），分析T2DM患者脂肪組織中m6A甲基化修飾水平變化。

1.2.2 小鼠IR 模型的構建及鑒定 以6～8 周齡的雄性C57BL/6J小鼠為實驗材料，隨機分為基礎組和高脂組，每組12只。飼養(yǎng)于無特定病原（specific pathogen free，SPF）級動物房中，飼養(yǎng)期間自由飲水和飲食，進行12 h/12 h的明暗循環(huán)，適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗分組。其中基礎組小鼠喂養(yǎng)嚙齒動物基礎飼料（control diet，CD組）；高脂組喂養(yǎng)高脂飼料（high fat diet，HFD組），持續(xù)喂養(yǎng)16周，期間自由飲食飲水。通過體質量變化、腹腔注射葡萄糖耐量實驗（intraperitonealglucose tolerance tests，IPGTT）和腹腔注射胰島素耐量實驗（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT）實驗，以組間體質量差異大于30%，IPGTT和IPITT實驗組間差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）視為IR模型構建成功[23-25]。將造模成功后的小鼠隨機分為DMSO溶劑對照組和STM2457注射組，按照小鼠體質量根據(jù)50 mg/kg計算STM2457的用量，進行腹腔注射。給予DMSO對照組小鼠腹腔注射等量的DMSO。

1.2.3 IPGTT和IPITT IPGTT 實驗：實驗小鼠禁食禁水12 h后，對每組每只小鼠稱重，測量基礎血糖水平。按照1.0 g/kg體質量計算葡萄糖注射量，使用便攜式血糖儀測其 30、60、90、120、150、180 min時血糖水平，繪制折線圖觀察不同組間曲線變化趨勢。IPITT實驗：實驗小鼠禁食6 h，對每組每只小鼠稱重，測量基礎血糖水平。以0.65 U/kg小鼠體質量計算胰島素注射量，腹腔注射。使用便攜式血糖儀測其30、60、90、120、150、180 min 后血糖水平，繪制折線圖觀察不同組間曲線變化趨勢。

1.2.4 表觀轉錄組學mRNA m6A芯片檢測 小鼠附睪周圍脂肪組織進行表觀轉錄組學mRNA m6A芯片檢測委托上海康成生物工程有限公司進行，檢測過程按照公司技術服務常規(guī)實驗流程開展，其中“m6A甲基化水平”分析數(shù)據(jù)基于IP（免疫沉淀，Cy5標記）和Sup（上清液，Cy3標記）標準化強度，將轉錄物的m6A 甲基化水平計算為所有RNA 中修飾RNA的百分比（%修飾）；兩組原始強度用RNA強度的log2標度尖峰平均值進行標準化?！癿6A數(shù)量”基于IP標準化強度，計算每個轉錄物的m6A甲基化量。

1.2.5 RNA提取、反轉錄和Real Time PCR實驗 RNA提取和反轉錄均按照常規(guī)實驗室流程進行。其中RNA提取借助TrizoL試劑完成，反轉錄主要步驟按照試劑盒說明書進行。Real Time PCR實驗主要借助SYBR Green完成，所有的實驗重復3次，通過2-ΔΔCT 方法計算基因相對表達，以ATPF1作為脂肪組織的內(nèi)參基因，進行數(shù)據(jù)標準化。

PCR引物由生工生物工程（上海）公司設計并合成，引物序列如下。Acaca上游引物：5’-GACAGAGGAAGATGGCGTCC-3’，下游引物：5’-TACAACTTCTGCTCGCTGGG-3’；Srebf1上游引物：5’-CCAGCTTCAGTCCAGGTAGC-3’，下游引物：5’-GGACTTGCTCCTGCCATCAG-3’；Akt2上游引物：5’-GAGGTCCCAGTGATGCGAAG-3’，下游引物：5’-GGCTGTCATATCGGTCTGGG-3’；Insr上游引物：5’-GATGAGGCCAACCTTCCTGG-3’，下游引物：5’-AGAGGAACGATCCAACGGGA-3’；β-actin上游引物：5’-AGGGCTATGCTCTCCCTCAC-3’，下游引物：5’-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3’；Atpaf1上游引物：5’-CCCCTTCTACGACCGCTAC-3’，下游引物：5’-CCACTGGCTGCTTTCGGAA-3’。

1.2.6 斑點雜交實驗（Dot blot） 提取的總RNA分別稀釋至200 ng/μL、100 ng/μL 和50 ng/μL 3 個濃度進行Dot-blot 實驗，根據(jù)常規(guī)實驗室流程進行，處理結束后曝光。

1.2.7 Merip-qPCR實驗 按照試劑盒說明書進行上清液和IP樣品的制備，并進一步借助酚氯仿混合物（酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1）進行上清液及IP樣品的RNA分離提取，具體步驟參考試劑盒說明書。后續(xù)根據(jù)反轉錄及PCR 過程進行PCR擴增。Merip-qPCR引物序列如下。Acaca上游引物：5’-AGAATCTCCTGGTGACAATGCTT-3’，下游引物：5’-GTGGTCTTGCTGAGTTGGGTTA-3’；Srebf1上游引物：5’-AAACTGCCCATCCACCGAC-3’，下游引物：5’-ACTTCGTAGGGTCAGGTTCTCC-3’；Akt2上游引物：5’-CAGATGGTCGCCAACAGT-3’，下游引物：5’-TGCCGAGGAGTTTGAGATA-3’；Insr上游引物：5’-CAGATGGTCGCCAACAGT-3’，下游引物：5’-TGCCGAGGAGTTTGAGATA-3’；Pik3r1上游引物：5’-TCTACCCAGTGTCCAAATACCAG-3’，下游引物：5’-TAAATGCTTCGATAGCCGTTC-3’。

1.2.8 脂肪組織快速冰凍切片的HE 染色和Glut4 熒光染色 按照病理實驗室常規(guī)流程完成脂肪組織的快速冰凍切片，并置于-80度保存。后續(xù)HE染色和Glut4熒光染色均按照實驗室常規(guī)流程完成，分別置于正置顯微鏡和熒光顯微鏡下鏡檢。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，對于2組數(shù)據(jù)間的比較采用獨立樣本t 檢驗，多組之間的比較采用方差分析，進一步的兩兩比較采用q 檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 檢測T2DM患者脂肪組織中的總體m6A修飾水平

與健康對照組比較，T2DM患者脂肪組織中m6A甲基化水平升高（圖1A），基于Image J 軟件進行灰度值半定量分析，發(fā)現(xiàn)RNA 200 ng、100 ng和50 ng濃度下，T2DM患者脂肪組織中m6A 修飾水平分別上調(diào)（2.17±0.53）倍（t=-8.375；Plt;0.001）、（1.69±0.34）倍（t=-3.722；P=0.006）和（1.55±0.81）（t=-4.937；P=0.001）（圖1B）。

2.2 檢測高脂飲食誘導的小鼠IR 模型中，脂肪組織總體m6A修飾水平

C57BL/6J小鼠經(jīng)不同飼料喂養(yǎng)16周后，IPGTT實驗顯示基礎組血糖30 min后開始下降，高脂組90 min后血糖才開始緩慢下降；IPITT實驗顯示基礎組較高脂組血糖更早出現(xiàn)恢復趨勢，且恢復時間更快。至測量終點180 min時，基礎組小鼠血糖已基本恢復起始數(shù)值，但高脂組無法恢復到起始血糖水平（圖2A、B）。

HE染色和Glut4熒光染色顯示，基礎組切片為正常脂肪細胞，球形或卵圓形，胞質內(nèi)含有大脂肪滴，細胞核被擠到一側，呈新月形。高脂組脂肪細胞更加飽滿，細胞空泡狀明顯變大，細胞膜變得雜亂不規(guī)則（圖2C）。細胞膜上Glut4熒光信號在基礎組較強，高脂組明顯減弱（圖2C）。

Dot blot 實驗結果顯示，高脂組斑點強度明顯強于基礎組，表明高脂組附睪周圍脂肪組織中m6A甲基化水平明顯升高（圖2D）。利用Image J 軟件進行灰度值半定量分析，在RNA 100 ng 和50 ng 濃度下，與基礎組小鼠比較，高脂組小鼠脂肪組織中m6A修飾水平分別上調(diào)（1.59±0.43）倍（t=-3.590；P=0.023）和（1.40±0.33）（t=-2.760；P=0.025）（圖2D、E）。

2.3 高脂飲食誘導的IR小鼠脂肪組織m6A修飾差異基因圖譜分析

表觀轉錄組學mRNA m6A芯片檢測結果顯示，與基礎組相比，高脂組的總轉錄物（1 230個mRNAs）的m6A甲基化程度有明顯差異（FC≥1.5，Plt;0.05），其中1 175個mRNAs發(fā)生高m6A甲基化，55個發(fā)生低m6A甲基化（圖3A）。

通過KEGG 代謝通路（Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes pathway）數(shù)據(jù)庫分析轉錄物與代謝途徑、代謝通路的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)脂肪細胞中發(fā)生甲基化改變的基因與脂肪細胞中多種信號通路相關。其中高甲基化基因KEGG分析顯示胰島素信號傳導途徑位于第4位，共有19個基因被富集（圖3B）；低甲基化基因KEGG分析顯示胰島素信號傳導途徑位于第5位，共有2個基因被富集（圖3C），說明高脂飲食誘導下的基因高甲基化在IR中發(fā)揮重要作用。

進一步分析這些m6A甲基化修飾變化的基因在高脂組中的表達情況，并進行取交集分析，發(fā)現(xiàn)101個基因發(fā)生高甲基化且表達上調(diào)，182個基因發(fā)生高甲基化且低表達（圖3D），提示高甲基化基因可能在脂肪細胞胰島素敏感性調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。

2.4 驗證胰島素信號轉導通路主要差異基因的m6A 修飾變化

通過 KEGG pathway分析有統(tǒng)計學意義且被低表達的基因，顯示這些基因在胰島素抵抗、AMPK信號傳導通路、胰島素信號傳導通路等過程中發(fā)揮重要作用，其中胰島素信號轉導通路中有17個基因參與（富集得分=3.925，F(xiàn)DR=0.011，P=0.0001）（圖4A）。由于該通路受高甲基化基因影響顯著，提取KEGG 分析在該通路的19 個高甲基化基因（富集得分=4.604，F(xiàn)DR=0.002，Plt;0.001）（圖4B）。進一步對圖4A 和圖4B取交集，得到5個基因（圖4C），Merip-PCR驗證發(fā)現(xiàn)其中AKT2、INSR、ACACA、SREBF1 等4個基因一致（圖4D）。

2.5 甲基轉移酶METTL3對胰島素信號轉導通路主要差異基因的調(diào)控作用

對催化m6A 甲基化發(fā)生的甲基轉移酶METTL3、METTL14、WTAP轉錄水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)與基礎組比較，高脂組小鼠脂肪組織中Mettl3轉錄水平上調(diào)（圖5A，t=5.287，P=0.006）。RNA結合蛋白免疫沉淀實驗（RNA Binding ProteinImmunoprecipitation Assay，RIP）證實AKT2、INSR、ACACA、SREBF1 4個基因均與METTL3有直接結合（圖5B）。

高脂組小鼠給予腹腔注射METTL3 小分子抑制劑STM2457（50 mg/kg，每天1次，2周）后，體質量下降明顯，胰島素敏感性和葡萄糖耐量都有所提高（圖5C）。小鼠附睪周圍脂肪組織Glut4免疫熒光染色（圖5D，綠色熒光為FITC標記的熒光二抗）結果顯示，基礎組綠色熒光較強，鹽水組和溶劑組熒光明顯減弱，STM2457組較鹽水組和溶劑組明顯增強。進一步RT-qPCR 實驗發(fā)現(xiàn)STM2457 組脂肪組織中AKT2、INSR、ACACA、SREBF1 4個基因轉錄水平均升高較明顯（圖5E）。

3 討論

肥胖和T2DM是全球性公共健康問題，同時肥胖加重胰島素抵抗，加劇T2DM[26-27]。脂肪組織中m6A 甲基化修飾的研究相對比較少[13，28]，高脂飲食下脂肪組織m6A 修飾的變化和功能尚存爭議，因此，m6A甲基化修飾在脂肪組織中胰島素抵抗中的作用和機制仍需進一步研究。本研究通過分析基礎飲食和高脂飲食疾病模型的脂肪組織，以m6A修飾水平差異為切入點，通過人體脂肪組織、胰島素抵抗模型小鼠附睪周圍脂肪組織的驗證，證實高脂飲食導致脂肪組織內(nèi)m6A甲基化修飾水平升高，與已有文獻報道一致[29-30]，本研究的結果豐富了脂肪組織中m6A甲基化修飾的作用。

mRNAs直接參與基因轉錄和表達，本研究在高脂飲食誘導的IR小鼠模型中，對附睪周圍脂肪組織送檢mRNA轉錄組m6A甲基化芯片檢測，結果揭示了大量m6A 甲基化修飾水平變化的基因，建立了mRNA m6A甲基化修飾圖譜，提示m6A甲基化修飾在小鼠IR發(fā)生發(fā)展中的作用和潛在價值，與以往研究報道一致。同時，通過對m6A 甲基轉移酶的檢測，證實高脂飲食誘導下Mettl3上調(diào)，因此，后續(xù)圍繞Mettl3開展了進一步研究。

胰島素信號轉導異常是胰島素抵抗的關鍵環(huán)節(jié)，基于m6A甲基化修飾差異明顯基因的KEGG分析發(fā)現(xiàn)胰島素信號轉導通路被顯著富集，主要表現(xiàn)為高甲基化和低表達。對高甲基化和低表達的差異基因取交集，發(fā)現(xiàn)胰島素信號轉導通路4個關鍵基因INSR、AKT2、SREBF1、ACACA 發(fā)生m6A高甲基化且低表達，RIP實驗反應出METTL3與4個基因有直接結合，使4個因子發(fā)生m6A甲基化修飾。進一步通過小分子抑制劑STM2457 抑制METTL3 甲基轉移酶活性，發(fā)現(xiàn)小鼠胰島素抵抗得到改善，推測機制可能與INSR、AKT2、SREBF1、ACACA 4個基因RNA轉錄本表達水平升高，促進胰島素信號傳導有關。Xie W等[31]以20例T2DM和20例非糖尿病患者的肝臟組織作為研究對象，發(fā)現(xiàn)T2DM患者組肝臟組織的RNA m6A甲基化水平與非糖尿病患者組的相比顯著升高[。Dang YQ等[32]對高脂飲食喂養(yǎng)小鼠肝臟中的m6A甲基化水平進行分析，結果表明與正常飲食組相比，HFD組小鼠肝臟m6A甲基化水平增加顯著，這些已有的報道與本研究的結果一致。

基于以上結果，研究者繪制了高脂飲食誘導下脂肪組織胰島素信號轉導通路關鍵m6A修飾差異基因邏輯模式圖（圖6），證實高脂飲食組脂肪組織總m6A甲基化水平升高，在甲基轉移酶METTL3調(diào)控下，胰島素信號轉導通路中AKT2、INSR、ACACA、SREBF1 基因發(fā)生RNA m6A高甲基化修飾，并降低表達水平，阻滯胰島素信號轉導，誘發(fā)IR，提供了m6A甲基化修飾與IR的直接線索。

本研究存在一定的局限性，胰島素信號通路相關基因的高甲基化導致胰島素抵抗的機制仍需深入地研究。例如缺少METTL3 調(diào)控INSR、AKT2、SREBF1、ACACA m6A甲基化修飾的分子機制和功能；圍繞信號通路開展增強和抑制實驗，對信號通路相關分子機制的研究也將是課題組下一步的重點工作。同時，有必要探索組織靶向性給藥方式，能夠使METTL3 抑制劑STM2457 的臨床價值得到更加充分的驗證。

綜合以上，本研究豐富了m6A修飾在脂肪組織胰島素抵抗中的作用，為預防及治療IR提供新靶點新思路。在未來，有可能通過METTL3小分子抑制劑實現(xiàn)改善胰島素抵抗，最終糾正糖脂代謝紊亂，治療胰島素抵抗和T2DM。