【關(guān)鍵詞】甲硫腺苷磷酸化酶；前列腺癌；生物信息學(xué)；免疫細(xì)胞；CD4；CD56

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性的第二大常見(jiàn)腫瘤，也是全球腫瘤的第五大死亡原因[1]。研究表明，不同國(guó)家前列腺癌的發(fā)病率和死亡率差異很大，這可能與民族、種族背景、經(jīng)濟(jì)水平等原因有關(guān)[2]。然而，在世界范圍內(nèi)，晚期前列腺癌的治療選擇都是十分有限的。有研究表明，雖然雄激素剝奪治療對(duì)大多數(shù)早期患者是有效的，但幾乎所有患者都逐漸進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌，并且大多數(shù)患者在之后的幾年內(nèi)死亡[3-4]。紫杉醇類(lèi)藥物的應(yīng)用可提高前列腺癌患者的總生存率[5]，然而，隨之而來(lái)的耐藥也給臨床醫(yī)生帶來(lái)了新的問(wèn)題。免疫療法的出現(xiàn)為前列腺癌的治療提供了一種新的選擇。但免疫檢查點(diǎn)阻斷治療在PCa臨床治療中的效果尚不理想[6]。因此，尋找新的免疫治療靶點(diǎn)對(duì)PCa的治療非常重要。

甲基硫代腺苷磷酸化酶（methylthioadenosinephospylase，MTAP）基因位于染色體9p21上[7]，是多胺代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其功能的發(fā)揮也對(duì)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[8]。MTAP的主要功能是回收多胺代謝途徑中產(chǎn)生的5'-甲基硫代腺苷（5'-methylthioadenosine，MTA），產(chǎn)生三磷酸腺苷和甲硫氨酸[9]。然而，大量研究表明MTAP在多種腫瘤中存在異常表達(dá)（包含過(guò)表達(dá)，低表達(dá)或基因缺失），例如：胰腺腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等[10-12]。一項(xiàng)前列腺癌的相關(guān)研究指出，靶向MTAP抑制多胺的產(chǎn)生可能是治療PCa的有效策略[13]。然而，MTAP在PCa中的研究十分有限，在不同臨床階段的PCa中MTAP的表達(dá)水平尚不明確，對(duì)免疫細(xì)胞的作用也有待探究。

本研究對(duì)MTAP在PCa各臨床階段的表達(dá)模式進(jìn)行探究，明確了MTAP在不同臨床階段PCa中的表達(dá)水平及其與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。然后，對(duì)PCa 中，MTAP 與免疫細(xì)胞的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析，探究MTAP在免疫調(diào)控中的重要作用和臨床診療中的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 篩選2015年1月至2022年12月就診于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，經(jīng)病理科確診為PCa或良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）的患者。獲取病理科用于病理診斷的剩余石蠟包埋組織并進(jìn)行切片。

PCa樣本納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①經(jīng)病理診斷，確診為PCa或BPH的患者；②首次于本院確診且術(shù)前未接受過(guò)任何形式的治療的患者；③患者臨床資料完整。PCa樣本排除標(biāo)準(zhǔn)如下：①術(shù)前存在任何形式感染的患者；②患者并發(fā)其他腫瘤或免疫相關(guān)疾病；③患者術(shù)前曾接受內(nèi)分泌治療、化療或者其他治療；④神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的患者[14]。BPH樣本納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①經(jīng)病理診斷，確診為BPH的患者；②首次就診于我院并行手術(shù)治療的患者；③患者臨床資料完整。BPH樣本排除標(biāo)準(zhǔn)如下：①患者合并其他免疫性疾??；②患者存在任何形式的感染未完全糾正。

經(jīng)篩選，共納入68例PCa患者和16例BPH患者，其石蠟切片用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（中國(guó)重慶）機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批（批號(hào)：2022-K234）。所有實(shí)驗(yàn)符合《赫爾辛基宣言》。在本研究中，每位患者的隱私都得到了很好的保護(hù)。

1.1.2 前列腺癌細(xì)胞株 PCa細(xì)胞株22RV1、LNCaP、DU145和PC3，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)上海），PC3-PR獲取自重慶新橋醫(yī)院泌尿外科[15]。以上所有細(xì)胞均儲(chǔ)存于重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，液氮低溫冷凍保存lt;1年。

1.1.3 試劑 免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DAB試劑購(gòu)自廣州Biosharp生物技術(shù)有限公司。蘇木素染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。培養(yǎng)基F12-K、MEM、RPMI-1640，PBS緩沖液，胎牛血清（fetal bovineserum，F(xiàn)BS）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。Eastep?總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司。PrimeScriptTM RT試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，Chamq Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技技術(shù)股份有限公司。RTqPCR中使用引物購(gòu)自北京擎科生物有限公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。MTAP、CD4、CD56 兔抗及對(duì)應(yīng)的羊抗兔二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 MTAP 在泛癌中的表達(dá)分析 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.cancer.gov/aboutnci/organization/ccg/research/structuralgenomics/tcga）和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Genotype-Tissue-Expression-Project）下載MTAP的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，通過(guò)泛癌分析，探究MTAP在泛癌中的表達(dá)情況。再利用HPA 數(shù)據(jù)庫(kù) （https：//www.proteinatlas.org/）驗(yàn)證MTAP 在6 種腺癌及其鄰近組織樣本中的表達(dá)水平。

1.2.2 免疫組化 石蠟切片置于烘箱中，60 ℃烘片2 h，將切片浸沒(méi)在二甲苯中，室溫脫蠟，1 h。按照乙醇梯度順序（100%，95%，80%，70%），立即將切片依次浸沒(méi)于乙醇溶液中進(jìn)行水化，每個(gè)梯度5 min。應(yīng)用檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)。將切片浸沒(méi)在預(yù)先煮沸的檸檬酸鹽緩沖液中，加熱維持溶液溫度在95 ℃以上15 min。自然冷卻至室溫，PBS溶液室溫?fù)u床震蕩清洗3次，每次3 min。使用免疫組化試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。一抗在使用前，用PBS緩沖液稀釋至1∶200，滴加于切片組織上，4 ℃下孵育過(guò)夜。使用DAB試劑免疫染色，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水洗滌15 min后封片。顯微鏡拍照后，采用ImageJ軟件（NIH，美國(guó)）檢測(cè)各切片的平均光密度（integrated optical density，IOD）。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 22RV1 和LNCaP 細(xì)胞使用含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。PC3和PC3-PR 細(xì)胞使用含有10%FBS 的F-12k 培養(yǎng)基培養(yǎng)。DU145 細(xì)胞系使用含有10%FBS的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)孵箱。所有細(xì)胞均待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 總RNA提取及RT-qPCR 按照說(shuō)明書(shū)，使用Eastep?總RNA提取試劑盒提取總RNA。取1 μg總RNA使用Prime‐ScriptTM RT試劑盒（Takara，中國(guó)大連）的將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA保存于-20 ℃。使用Chamq Universal SYBR qPCRMaster Mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃，5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s。以GAPDH 作為內(nèi)參進(jìn)行對(duì)照。引物序列如下：MTAPforward，5’-TTCCAGAGGTGGTTCTTGCT-3’；MTAP-reverse，5’-CTGACCATTCTGTGGACCCT-3’；GAPDH-forward，5’-GGAGTCCACTGGCGTCTTCA-3’；GAPDH-reverse，5’-GTCATGAGTCCTTCCACGATACC-3’。每個(gè)樣本做4個(gè)復(fù)孔。采用2-ΔΔCT法來(lái)計(jì)算相對(duì)mRNA的含量，ΔCT=CT（目的基因）-CT（管家基因GAPDH），ΔΔCT=ΔCT（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCT（對(duì)照組），2-ΔΔCT表示實(shí)驗(yàn)組目的基因mRNA的含量相對(duì)于對(duì)照組所改變的倍數(shù)。

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 使用RIPA試劑和PMSF試劑的混合溶液（RIPA∶PMSF=100∶1）作為裂解液，冰上搖床震蕩裂解6 孔板中的待測(cè)細(xì)胞30 min，細(xì)胞刮收集細(xì)胞和裂解液于EP管中，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，吸取上清液即提取蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。5×蛋白上樣緩沖液與蛋白以1∶4 比例混合后，100 ℃變性15 min，-20 ℃保存。使用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒制膠并進(jìn)行蛋白上樣和電泳（100 V 恒壓電泳100 min）。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（冰盒內(nèi)轉(zhuǎn)膜，210 mA恒流轉(zhuǎn)膜40 min）。使用含5 %脫脂牛奶的TBST緩沖液室溫封閉抗體1 h。一抗（1∶1 000 TBST稀釋?zhuān)┰? ℃下孵育過(guò)夜。用山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000 TBST稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h。使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光液對(duì)膜進(jìn)行處理后進(jìn)行圖像采集。以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行對(duì)照。

1.2.6 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析 為了探究MTAP的表達(dá)水平與腫瘤微環(huán)境中各免疫細(xì)胞的相關(guān)性，應(yīng)用R 語(yǔ)言（4.0.1 版本）的ssGSEA（R/GSVA包，3.6版本），分析前列腺癌在TCGA數(shù)據(jù)中的免疫浸潤(rùn)情況，探究MTAP在前列腺癌中與24種免疫細(xì)胞的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析使用軟件GraphPad Prism 9.0和SPSS 26.0。泛癌分析采用R語(yǔ)言（4.0.1版本） R包：stats[4.2.1]，car[3.1-0]）分析，ggplot2[3.3.6]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。免疫分析分析采用ssGSEA（R/GSVA包，3.6版本），上述生信分析采用Welcht-test檢驗(yàn)（雙尾）。臨床病理特征與MTAP表達(dá)水平的相關(guān)性使用Spearman’s相關(guān)性分析。文中得到的數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，其兩兩比較采用LSD-t 法。MTAP表達(dá)水平與CD4、CD56的相關(guān)性采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTAP在多種腫瘤中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)

從TCGA和GTEx下載數(shù)據(jù)，分析MTAP在33種腫瘤中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相比于腫瘤旁組織，MTAP在BRCA（3.82±0.65 vs. 4.34±0.71，t=6.097，P=0.000）、CESC（3.38±0.47 vs. 4.67±0.75，t=6.262，P=0.000）、CHOL（2.75±0.28 vs.3.35±1.24，t=4.279，Plt;0.05）、COAD（3.22±0.48 vs. 4.25±0.55，t=6.227，P=0.000）、DLBC（1.78±1.56 vs. 2.56±1.16，t=5.548，P=0.000）、ESCA（3.54±0.46 vs. 4.38±0.88，t=6.294，P=0.000）、GBM（1.89±0.84 vs. 2.75±1.12，t=6.337，P=0.000）、HNSC（3.96±0.52 vs. 4.41±1.05，t=6.010，P=0.000）、LAML（0.27±0.11 vs. 4.66±0.84，t=8.948，P=0.000）、LGG（1.78±0.69 vs. 3.89±0.61，t=8.525，P=0.000）、LIHC（2.15±0.42 vs.2.67±0.69，t=5.992，P=0.000）、LUAD（3.41±0.45 vs. 3.86±0.55，t=5.915，P=0.000）、LUSC（3.48±0.49 vs. 4.25±0.87，t=5.533，P=0.000）、PAAD（2.39±0.47 vs. 3.90±0.97，t=7.936，P=0.000）、PRAD（3.55±0.48 vs. 3.89±0.52，t=5.845，Plt;0.01）、READ（3.37±0.47 vs. 4.19±0.58，t=5.291，P=0.000）、SKCM（3.54±0.87 vs. 3.95±1.21，t=6.095，P=0.000）、STAD（2.39±0.51 vs. 4.05±0.79，t=7.722，P=0.000）、TGCT（3.22±0.39 vs.3.86±0.53，t=6.264，P=0.000）、THCA（2.81±0.37 vs. 3.63±0.45，t=5.922，P=0.000）、THYM（1.65±1.35 vs. 2.36±0.59，t=6.340，P=0.000）（乳腺浸潤(rùn)癌、宮頸鱗癌和腺癌、膽管癌、結(jié)腸癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、食管癌、多形成性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、急性髓細(xì)胞樣白血病、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞肝癌、肺腺癌、肺鱗癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸腺癌、皮膚黑色素瘤、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胸腺癌）中均顯示過(guò)表達(dá)，而在KICH（腎嫌色細(xì)胞癌，Plt;0.05）中呈現(xiàn)低表達(dá)，其余腫瘤差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A）。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中的免疫組化數(shù)據(jù)顯示，相比于腫瘤旁組織，MTAP 在COAD（3.42±0.53 vs. 4.46±0.58，t=5.106，P=0.000）、PAAD（2.39±0.45 vs. 3.38±0.96，t=6.917，P=0.000）、LUAD（3.14±0.32 vs.3.98±0.64，t=5.705，P=0.000）、THCA（3.17±0.49 vs. 3.96±0.58，t=5.724，P=0.000）、BRCA（3.82±0.76 vs. 4.32±0.87，t=5.212，P=0.000）、PRAD（3.27±0.44 vs. 3.84±0.52，t=4.717，Plt;0.01）（結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、肺腺癌、乳腺浸潤(rùn)癌）6 種腺癌中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，與上述分析結(jié)果相同（圖1B）。

2.2 PCa中MTAP的表達(dá)水平在早期升高后逐漸降低

為了進(jìn)一步評(píng)估MTAP在不同臨床階段前列腺組織中的表達(dá)水平，對(duì)84例前列腺組織進(jìn)行了免疫組化實(shí)驗(yàn)，其中包括68例PCa和16例BPH樣本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PCa樣本中，僅有T1和T2期MTAP的平均IOD明顯高于BPH患者。隨著腫瘤的進(jìn)展，MTAP 的平均IOD 逐漸下降至低于正常組織。Spearman’s相關(guān)性分析結(jié)果顯示：MTAP的表達(dá)水平與T 分期呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.575 9，P=0.000，圖2A、C、D，表1）。此外，根據(jù)Gleason評(píng)分將樣本分為5個(gè)等級(jí)組，包括Grade 1（Gleason 評(píng)分≤6），Grade 2（Gleason 評(píng)分3+4=7），Grade 3（Gleason 評(píng)分4+3=7），Grade 4（Gleason 評(píng)分4+4=8，5+3=8，或3+5=8），和Grade 5（Gleason評(píng)分≥9）[16]。Spearman’s相關(guān)性分析結(jié)果顯示：Gleason評(píng)分與MTAP表達(dá)水平也呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.284 3，P=0.02），見(jiàn)圖2B、E，表1。

隨后，利用5種不同轉(zhuǎn)移和耐藥程度的PCa細(xì)胞系，進(jìn)一步探究MTAP表達(dá)水平與PCa惡性程度的關(guān)聯(lián)。其中包括22RV1（異種移植原發(fā)PCa，雄激素敏感）、LNCaP（淋巴轉(zhuǎn)移性PCa，雄激素敏感）、DU145（腦轉(zhuǎn)移性PCa，雄激素抵抗）、PC3（骨轉(zhuǎn)移性PCa，雄激素抵抗）和PC3-PR（骨轉(zhuǎn)移性PCa，雄激素抵抗并紫杉醇耐藥），上述細(xì)胞轉(zhuǎn)移和耐藥性依次升高，惡性程度依次增加[17]。對(duì)這些PCa 細(xì)胞系進(jìn)行了RT-qPCR檢測(cè)：以2-ΔΔCT法來(lái)比較MTAP mRNA水平定量檢測(cè)結(jié)果，以22RV1 的mRNA 水平為對(duì)照（100%），LNCaP、DU145、PC3、PC3-PR 組的表達(dá)量為22RV1 組的（23.66±3.76）%、（16.54±3.13）%、（15.01±5.97）%及（7.3±1.21）%。方差分析5組的MTAP mRNA 表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.77；P=0.000），兩兩比較結(jié)果顯示LNCaP、DU145、PC3、PC3-PR組的表達(dá)量均低于22RV1組（LNCaP vs.22RV1：t=4.927；P=0.000；DU145 vs. 22RV1：t=5.378；P=0.000；PC3vs. 22RV1：t=5.406；P=0.000；PC3-PR vs.22RV1：t=5.973；P=0.000，圖2F）。

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：以蛋白Marker為參照，各組均在31 kD 處顯示條帶，說(shuō)明各組均有MTAP 的表達(dá)，GAPDH 表達(dá)位于36 kD 處，以GAPDH 為內(nèi)參，采用ImageLab 6.1 軟件定量分析各組中MTAP 的蛋白表達(dá)水平。將22RV1 組作為對(duì)照（表達(dá)量為1），MTAP 在LNCaP、DU145，PC3，PC3-PR 的相對(duì)表達(dá)量為0.864±0.117、0.287±0.090、0.143±0.089 和0.101±0.077。方差分析5 組的MTAP 表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=60.85，Plt;0.001）。兩兩比較結(jié)果顯示，相比于22RV1，MTAP在DU145，PC3，PC3-PR中的表達(dá)均降低（DU145 vs. 22RV1：t=9.696，P=0.000；PC3 vs.22RV1：t=11.650，P=0.000；PC3-PR vs. 22RV1：t=13.100，P=0.000，圖2G、H）。該結(jié)果表明，低惡性的PCa 細(xì)胞系中，MTAP表達(dá)水平顯著高于惡性度較高的PCa細(xì)胞系。

2.3 在PCa中，MTAP的表達(dá)水平與多種免疫細(xì)胞相關(guān)

腫瘤的進(jìn)展通常伴隨著免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。因此，使用R語(yǔ)言（4.0.1版本）的ssGSEA（R/GSVA包，3.6版本），探究PCa組織細(xì)胞中MTAP的表達(dá)與PCa中24種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量的相關(guān)性。結(jié)果顯示MTAP 與Tcm、輔助性T 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞、TFH、Tem、巨噬細(xì)胞、Th17細(xì)胞、T細(xì)胞、aDC等多種免疫細(xì)胞呈正相關(guān)（圖3A）。其中，MTAP 與細(xì)胞毒性細(xì)胞（r=-0.147，P=0.001），NK CD56bright 細(xì)胞（r=-0.371，Plt;0.001），和NK細(xì)胞（r=-0.158，Plt;0.001）呈負(fù)相關(guān)（圖3B）。

為了驗(yàn)證上述生物信息學(xué)分析結(jié)論，進(jìn)行了免疫組化染色實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步確定PCa 組織中MTAP 與CD4+T 細(xì)胞和NK CD56bright細(xì)胞的相關(guān)性。選取了41例PCa組織進(jìn)行CD4染色；68 例PCa 樣本進(jìn)行MTAP 和CD56 染色。結(jié)果顯示CD4 的平均IOD 與MTAP 呈正相關(guān)（r=0.643，Plt;0.001），而CD56與MTAP呈負(fù)相關(guān)（r=-0.570，Plt;0.001，圖4）。

3 討論

有研究表明，MTAP在多種腫瘤中均可出現(xiàn)缺失，而這也通常與患者更低的總體生存率相關(guān)[18-21]。然而，在PCa中，MTAP的缺失卻是罕見(jiàn)的，但MTAP表達(dá)水平的降低通常是預(yù)后不良的一個(gè)重要標(biāo)志[22]。多胺是前列腺液的重要成分。有研究證實(shí)，前列腺產(chǎn)生的多胺是其他組織或器官的10 倍以上[23-25]。前列腺上皮細(xì)胞可向前列腺腔內(nèi)分泌大量乙酰化多胺，而MTAP是緩解前列腺代謝負(fù)荷的關(guān)鍵酶[26]。有文獻(xiàn)指出，靶向MTAP并能夠增強(qiáng)這種代謝依賴(lài)性的藥物可能是治療PCa的一種有效選擇[13]。

本研究首先通過(guò)TCGA和GTEx公共數(shù)據(jù)庫(kù)的大量腫瘤樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行了泛癌分析，結(jié)果表明：MTAP在33種腫瘤中，21種出現(xiàn)了過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，僅1種腫瘤呈現(xiàn)低表達(dá)（其余腫瘤差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。然而，這些結(jié)果僅描述了MTAP在腫瘤和正常組織之間表達(dá)水平的差異，MTAP在PCa不同病理階段的具體表達(dá)水平仍有待進(jìn)一步明確。所以，選擇通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)對(duì)MTAP在PCa組織中的表達(dá)水平進(jìn)行探究。結(jié)果令人驚奇的是，MTAP 僅在早期PCa組織中出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，隨著腫瘤的進(jìn)展，MTAP的表達(dá)水平逐漸降低。其表達(dá)與T分期、Gleason評(píng)分呈明顯負(fù)相關(guān)。隨后，通過(guò)對(duì)臨床資料的整理和分析，為這種現(xiàn)象作出了合理的解釋?zhuān)涸趯?shí)際臨床工作中，治療方案的選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響不容忽視。根據(jù)《CSCO前列腺癌診療指南》，早中期腫瘤的患者多應(yīng)用手術(shù)治療方案，而在晚期腫瘤及轉(zhuǎn)移癌患者中，保守治療則較常應(yīng)用[27]。這就造成了公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，晚期腫瘤組織樣本數(shù)量稀少，其數(shù)量占比遠(yuǎn)低于早中期腫瘤樣本。這也導(dǎo)致了樣本的總體特征更接近于早、中期腫瘤的特征。公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)多因此，本實(shí)驗(yàn)的生物信息學(xué)分析中，腫瘤樣本MTAP表達(dá)水平呈現(xiàn)出高于正常組織的過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。

在本研究的樣本中，本研究也發(fā)現(xiàn)了這種相似的分布現(xiàn)象。在篩選后隨機(jī)抽取的68例PCa組織蠟塊樣本中，T1 期患者最少，僅3 例，占總數(shù)的4.41%。T2患者最多，42例，占總數(shù)的61.76%；T3和T4患者分別為14例和9例，占總數(shù)的20.58%和13.24%。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，根據(jù)患者的T分期和Gleason評(píng)分對(duì)腫瘤組織樣本進(jìn)行了細(xì)化分組并分別進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，才得以發(fā)現(xiàn)MTAP在前列腺癌不同臨床階段的表達(dá)水平差異。

近年來(lái)，腫瘤免疫研究逐漸引起了人們的關(guān)注。這些研究有助于了解腫瘤和免疫細(xì)胞之間的相互作用，并輔助判斷預(yù)后[28-29]。有文獻(xiàn)顯示，腫瘤中缺乏MTAP可導(dǎo)致底物MTA的積累，從而抑制T細(xì)胞的增殖、活化、分化和效應(yīng)功能[30]。此外，主要由活化T細(xì)胞分泌的IL-12等細(xì)胞因子在非特異性免疫中也發(fā)揮了重要作用。NK CD56bright細(xì)胞是NK細(xì)胞的前體細(xì)胞，其細(xì)胞毒作用僅在IL-12刺激下才能獲得增強(qiáng)[31]，繼而成為具有殺傷作用的成熟NK細(xì)胞。MTAP的表達(dá)水平升高將間接導(dǎo)致機(jī)體的特異性免疫和非特異性免疫功能雙重障礙，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，PCa中MTAP與多種免疫細(xì)胞存在關(guān)聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)在CD4+T細(xì)胞和NK CD56bright細(xì)胞中尤為明顯。這表明PCa中，MTAP對(duì)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)及其免疫功能的發(fā)揮起到了重要作用，是一種潛在的免疫治療靶點(diǎn)。

本研究中，新鮮的晚期腫瘤組織樣本缺乏極大地限制了實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的推進(jìn)。在PCa中，MTAP呈現(xiàn)出這種特殊的表達(dá)模式的機(jī)制有待進(jìn)一步探究。免疫調(diào)控過(guò)程中是否存在免疫細(xì)胞間的相互作用仍需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，MTAP在PCa中的機(jī)制相關(guān)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將是本研究的重點(diǎn)。