【關(guān)鍵詞】原發(fā)性肺癌；結(jié)核分枝桿菌；耐藥性；基因突變；Notch信號(hào)通路

原發(fā)性肺癌是指原發(fā)于支氣管和肺組織的惡性腫瘤，一般以單發(fā)為主，其發(fā)病率在多個(gè)國(guó)家呈明顯增高趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命[1]。對(duì)于肺癌的發(fā)病原因至今仍不十分清楚，但多認(rèn)為與吸煙、環(huán)境污染、職業(yè)危害、遺傳等有一定關(guān)系[2]。近年來(lái)研究顯示，肺癌的發(fā)病與結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB）L 型感染密切相關(guān)[3]。MTB-L 型是MTB 細(xì)胞壁缺陷型，可長(zhǎng)期潛伏于宿主體內(nèi)，是導(dǎo)致結(jié)核病復(fù)發(fā)或遷延不愈的重要原因[4]。據(jù)報(bào)道，MTB-L 型感染后，可將自身DNA 整合入宿主染色體上，可能激活原癌基因和（或）抑制抑癌基因表達(dá)，從而引起癌變[5]。因此，調(diào)查原發(fā)性肺癌患者M(jìn)TB 感染情況，對(duì)臨床診治意義重大。Notch 信號(hào)通路是進(jìn)化上十分保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多個(gè)生理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6]。Shi QH 等[7]研究顯示，Notch信號(hào)通路在MTB感染、免疫逃避中有重要作用。同時(shí)，Notch信號(hào)通路的異常活化還與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。但原發(fā)性肺癌、MTB感染與Notch信號(hào)通路之間的關(guān)系還不清楚，本研究將探究原發(fā)性肺癌患者M(jìn)TB感染情況，并分析其對(duì)Notch信號(hào)通路表達(dá)的影響，為原發(fā)性肺癌的病因?qū)W提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年1月至2022年6月在重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受根治術(shù)治療的96例原發(fā)性肺癌患者為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：患者符合《中國(guó)原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2015年版）》[9]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理學(xué)檢查確診；接受根治術(shù)治療；年齡40～70歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受抗癌治療；繼發(fā)性肺癌；合并其他惡性腫瘤；合并其他重要器官功能障礙、免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病；長(zhǎng)期服用抗菌藥物治療。本研究符合赫爾辛基宣言，入組患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 原位分子雜交技術(shù)檢測(cè) 從MTB H37RV 標(biāo)準(zhǔn)株的MPB64 基因片段選取My2500224 和My310283 片段，上述MTB-L型探針合成和生物素標(biāo)記由蘇州鴻訊生物科技股份有限公司完成，上游引物序列為CGGTATCGGTGCCTTTCAACTCCTCGC，下游引物序列為GGGCAGGCTGATGTTGATGTTGTAGGC。取患者手術(shù)中保留的肺組織標(biāo)本，常規(guī)脫蠟后，參照原位分子雜交檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Invitrogen）說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)肺組織中MTB-L型感染情況。

1.2.2 抗酸染色法檢測(cè) 肺組織標(biāo)本常規(guī)脫蠟，添加0.5%高碘酸溶液氧化5～8 min，再用0.8% Triton X-100 溶液處理10 min，接著添加苯酚堿性品紅溶液，室溫下染色30 min，然后添加20%硫酸水溶液分化30 s，Mayer蘇木素復(fù)染，最后置于60 ℃烘箱烘干，二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固，觀察MTB原菌型和L型[10]。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 收集上述MTB原菌型和L型檢測(cè)陽(yáng)性者術(shù)后1 d痰液標(biāo)本，膠體金法鑒別排除非MTB感染樣本，采用平板劃線法純化分離菌株，參照結(jié)核分枝桿菌藥敏試劑盒說(shuō)明書(shū)操作（珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司），參照文獻(xiàn)[11]判讀結(jié)果。

1.2.4 MTB基因多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè) 選取耐利福平基因（rpoB）、耐異煙肼基因（katG）、耐鏈霉素基因（rpsL）和耐乙胺丁醇基因（embB）作為觀察位點(diǎn)，提取分離菌株DNA，根據(jù)上述基因引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），rpoB上游引物序列CGAGGACTTGACGGCAGACGCT，下游引物序列AACCACGCCGTCGACCACCT；katG上游引物序列ACGTAGATCAGCCCCATCTG，下游引物序列GAGCCCGATGAGGTCTATTG；rpsL 上游引物序列GATGACGGCCTTCGGGTTGT，下游引物序列GTTCACCAACTGGGTGAC；embB 上游引物序列AATCAGGCTCCAGACGC，下游引物序列ACCGAGCAGCATAGGAG。再取擴(kuò)增目的基因片段送檢測(cè)序，測(cè)序過(guò)程由北京瑞德百奧生物信息科技有限公司完成。

1.2.5 Notch信號(hào)通路表達(dá)檢測(cè) 取肺組織添加蛋白裂解試劑（武漢博士德生物工程有限公司）提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳和電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，置于5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，分別添加合適稀釋比的抗Notch1、Notch2、Notch3及β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（美國(guó)Abacam），4 ℃下孵育過(guò)夜，次日洗膜后再添加稀釋比為1∶8 000的蛋白二抗，室溫下孵育50 min，洗膜后暗室中發(fā)光顯影。掃描蛋白條帶后，利用Image J軟件測(cè)量條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTB原菌型和L型檢出情況

通過(guò)原位分子雜交技術(shù)和抗酸染色法檢測(cè)，96例原發(fā)性肺癌組織標(biāo)本僅檢出MTB-L 陽(yáng)性37 例，陽(yáng)性率為38.54%，陽(yáng)性患者痰標(biāo)本分離出MTB-L菌株68株。

2.2 MTB-L型菌株耐藥性

68株MTB-L型菌株對(duì)一線抗結(jié)核藥物耐藥41株，耐藥率為60.29%，其中對(duì)異煙肼、鏈霉素、利福平及乙胺丁醇聯(lián)合使用耐藥率最高，為22.06%。68株MTB-L型菌株對(duì)二線抗結(jié)核藥物耐藥25株，耐藥率為36.76%，其中對(duì)氧氟沙星單一用藥耐藥率最高，為14.70%。具體耐藥情況見(jiàn)表1、2。

2.3 MTB-L型菌株藥物靶基因突變情況

MTB-L型菌株藥物靶基因突變率前3位分別為異煙肼靶基因katG S315T（45.58%）、鏈霉素靶基因rpsL K43R（42.65%）、利福平靶基因rpoB S450L（20.59%）。具體突變情況見(jiàn)表3。

2.4 MTB-L感染對(duì)Notch信號(hào)通路表達(dá)的影響

MTB-L 感染陽(yáng)性患者肺組織中Notch1、Notch2、Notch3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于MTB-L陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見(jiàn)表4。

3 討論

MTB在適宜環(huán)境中呈現(xiàn)典型形態(tài)，但存在抗生素、免疫血清、溶菌酶等因素干擾下，MTB細(xì)胞壁合成受阻形成細(xì)胞壁缺陷的L型形態(tài)，且由于細(xì)胞壁缺陷程度的不同，其形態(tài)也具有高度的多形性[12]。雖然相對(duì)于MTB原菌型來(lái)說(shuō)，L型的致病性減弱，但MTB-L型可在體內(nèi)長(zhǎng)期存在，導(dǎo)致結(jié)核病病情惡化、遷延不愈和復(fù)發(fā)[13]。隨著對(duì)MTB-L型研究的深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MTB-L型在肺癌患者中有較高的檢出率，可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展：MTB-L型可進(jìn)入肺泡上皮細(xì)胞核，將自身DNA整合入宿主染色體上，誘導(dǎo)惡性腫瘤；MTB-L型潛伏性感染會(huì)引起肺組織產(chǎn)生持續(xù)性慢性炎癥反應(yīng)，引起肺組織過(guò)度增生，局部靜脈淋巴回流受阻，大量致癌物聚集性刺激鄰近肺組織，從而誘發(fā)癌變[14-15]。本研究結(jié)果顯示，原發(fā)性肺癌患者組織樣本中僅發(fā)現(xiàn)MTB-L型感染，陽(yáng)性率為38.54%，這與既往研究[16]結(jié)果相符，驗(yàn)證MTB-L型感染與原發(fā)性肺癌發(fā)病的相關(guān)性。

細(xì)胞壁的缺陷導(dǎo)致MTB藥物敏感性也發(fā)生改變，這是MTB形成耐藥性的重要機(jī)制，但其耐藥性程度和范圍與細(xì)胞壁確實(shí)程度及菌種有關(guān)[17]。臨床統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，MTB-L型對(duì)多種作用于細(xì)胞壁的抗菌藥物不再敏感[18]。本研究檢測(cè)分離MTB-L型耐藥性，結(jié)果顯示，分離MTB-L型菌株對(duì)一線抗結(jié)核藥物耐藥率為60.29%，對(duì)二線抗結(jié)核藥物耐藥率為36.76%，其中對(duì)一線抗結(jié)核藥物中異煙肼、鏈霉素、利福平及乙胺丁醇聯(lián)合使用耐藥率最高，二線抗結(jié)核藥物中對(duì)氧氟沙星單一用藥耐藥率最高，提示多種抗結(jié)核藥物的聯(lián)合使用可能會(huì)增加MTB耐藥性，建議臨床早期合并根據(jù)藥物敏感性結(jié)果用藥，避免單用氧氟沙星和3種以上的藥物聯(lián)用。同時(shí)本研究分析主要耐藥突變類(lèi)型情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此次分離出的68株MTB-L型菌株藥物靶基因突變率前3位分別為異煙肼靶基因katG S315T（45.58%）、鏈霉素靶基因rpsL K43R（42.65%）、利福平靶基因rpoB S450L（20.59%），與高敏等[19]報(bào)道突變頻率存在一定差異，分析原因可能與研究樣本量、菌株類(lèi)型、用藥習(xí)慣及患者群體個(gè)體差異有關(guān)。但值得注意的是常見(jiàn)藥物靶基因突變率與菌株耐藥率并不匹配，說(shuō)明基因突變可能不是耐藥產(chǎn)生的唯一機(jī)制，MTB-L型菌株的耐藥和基因突變機(jī)制仍需要繼續(xù)追蹤分析。

Notch信號(hào)通路由Notch受體、配體、細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子、調(diào)節(jié)分子及其他效應(yīng)物組成，主要通過(guò)旁側(cè)抑制多種不成熟細(xì)胞的分化[20-21]。研究顯示，Notch 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)肺發(fā)育所必需的細(xì)胞間信號(hào)，同時(shí)在肺癌及肺癌預(yù)后中發(fā)揮重要作用[22-23]。Ng J等[24]研究表明，Notch信號(hào)在小細(xì)胞肺癌中存在高度異質(zhì)性，并可控制腫瘤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)行為能力。同時(shí)，還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路在結(jié)核免疫中有重要的調(diào)控作用。還有研究表明，Notch1信號(hào)通路在結(jié)核菌脂阿拉伯甘露糖誘導(dǎo)的結(jié)核分枝桿菌免疫逃避中有重要作用，基于Notch1信號(hào)通路的靶向治療可能為潛伏結(jié)核感染或難治性結(jié)核病提供新的治療方向[25]。本研究結(jié)果顯示，MTB-L感染陽(yáng)性患者肺組織中Notch1、Notch2、Notch3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于MTB-L陰性者，表明MTB-L感染可能會(huì)加劇原發(fā)性肺癌患者體內(nèi)Notch信號(hào)通路的異?；罨ｋS著對(duì)Notch信號(hào)通路及下游調(diào)控機(jī)制的深入研究，還需要更多基礎(chǔ)和臨床研究繼續(xù)分析Notch信號(hào)通路與原發(fā)性肺癌MTB感染的關(guān)系。

綜上所述，原發(fā)性肺癌患者M(jìn)TB感染類(lèi)型主要為L(zhǎng)型，MTB-L型對(duì)一線抗結(jié)核藥物及二線抗結(jié)核藥物存在較高耐藥率，多藥聯(lián)合使用會(huì)增加MTB耐藥性，藥物靶基因的突變以異煙肼靶基因katGS315T、鏈霉素靶基因rpsL K43R、利福平靶基因rpoB S450L 多見(jiàn)，且合并MTB-L 型感染患者存在Notch信號(hào)通路的異常激活。后續(xù)將對(duì)本地區(qū)用藥情況進(jìn)行深入調(diào)查，繼續(xù)探究MTB耐藥和基因突變的發(fā)生機(jī)制，及對(duì)原發(fā)性肺癌的影響。