【關(guān)鍵詞】M1表型的小膠質(zhì)細(xì)胞；外泌體；體外血腦屏障模型；缺血性腦卒中

腦卒中是全球僅次于缺血性心臟病的第2大死因[1]，其中缺血性卒中的占比高達(dá)80%以上。目前，臨床治療局限，主要包括靜脈溶栓和血管內(nèi)機(jī)械取栓，但這2 種方法均可能造成腦缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）損傷，破壞血腦屏障（blood-brain barrier，BBB），導(dǎo)致腦水腫甚至顱內(nèi)出血[2]。因此，尋找早期治療靶點(diǎn)和藥物，預(yù)防IR后的BBB破壞，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細(xì)胞，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，涉及炎癥、細(xì)胞毒性、修復(fù)、免疫抑制和再生等多個(gè)方面[3]。它有2種活化形式：一種是具有促炎作用的M1型，另一種是具有保護(hù)功能的M2型，而在卒中急性期主要以M1型為主[4]。研究證實(shí)在大腦中動(dòng)脈閉塞后的數(shù)小時(shí)里，缺血邊界區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，尤其是M1表型迅速增加，導(dǎo)致急性期腦損傷[5]。眾所周知，IR后可能發(fā)生一系列再灌注損傷，炎癥及氧化應(yīng)激是主要原因，神經(jīng)細(xì)胞與血腦屏障的損害會(huì)加重組織破壞和功能惡化，小膠質(zhì)細(xì)胞在這一過(guò)程中起重要作用[6]，但其機(jī)制尚不清楚。近幾年，越來(lái)越多的研究證明小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)分泌外泌體與周?chē)?xì)胞發(fā)生信息傳遞，外泌體是神經(jīng)-小膠質(zhì)細(xì)胞信息交流的重要“媒介”，且能與BBB發(fā)生串?dāng)_[7-9]。

外泌體是一種由細(xì)胞分泌的小囊泡，具有與該細(xì)胞相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[10]，能被鄰近或是遠(yuǎn)隔的細(xì)胞選擇性吸收，其生物活性可為慢性炎癥、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、肥胖和代謝性疾病等的診治靶點(diǎn)提供潛在的生物標(biāo)志物[11]。

本研究的目的在于通過(guò)建立體外BBB模型，探明M1 表型的小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體（M1 microgliaderivedexosome，M1-exo）對(duì)于血腦屏障功能及其相關(guān)分子表達(dá)的影響，為預(yù)防IR后BBB的破壞，減少再灌注損傷的潛在威脅提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞、小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系b.End3細(xì)胞均購(gòu)于北納生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 MEM 培養(yǎng)基（minimum essentialmedium，MEM）、DMEM 培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle'smedium，DMEM）（servicebio，武漢）；磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer saline，PBS）（SIGMA，美國(guó)）；胎牛血清、青鏈霉素（gibco，美國(guó)）；LPS（Solarbio，北京）；蛋白裂解液（Radioimmunoprecipitationassay buffer，RIPA）（碧云天，上海）；丙酮酸還原酶（Hydroxypyruvate reductase，HPR）標(biāo)記的羊抗兔IgG（Abmart，上海）；小鼠抗β-actin單抗（中杉金橋，北京）；Claudin-1、Occludin、ZO-1 抗體（bioss，北京）；JAM-1 抗體（abcam，英國(guó)）；Ribo Exosome solation Reagent（RiboBio，廣州）；高速冷凍離心機(jī)（scilogex，美國(guó)）；低速離心機(jī)（四川蜀科儀器）。

1.2 研究方法

1.2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞的激活極化 將小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系BV2細(xì)胞置于含有10%熱滅活胎牛血清、青鏈霉素溶液的MEM中，于37 ℃，5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。胰酶消化收集BV2細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按照每孔105細(xì)胞量將細(xì)胞接種于6孔板中，到細(xì)胞融合度70%左右時(shí)，將培養(yǎng)液更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，第2組加入200 ng/mL LPS 24 h，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1表型極化。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)極化情況。

1.2.2 外泌體分離提取及鑒定 收集細(xì)胞培養(yǎng)基，在室溫下以2 000 xg離心30 min，以去除殘留細(xì)胞及碎片，轉(zhuǎn)移上清樣本9 mL至新管，加入1/3體積的Ribo Exosome solation Reagent（for cell culture media），顛倒混合直至樣本完全混勻，放入4 ℃冰箱靜置過(guò)夜。將2 mL混合液轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃下1 500 xg離心30 min，棄去上清液，重復(fù)該步驟直至全部混合液轉(zhuǎn)移至離心管，再次離心后獲得外泌體，以透射電鏡觀(guān)察其形態(tài)。

1.2.3 體外BBB模型制備及分組處理 將小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系b.End3細(xì)胞與原代培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，采用Transwell技術(shù)進(jìn)行共培養(yǎng)，建立體外BBB模型，實(shí)驗(yàn)分組為：①b.End3 組；②b.End3+BV2 細(xì)胞來(lái)源外泌體（BV2-derivedexosome，BV2-exo）組；3、b.End3+M1-exo 組。在transwell上室種植b.End3細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基重懸，吸取0.5 mL種植于細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)，將星形膠質(zhì)細(xì)胞接種到培養(yǎng)池外側(cè)6孔培養(yǎng)板內(nèi)。7 d左右時(shí)，兩種細(xì)胞分別在多聚酯膜兩側(cè)呈單層生長(zhǎng)，使用電阻儀檢測(cè)跨內(nèi)皮細(xì)胞間電阻，電阻檢測(cè)通過(guò)，將BV2和M1來(lái)源的外泌體，按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入transwell 小室細(xì)胞中，作用48 h 后，檢測(cè)跨膜電阻（trans-endothelial electrical resistance， TEER）。計(jì)算公式為：TEER=（模型總電阻- Transwell空白電阻）×膜面積。

1.2.4 體外BBB通透性測(cè)定 在Transwell小室頂端腔內(nèi)加入含有終濃度為100 μg/mL 熒光黃的漢克平衡鹽溶液（Hanks Balanced Salt Solution，HBSS）100 μL，37 ℃孵育4 h后收集腹側(cè)腔液體，熒光分光光度計(jì)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算熒光黃濃度。熒光黃透過(guò)率（%）=基底側(cè)熒光黃濃度/加入頂端側(cè)的熒光黃濃度（100%）。

1.2.5 WB方法 體外BBB建模成功，按實(shí)驗(yàn)分組給予或不予外泌體處理48 h 后，檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞Claudin-1、Occludin、ZO-1及JAM 的表達(dá)。PBS洗滌2次，加入RIPA裂解液，于4 ℃下，12 000 r/min離心10 min，收集上清液。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度，并據(jù)其調(diào)整各樣本上樣體積。蛋白經(jīng)電泳變性分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，室溫封閉1 h，分別加入稀釋后的Claudin-1抗體（1∶1 000）、Occludin抗體（1∶2 000）、ZO-1抗體（1∶2 000）、JAM-1（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜后加入HPR 標(biāo)記的羊抗兔IgG。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 7.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，2組和多組之間的比較分別通過(guò)t 檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞

LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞并促使其向M1型極化，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常培養(yǎng)組相比，LPS處理組的M1型標(biāo)志物CD16/32表達(dá)陽(yáng)性率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1。

2.2 M1-exo的形態(tài)學(xué)觀(guān)察

分離提取活化的M1表型的小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中的外泌體，在透射電鏡下觀(guān)察其形態(tài)，呈現(xiàn)出具有雙膜性結(jié)構(gòu)的圓形或類(lèi)圓形囊泡狀，邊界清晰，大小各異，直徑在40～130 nm，腔內(nèi)含有低電子密度物質(zhì)，見(jiàn)圖2。

2.3 M1-exo降低BBB的跨膜電阻

建模成功的體外BBB被隨機(jī)分為3組，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給予不同的處理，48 h后檢測(cè)各組TEER，結(jié)果顯示：經(jīng)M1-exo處理后的體外BBB模型，其單位電阻較之前明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

2.4 M1-exo增加BBB的通透性

本研究檢測(cè)指示劑熒光黃從Transwell小室頂端腔透膜到達(dá)腹側(cè)腔的透過(guò)率。結(jié)果顯示：經(jīng)M1-exo處理后的體外BBB模型，其對(duì)于熒光黃的透過(guò)率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。

2.5 M1-exo降低BBB相關(guān)連接蛋白的表達(dá)

BBB是由腦微血管內(nèi)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周皮細(xì)胞、基底膜等共同組成的生理結(jié)構(gòu)。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接復(fù)合物（TightJunctions，TJs）是血腦屏障的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)以及屏障特性的主要承擔(dān)者，由閉鎖蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudins）和黏附連接分子家族（junctionaladhesionmoleculefamily，JAM），以及與他們相連的閉合小環(huán)蛋白（zonaoccludensprotein，ZO）組成。本研究用Western blot檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組4種蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與其他2組相比，b.End3 細(xì)胞+25 μg/mL M1 細(xì)胞外泌體組的Claudin-1、Occludin及ZO-1的表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5，JAM的表達(dá)雖有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這就說(shuō)明：M1-exo 降低緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin 及ZO-1的表達(dá)，而對(duì)JAM的影響較弱。

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一免疫應(yīng)答者，正常時(shí)處于靜息狀態(tài)，一旦受到損傷細(xì)胞或病原體的刺激，就會(huì)被激活分化成不同的表型，發(fā)揮神經(jīng)毒性或神經(jīng)保護(hù)功能，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中扮演著“雙刃劍”的角色，而這種根據(jù)刺激、環(huán)境和周期呈現(xiàn)出不同表型并發(fā)揮不同功能的特性，被稱(chēng)為小膠質(zhì)細(xì)胞的極化[3]。與巨噬細(xì)胞類(lèi)似，小膠質(zhì)細(xì)胞極化分為經(jīng)典激活表型M1和交替激活表型M2，前者具有促炎和殺傷作用，而后者則具有抗炎和損傷修復(fù)功能[12]。小膠質(zhì)細(xì)胞激活是多種神經(jīng)退行性疾病和缺血性卒中的共同特征，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)凋亡、興奮性毒性和壞死性死亡導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙[13]。Hu X等[14]發(fā)現(xiàn)：小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性卒中發(fā)生后的幾分鐘內(nèi)即被激活，最初主要表現(xiàn)為M2型，但在較短時(shí)間內(nèi)就逐漸轉(zhuǎn)化為M1型，進(jìn)一步的體外研究表明，正是這些M1型細(xì)胞加劇糖氧剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元損害。在大腦中動(dòng)脈閉塞模型小鼠中，M1表型的小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的TNF-α可增加血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死和BBB滲漏，加重神經(jīng)炎癥和腦水腫，導(dǎo)致不良預(yù)后[15]。Yang S等[16]認(rèn)為：活化的NF-κB能促進(jìn)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎因子，抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)則可明顯減少這些炎癥介質(zhì)的釋放，改善腦梗死后的缺血-再灌注損傷。除釋放炎性細(xì)胞因子外，越來(lái)越多的研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞還具有很強(qiáng)的外泌體分泌能力，這被認(rèn)為在卒中后的細(xì)胞微環(huán)境調(diào)控中發(fā)揮重要作用[17]。

外泌體是由各種細(xì)胞所釋放的胞外微小囊泡，直徑約為40～160 nm，內(nèi)含蛋白質(zhì)、核酸等大量活性物質(zhì)，可被靶細(xì)胞攝取后進(jìn)一步釋放信號(hào)調(diào)節(jié)因子，誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)大的下游生物效應(yīng)[18， 19]。Chen XQ等[20]發(fā)現(xiàn)經(jīng)脂多糖處理的小膠質(zhì)細(xì)胞，其所產(chǎn)生的外泌體可被PC12細(xì)胞攝取，并誘導(dǎo)和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。Zang J等[21]在動(dòng)物中風(fēng)模型和體外糖氧剝奪（OGD）模型中均證實(shí)：抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1表型，改變其外泌體的架構(gòu)和性能，可以增強(qiáng)自噬通量，保護(hù)幸存的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)突結(jié)構(gòu)免受缺血性損害。綜上所述，M1-exo在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，然而對(duì)于其作用機(jī)制仍知之甚少。本研究用LPS將小膠質(zhì)細(xì)胞激活極化為M1表型，并分離提取M1-exo。為了探索其對(duì)于血腦屏障的影響，構(gòu)建體外BBB 模型，研究發(fā)現(xiàn)：與M1-exo共培養(yǎng)后，體外BBB模型的TEER值較處理前明顯下降，對(duì)熒光黃的透過(guò)率較對(duì)照組明顯增加，構(gòu)成TJs的主要蛋白Claudin-1、Occludin及ZO-1 表達(dá)明顯下降，這一結(jié)果提示M1-exo 可以破壞BBB的完整性，增加其滲漏，影響其正常功能。

以往關(guān)于缺血性腦卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞作用機(jī)制的研究多集中在神經(jīng)炎癥的調(diào)控功能上，而本課題創(chuàng)新性地聚焦于M1表型的小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體對(duì)于血腦屏障功能的影響，這也為降低中風(fēng)后的腦缺血再灌注損傷提供了新的思路。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)尚有局限性，目前本研究?jī)H在細(xì)胞層面證實(shí)了M1-exo對(duì)于體外血腦屏障模型的破壞作用，后續(xù)課題組將進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證。