摘 要：為探索檳榔次堿抗疲勞產(chǎn)品的開發(fā)前景，通過構(gòu)建小鼠行為敏化模型，采用力竭游泳時(shí)間、血乳酸、血紅蛋白（Hb）、血尿素氮、丙二醛、肌糖原、肝糖原、伊文思藍(lán)、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、多巴胺（Dopamine，DA）和5-HT/DA值等指標(biāo)分析檳榔次堿速效抗疲勞活性及機(jī)制.結(jié)果顯示，檳榔次堿能延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間，且行為敏化可有效增強(qiáng)檳榔次堿的活性，2組行為敏化小鼠的力竭游泳時(shí)間均極顯著大于2個(gè)未敏化處理及2個(gè)對(duì)照（Plt;0.01），口腔緩釋給藥對(duì)檳榔次堿處理小鼠的力竭游泳時(shí)間也有促進(jìn)作用.檳榔次堿可抑制游泳小鼠血乳酸、丙二醛和血尿素氮的積累，緩解Hb和DA水平的降低，減弱腦內(nèi)5-HT的升高，抑制肌糖原和肝糖原的耗竭，阻礙腦內(nèi)5-HT/DA值的升高，增強(qiáng)血腦屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）的通透性，且行為敏化和口腔緩釋給藥能增強(qiáng)上述效果.檳榔次堿可通過抑制氧運(yùn)輸?shù)鞍姿浇档?、平衡中樞神?jīng)遞質(zhì)、降低代謝產(chǎn)物積累和能量物質(zhì)消耗，并調(diào)節(jié)BBB通透性使腦內(nèi)5-HT擴(kuò)散到血液中，降低5-HT對(duì)大腦興奮的抑制，從而發(fā)揮抗疲勞作用.檳榔次堿只有通過口腔緩釋給藥才能對(duì)行為敏化的機(jī)體揮卓越的速效抗疲勞活性，速效抗疲勞的原因可能是檳榔次堿通過口腔黏膜吸收，避免腸胃的首過效應(yīng)，迅速增加進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng).該研究可為檳榔次堿速效抗疲勞產(chǎn)品研發(fā)提供理論支撐.

關(guān)鍵詞：檳榔次堿；血腦屏障；速效抗疲勞；神經(jīng)遞質(zhì)；行為敏化

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Study on the quick-acting antifatigue activity of arecaidine and its mechanism of anti-fatigue by regulating the blood brain barrier

LIU Shu-wei^1，2， ZHANG Tian-tian¹， WANG Yan^1*， WU Tian-ming¹

（1.Sanya Key Laboratory of Functional Areca-nut Research， Hainan Tropical Ocean University， Sanya 572022， China; 2.School of Life Sciences， National Engineering Laboratory for Druggable Gene and Protein Screening， Northeast Normal University， Changchun 130024， China）

Abstract：To explore the development prospects of arecaidine anti fatigue products，a mouse behavioral sensitization model was constructed to analyze the quick-acting anti fatigue activity and its mechanism of arecaidine by using indicators such as the exhaustive swimming time，blood lactate，hemoglobin （Hb），blood urea nitrogen，malondialdehyde，muscle glycogen，liver glycogen，Evans blue，5-hydroxytryptamine （5-HT），dopamine （DA） and 5-HT/DA value.The results showed that arecaidine could prolong the exhaustive swimming time of mice，and behavioral sensitization could effectively enhance the activity of arecaidine.The exhaustive swimming time of both treatments of behavioral sensitized mice was significantly longer than that of two non sensitized treatments and two controls （Plt;0.01）.Oral sustained-release administration also promoted the activity of arecaidine.Arecaidine can inhibit the accumulation of blood lactate，malondialdehyde and blood urea nitrogen in swimming mice，and alleviate the decrease in Hb and DA levels，and weaken the increase of 5-HT in the brain，and inhibit the depletion of muscle glycogen and liver glycogen，and hinder the increase of 5-HT/DA values in the brain，and enhance the permeability of the blood-brain barrier （BBB），Moreover，and behavioral sensitization and oral sustained-release administration can enhance the above effects.Arecaidine can exert anti fatigue effects by inhibiting the decrease of oxygen transport protein levels，balancing central neurotransmitters，reducing the accumulation of metabolites and energy consumption，regulating BBB permeability to allow 5-HT in the brain to diffuse into the bloodstream，and reducing the inhibition of 5-HT on brain excitation.Arecaidine can only exert excellent quick-acting anti fatigue activity on behavior sensitized organisms through oral sustained-release administration，the reason may be that arecaidine is absorbed through the oral mucosa，avoiding the first pass effect of the gastrointestinal tract and rapidly increasing its entry into the bloodstream.This study can provide theoretical support for the development of quick-acting anti fatigue products of arecaidine.

Key words：arecaidine; blood-brain barrier; quick-acting anti-fatigue; neurotransmitter; behavioral sensitization

0 引言

檳榔樹（Areca catechu L.）是一種具有熱帶特色的喬木，主要分布在印度、馬來西亞和中國(guó)等亞洲的熱帶地區(qū).檳榔是檳榔樹的果實(shí)，俗稱洗瘴丹、藥餞、大腹皮和檳榔子等，是華南地區(qū)重要的南藥和黎藥，位居我國(guó)“四大南藥”之首^［1］，并于1953年列入《中華人民共和國(guó)藥典》，其中含檳榔的方劑有檳榔四消丸、四磨湯和健胃消食片等^［2］.檳榔入藥和食用歷史悠久，不僅用于治療寄生蟲、食積氣滯、食欲不振、腹痛脹滿和瘧疾等病癥，還可用于抗疲勞，甚至作為強(qiáng)心劑和收斂劑使用^{［3，4］}.檳榔得抗疲勞活性具有速效性，比咖啡和茶葉等抗疲勞產(chǎn)品的起效時(shí)間和藥效時(shí)間均短，所以不會(huì)影響晚上睡眠.檳榔卓越的抗疲勞活性使其以口腔嗜好品的形式流行于熱帶亞洲，是僅次于咖啡因、尼古丁和酒精的全球第四大口腔嗜好品^［5，6］.海南省、湖南省和臺(tái)灣省是我國(guó)檳榔抗疲勞產(chǎn)品的主要消費(fèi)市場(chǎng)，近年來，其消費(fèi)群體逐漸擴(kuò)大，并以驚人的速度向全國(guó)拓展.檳榔生物堿是檳榔的特征性成分，其中檳榔次堿是檳榔中的重要生物堿之一，天然存在于檳榔中，也可由檳榔堿在堿性條件下水解獲得，具有多種生物活性^［7］.

機(jī)體疲勞是復(fù)雜的生理生化過程，疲勞的原因主要來自外周和中樞兩方面^［8］.外周疲勞是劇烈或長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致肌肉疼痛、耐力下降和身體虛弱的狀態(tài)，在生理生化指標(biāo)上表現(xiàn)為肝糖原、肌糖原等能源物質(zhì)的消耗，血乳酸（Blood Lactate Acid，BLA）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）等代謝產(chǎn)物的積累，以及氧運(yùn)輸特殊蛋白質(zhì)血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）水平的降低^{［9，10］}.中樞疲勞的產(chǎn)生表現(xiàn)為神經(jīng)遞質(zhì)失衡，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)無法充分驅(qū)動(dòng)肌肉的衰竭等^［11］.本研究通過構(gòu)建小鼠敏化模型，測(cè)定和分析小鼠的力竭游泳時(shí)間、能量物質(zhì)消耗、代謝產(chǎn)物積累、氧運(yùn)輸?shù)鞍姿?、BBB通透性、神經(jīng)遞質(zhì)水平，分析行為敏化和給藥方式對(duì)檳榔次堿抗疲勞作用的影響，探索檳榔次堿抗疲勞的機(jī)理，為檳榔次堿抗疲勞產(chǎn)品研發(fā)提供理論支撐.

1 材料與方法

1.1 聚丙烯給藥球制備

為實(shí)現(xiàn)口腔持續(xù)緩慢給藥，采用聚丙烯做成適當(dāng)大小的空心給藥球，使給藥球放入小鼠口腔后不被小鼠吐出或吞下，且可在口腔內(nèi)滾動(dòng).給藥球表面均勻分布適當(dāng)大小的孔，球內(nèi)放入含檳榔次堿的樣品，使樣品能持續(xù)給藥10 min.

1.2 供試動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為4周齡，表現(xiàn)無異常，無特定病原體的雄性KM小鼠（SPF級(jí)），體重為18±2g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004.將小鼠置于海南省三亞市功能檳榔重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)7 d，溫度為22±3 ℃，光照為12 h/d，以SPF級(jí)小鼠專用維持飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥公司）喂養(yǎng)，自由采食及飲水.試驗(yàn)操作遵守中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的相關(guān)規(guī)定，使試驗(yàn)動(dòng)物痛苦最小化.

1.3 動(dòng)物敏化模型

動(dòng)物行為敏化參考姚敏等^［12］的方法并稍作修改，小鼠敏化的4個(gè)階段分別為預(yù)適應(yīng)（2 d）、形成期（7 d）、轉(zhuǎn)化期（7 d）和表達(dá)期（1 d），共17d（圖1）.預(yù)適應(yīng)（d1-d2），模型組和非敏組均采用生理鹽水灌胃，1次/d，劑量為20.0 mL·kg^-1；形成期（d3-d9），即藥物處理期，模型組經(jīng)口灌胃給藥，1次/d，給藥量為20.0 mg·kg^-1（檳榔次堿濃度為1.0 mg·mL^-1），非敏組采用等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥7 d，給藥前禁食8 h，給藥后禁食1 h；轉(zhuǎn)化期（7 d），即藥物撤離期，正常飼養(yǎng)7天，無給藥處理；表達(dá)期（1 d），即采用檳榔次堿激發(fā)動(dòng)物的行為敏化表現(xiàn)，劑量為10.0 mg·kg^-1.敏化結(jié)束后淘汰敏化效果不佳的小鼠.此外，每?jī)商爝M(jìn)行一次無負(fù)重游泳鍛煉，每次10 min.

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB15193-2014）^［13］開展實(shí)驗(yàn).首先構(gòu)建“6組實(shí)驗(yàn)鼠”：取8只敏化的模型組小鼠，隨機(jī)分為2組；另取16只非敏化小鼠，隨機(jī)分為4組，每組4只.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：共分為6個(gè)組（圖1），包括4個(gè)處理組（灌胃+敏化、灌胃+非敏化、口腔緩釋給藥+敏化、口腔緩釋給藥+非敏化）及2個(gè)對(duì)照組（游泳對(duì)照、安靜對(duì)照），各處理組及游泳對(duì)照組的小鼠參與力竭游泳運(yùn)動(dòng)，安靜對(duì)照組不參與.處理組劑量為10.0 mg·kg^-1，對(duì)照組為等體積的生理鹽水.給藥方式分別采用灌胃和口腔緩釋給藥，口腔緩釋給藥采用給藥球，給藥時(shí)間為10 min.

取處理組和游泳對(duì)照組開展力竭游泳實(shí)驗(yàn)并記錄力竭時(shí)間，以5組中最短力竭時(shí)間為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的游泳時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸椎脫臼處死小鼠.另取構(gòu)建的“6組實(shí)驗(yàn)鼠”，給藥10 min后開展小鼠游泳運(yùn)動(dòng)，游泳時(shí)長(zhǎng)為“最短力竭時(shí)間”，游泳后腹腔麻醉小鼠，測(cè)定MDA、Hb、BLA、BUN、肌糖原、肝糖原以及神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和多巴胺（Dopamine，DA）.再取構(gòu)建的“6組實(shí)驗(yàn)鼠”，給藥后，尾靜脈注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的伊文思藍(lán)（Evans blue，EB）溶液，劑量為4 mL/kg，小鼠全身變藍(lán)說明注射EB成功.10 min后，開展小鼠游泳運(yùn)動(dòng)，游泳時(shí)長(zhǎng)為“最短力竭時(shí)間”，頸椎脫臼處死小鼠，取大腦，測(cè)定EB含量.

1.5 力竭游泳耐力測(cè)定

小鼠尾根部用鉛絲負(fù)重5%體質(zhì)量，在35 ℃的恒溫蒸餾水中開展力竭游泳試驗(yàn)（水深40 cm），輕放小鼠于水面并計(jì)時(shí)，以沒入水中10 s內(nèi)不能浮起自由呼吸為力竭標(biāo)準(zhǔn)，記錄力竭游泳時(shí)間.若小鼠靜止浮在水面用鼻孔呼吸，需驅(qū)逐使其游泳^［14］.

1.6 BLA、MDA、BUN和Hb測(cè)定

小鼠游泳后（最短力竭時(shí)間），腹腔麻醉小鼠，摘眼球采血，室溫靜置2 h，1 000×g離心20 min分離血清和紅細(xì)胞，獲得血清、血漿和血細(xì)胞.采用小鼠ELISA試劑盒測(cè)定MDA含量.采用氰化高鐵比色法測(cè)量血紅蛋白（Hb）^［10］.采用血乳酸試劑盒測(cè)量乳酸（Lactate acid，LA）^［14］.BUN測(cè)定參考郭云聰^［15］的方法，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）并按照ELISA試劑盒說明書中的操作步驟檢測(cè).

1.7 DA和5-HT測(cè)定

DA和5-HT的測(cè)定參考余煊^［16］的方法并稍作修改，在摘小鼠眼球采血后，冰上矢狀縫切開腦顱，取左右大腦，可于-80 ℃冰箱暫存.采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）（上海臻科生物）測(cè)定大腦中DA和5-HT的含量.

1.8 肌糖原和肝糖原測(cè)定

取腦后，取肝臟和骨骼肌，以生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，按照肌糖原測(cè)定試劑盒和肝糖原測(cè)定試劑盒要求分別測(cè)定肌糖原和肝糖原^［10］.

1.9 血腦屏障通透性檢測(cè)

采用EB染色法檢測(cè)BBB通透性，參考鄭文旭等^［17］方法并稍作修改.力竭游泳后腹腔麻醉小鼠，剖開胸腔，剪開心臟右心耳，將生理鹽水從左心室灌注至流出液無色透明.冰上取腦，矢狀縫切開左右腦，每100 mg腦組織加入1.0 mL甲酰胺溶液，冷凍研磨勻漿，37 ℃孵育48 h，勻漿，18 360×g離心20 min，取上清液于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算EB含量，單位為μg/mL.

1.10 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS.19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和正態(tài)分布分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，極顯著水平為Plt;0.01，顯著水平為Plt;0.05，采用Excel進(jìn)行表格等處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 檳榔次堿對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響

力竭游泳是測(cè)定小鼠耐力的重要指標(biāo)，可直觀反映小鼠的耐力.由圖2可知，行為敏化處理能顯著提高小鼠的力竭游泳時(shí)間，“口腔緩釋給藥+敏化”和“灌胃+敏化”兩個(gè)敏化處理組的小鼠力竭游泳時(shí)間均極顯著高于其他處理以及游泳對(duì)照組（Plt;0.01），尤其是“口腔緩釋給藥+敏化”組效果最明顯，其力竭游泳時(shí)間最長(zhǎng)，其值為（697.5±70.3）s.

口腔緩釋給藥也能影響小鼠的力竭游泳時(shí)間，特別是影響被敏化的小鼠，口腔緩釋給藥的敏化小鼠力竭游泳時(shí)間極顯著高于灌胃給藥（Plt;0.01），但對(duì)非敏化的小鼠影響不明顯（Pgt;0.05）.此外，游泳對(duì)照組小鼠力竭游泳時(shí)間最短，其值為（144.75±25.0）s，因此將取整后的145 s確定為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的游泳時(shí)間.

2.2 檳榔次堿處理對(duì)血液中代謝產(chǎn)物積累和Hb的影響

2.2.1 檳榔次堿處理對(duì)BLA的影響

劇烈運(yùn)動(dòng)消耗體內(nèi)大量能量并導(dǎo)致機(jī)體缺氧，機(jī)體中的肌糖原發(fā)生快速糖酵解供能，缺氧下酵解生成為大量乳酸，使組織pH值下降，內(nèi)環(huán)境平衡被破壞，代謝紊亂，肌肉收縮力下降^［18-20］.因此，BLA積累是運(yùn)動(dòng)性疲勞的一個(gè)重要指標(biāo).圖3顯示，游泳運(yùn)動(dòng)使小鼠BLA水平升高，而檳榔次堿處理能抑制其升高.與游泳對(duì)照比較，4個(gè)處理小鼠BLA水平均極顯著低于游泳對(duì)照（Plt;0.01），其中“口腔緩釋給藥+敏化”組抑制效果最優(yōu)，其BLA水平僅為（3.95±0.79）mmol/L，低于其他3個(gè)處理.同時(shí)發(fā)現(xiàn)，是否敏化及給藥方式對(duì)檳榔次堿抑制游泳小鼠BLA升高不同，檳榔次堿處理對(duì)敏化的小鼠BLA抑制效果優(yōu)于非敏化的小鼠，口腔緩釋給藥效果優(yōu)于灌胃.總之，檳榔次堿對(duì)小鼠BLA的抑制效果順序?yàn)椤翱谇痪忈尳o藥+敏化”組＞“灌胃+敏化”組＞“口腔緩釋給藥+非敏化”組＞“灌胃+非敏化”組.

2.2.2 檳榔次堿處理對(duì)血液中MDA的影響

劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于機(jī)體缺氧產(chǎn)生大量自由基并攻擊膜內(nèi)多不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而擾亂細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性，并使核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物分子損傷，致使細(xì)胞膜生理功能被破壞，從而降低機(jī)體工作能力，產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象^{［20，21］}.MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一種終產(chǎn)物被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物^［22］，MDA不僅可進(jìn)一步促進(jìn)自由基的產(chǎn)生，還能降解為可共價(jià)修飾蛋白質(zhì)和核酸的活性化合物^［23］，進(jìn)一步降低機(jī)體的工作能力，所以MDA水平也是反映機(jī)體疲勞的一個(gè)指標(biāo).圖4顯示，游泳小鼠血液中的MDA水平均升高，除“口腔緩釋給藥+敏化”組外，其他處理均顯著高于安靜對(duì)照（Plt;0.05）.與游泳對(duì)照相比，敏化組的MDA水平均極顯著低于游泳對(duì)照，“口腔緩釋給藥+非敏化”組顯著低于游泳對(duì)照（Plt;0.05），“灌胃+非敏化”組與游泳對(duì)照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）.可見，檳榔次堿抑制敏化處理的小鼠血液中的MDA水平的升高效果優(yōu)于非敏化組，同時(shí)抑制口腔緩釋給藥小鼠血液中的MDA水平的升高優(yōu)于灌胃小鼠.

2.2.3 檳榔次堿處理對(duì)BUN的影響

血尿素氮作為蛋白質(zhì)的代謝終產(chǎn)物，在機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)加速分解蛋白質(zhì)導(dǎo)致BUN水平升高，因此BUN可作為機(jī)體疲勞的敏感指標(biāo)^［24］.

圖5顯示，運(yùn)動(dòng)使BUN水平升高，4個(gè)處理BUN水平均高于安靜對(duì)照，4個(gè)處理也均抑制了BUN水平的升高，其中，“口腔緩釋給藥+敏化”組的BUN水平最低，其值僅為（8.36±0.85）mmol/L.與游泳對(duì)照比較，“灌胃+非敏化”組與之差異不顯著（Pgt;0.05），其他3個(gè)處理均極顯著低于游泳對(duì)照（Plt;0.01），4個(gè)處理小鼠BUN水平高低順序?yàn)椤肮辔?非敏化”組＞“口腔緩釋給藥+非敏化”組＞“灌胃+敏化”組＞“口腔緩釋給藥+敏化”組.比較敏化因素和給藥方式對(duì)檳榔次堿抑制BUN水平升高的效果發(fā)現(xiàn)，敏化處理和口腔緩釋給藥均能增強(qiáng)檳榔次堿抑制BUN水平升高的作用，且敏化處理和口腔緩釋給藥具有協(xié)同增效作用.

2.2.4 檳榔次堿處理對(duì)Hb的影響

Hb是運(yùn)輸O₂和CO₂的載體，其運(yùn)載能力可反映機(jī)體代謝率和活動(dòng)強(qiáng)度.機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)引起紅細(xì)胞載氧量增加，胞內(nèi)氧分壓升高，氧的運(yùn)輸加快，造成細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致紅細(xì)胞被破壞，紅細(xì)胞的Hb被用于肌肉中蛋白質(zhì)的重新合成和再生，甚至將Hb分解供能，所以，Hb水平可反映動(dòng)物的疲勞程度^［25］.圖6顯示，4個(gè)處理Hb水平均低于安靜對(duì)照，且均高于游泳對(duì)照，說明檳榔次堿具有抑制游泳小鼠Hb水平降低的作用，抑制效果最好者為“口腔緩釋給藥+敏化”組，其Hb水平為（120.03±11.68）g/L，接近安靜對(duì)照（Pgt;0.05），并顯著高于其他3個(gè)處理和游泳對(duì)照（Plt;0.05）；其次是“灌胃+敏化”組，其Hb水平極顯著高于非敏化小鼠及游泳對(duì)照小鼠的Hb水平；第三是“口腔緩釋給藥+非敏化”組，其Hb水平僅略高于“灌胃+非敏化”組（Pgt;0.05）.可見，檳榔次堿抑制游泳小鼠Hb水平降低與小鼠行為敏化和給藥方式有密切關(guān)系.

2.3 檳榔次堿對(duì)小鼠肝糖原、肌糖原及肝臟肌肉中MDA的影響

動(dòng)物能源物質(zhì)耗竭是引起機(jī)體疲勞的一個(gè)重要原因，肌糖原耗竭與體力衰竭同時(shí)發(fā)生.劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌糖原首先發(fā)生糖酵解供能，隨著肌糖原含量的降低，工作肌優(yōu)先攝取血糖維持能量代謝，為維持血糖水平，肝糖原分解為葡萄糖并補(bǔ)充到血液中.隨著肌糖原和肝糖原的過量消耗，血糖無法得到有效補(bǔ)充，血糖濃度降低，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)供能不足，發(fā)生機(jī)體疲勞現(xiàn)象^［20］.因此，糖原水平與機(jī)體疲勞程度密切相關(guān)，肌糖原和肝糖原成為反映疲勞的重要指標(biāo)，動(dòng)物體內(nèi)肝糖原和肌糖原含量越高，其運(yùn)動(dòng)耐受力越強(qiáng).此外，MDA在肝臟和肌肉中的積累也影響這機(jī)體的疲勞.

2.3.1 檳榔次堿對(duì)肌糖原和工作肌中MDA的影響

圖7顯示，游泳使小鼠肌糖原呈下降趨勢(shì)，處理組及游泳對(duì)照的小鼠肌糖原水平均低于安靜對(duì)照，但是檳榔次堿抑制了肌糖原的降低，抑制效果最佳者為“口腔緩釋給藥+敏化”組，其肌糖原水平為（1.67±0.11）mg/g，顯著高于其他3個(gè)處理及游泳對(duì)照（Plt;0.05），且其值接近安靜對(duì)照，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）.比較敏化因素的影響發(fā)現(xiàn)，檳榔次堿有利于緩解敏化小鼠的肌糖原下降，2個(gè)敏化處理均高于非敏化處理；比較給藥方式發(fā)現(xiàn)，口腔緩釋給藥比灌胃給藥更有利于檳榔次堿緩解的肌糖原下降，相同的敏化條件下，2組口腔緩釋給藥處理均高于對(duì)應(yīng)的灌胃給藥.

圖8顯示，檳榔次堿可緩解游泳小鼠工作肌中的MDA積累，其中“口腔緩釋給藥+敏化”組緩解效果最好，其MDA水平為（0.27±0.03）μmol/g-tissue，顯著低于檳榔次堿處理的非敏化小鼠及游泳對(duì)照（Plt;0.05）；其次為“灌胃+敏化”組，第三為“口腔緩釋給藥+非敏化”組，最差的為“灌胃+非敏化”組.可見，檳榔次堿能抑制游泳小鼠肌糖原水平的降低，緩解工作肌中MDA的積累，且敏化處理和口腔緩釋給藥能增強(qiáng)上述效果.

2.3.2 檳榔次堿對(duì)肝糖原和肝臟中MDA的影響

圖9顯示，檳榔次堿可抑制游泳小鼠肝糖原水平的降低，與游泳對(duì)照比較，處理組均極顯著高于游泳對(duì)照（Plt;0.01），其中“口腔緩釋給藥+敏化”組肝糖原水平最高，其值為（15.98±1.20）mg/g，接近安靜對(duì)照（Pgt;0.05），并極顯著高于其他3個(gè)處理及游泳對(duì)照；其次為“灌胃+敏化”組，其值顯著高于2組非敏化處理及游泳對(duì)照（Plt;0.05）；第三為“口腔緩釋給藥+非敏化”組，其值極顯著高于“灌胃+非敏化”組及游泳對(duì)照（Plt;0.01）；“灌胃+非敏化”組效果最差.分析敏化因素和給藥方式的影響發(fā)現(xiàn)，2組敏化小鼠肝糖原水平均顯著高于2組非敏化小鼠；在相同的敏化條件下，口腔緩釋給藥均極顯著高于灌胃給藥（Plt;0.01）.

圖10顯示，4個(gè)檳榔次堿處理均可緩解游泳小鼠肝臟MDA的積累，其中2個(gè)敏化組小鼠肝臟中的MDA水平極顯著低于游泳對(duì)照（Plt;0.01），且口腔緩釋給藥的敏化小鼠極顯著低于灌胃給藥的敏化小鼠.比較給藥方式的影響發(fā)現(xiàn)，在同樣的敏化條件下，口腔緩釋給藥小鼠MDA水平低于灌胃給藥.由此說明敏化和口腔緩釋給藥可有效抑制肝臟中MDA的積累，緩解了游泳小鼠的機(jī)體疲勞.

2.4 檳榔次堿對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

神經(jīng)遞質(zhì)失衡是機(jī)體中樞疲勞的重要原因，神經(jīng)遞質(zhì)的積累或消耗均可影響中樞疲勞，尤其是5-HT和DA，它們與中樞疲勞密切相關(guān)，當(dāng)中樞疲勞發(fā)生時(shí)，其在大腦中的濃度發(fā)生變化，因此可通過測(cè)定大腦和血液中5-HT和DA含量來預(yù)測(cè)和分析中樞疲勞^［26］.

2.4.1 檳榔次堿對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT水平的影響

5-HT是一種單胺類抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，亦稱血清素，可調(diào)節(jié)情緒、認(rèn)知、獎(jiǎng)勵(lì)、記憶、睡眠-覺醒周期和社交能力^［27］.圖11顯示，與安靜對(duì)照比較，游泳使小鼠大腦內(nèi)5-HT水平上升，檳榔次堿處理對(duì)其升高具有抑制作用，其中，在相同的給藥方式條件下，檳榔次堿對(duì)敏化小鼠抑制效果優(yōu)于非敏化小鼠，5-HT水平差異均顯著（Plt;0.05）；在相同的敏化條件下，2組口腔緩釋給藥小鼠腦內(nèi)5-HT水平均低于灌胃給藥小鼠.血液中5-HT 濃度方面，圖11顯示，與安靜對(duì)照比較，游泳使小鼠血液中的5-HT水平略有升高，但差異均不顯著（Pgt;0.05）.結(jié)合腦內(nèi)5-HT數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，“口腔緩釋給藥+敏化”組腦內(nèi)5-HT水平最低，其值為（189.9±10.7）ng/g，但是該處理組血液中的5-HT水平卻最高，比較其他3組也發(fā)現(xiàn)相同的規(guī)律，即當(dāng)腦內(nèi)5-HT水平較低時(shí)，血液中的5-HT水平較高，當(dāng)腦內(nèi)5-HT水平較高時(shí)，血液中的5-HT水平卻較低，反之則反.

2.4.2 檳榔次堿對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)DA水平的影響

DA不僅是促進(jìn)機(jī)體興奮的單胺類興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，還是一種促進(jìn)血管擴(kuò)張的擴(kuò)張劑，在機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，DA可通過改變肺血管張力來調(diào)節(jié)肺毛細(xì)血管血容量，提高血液氧運(yùn)輸能力^{［16，28］}.圖12顯示，檳榔次堿處理可抑制游泳小鼠腦內(nèi)DA水平降低，其中“口腔緩釋給藥+敏化”組抑制效果最明顯，DA水平為（38.23±0.89）ng/g，極顯著高于其他處理及游泳對(duì)照（Plt;0.01），并接近安靜對(duì)照，與之差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）.其他3個(gè)處理腦內(nèi)DA水平接近（Pgt;0.05），但均極顯著高于游泳對(duì)照（Plt;0.01）.敏化處理和口腔緩釋給藥均能增強(qiáng)檳榔次堿對(duì)腦內(nèi)DA水平降低的抑制作用.小鼠血液中的DA含量方面，圖12顯示，4個(gè)處理及游泳對(duì)照血液中DA水平均高于安靜對(duì)照，但與安靜對(duì)照差異均不顯著（Pgt;0.05）.分析認(rèn)為游泳小鼠血液中DA升高可能與機(jī)體需要DA擴(kuò)張肺血管促進(jìn)氧運(yùn)輸而調(diào)高DA值有關(guān)，其機(jī)制需要進(jìn)一步研究.

2.4.3 檳榔次堿對(duì)5-HT/DA值的影響

中樞疲勞是多種神經(jīng)遞質(zhì)共同參與作用的結(jié)果，神經(jīng)遞質(zhì)之間的協(xié)同和拮抗作用是非常復(fù)雜的，其中5-HT和DA是兩個(gè)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT/DA值是影響中樞疲勞的重要參數(shù)，低比值有利于機(jī)體興奮，高比值會(huì)增加機(jī)體疲勞^［29］.圖13顯示，4個(gè)處理組及游泳對(duì)照的小鼠腦內(nèi)5-HT/DA值均高于未游泳的小鼠，而檳榔次堿處理可抑制5-HT/DA值的升高，與游泳對(duì)照比較，各處理5-HT/DA值均極顯著低于游泳對(duì)照（Plt;0.01），其中“口腔緩釋給藥+敏化”組5-HT/DA值最低，其值為（4.97±0.33），極顯著低于其他處理組及游泳對(duì)照，并與安靜對(duì)照的值相當(dāng)（Pgt;0.05）.分析敏化因素對(duì)其影響發(fā)現(xiàn)，在相同的給藥方式條件下，敏化小鼠5-HT/DA值均低于非敏化小鼠（Pgt;0.05）.比較給藥方式發(fā)現(xiàn)，在相同的敏化條件下，口腔緩釋給藥小鼠5-HT/DA值低于灌胃給藥小鼠.以上數(shù)據(jù)說明小鼠行為敏化和口腔緩釋給藥有利于提高檳榔次堿抗疲勞的效果.

2.5 檳榔次堿對(duì)小鼠血腦屏障通透性的影響

BBB是腦組織和血液之間的一道生理屏障，對(duì)物質(zhì)的進(jìn)出具有高度的選擇性，在穩(wěn)定中樞神經(jīng)系統(tǒng)中扮演重要角色^［30］.正常狀態(tài)下，EB無法穿越BBB，只有在BBB通透性增加時(shí)EB才能穿越BBB.圖14顯示，游泳對(duì)照和安靜對(duì)照小鼠EB水平差異不顯著，說明游泳對(duì)BBB的通透性影響不大.4個(gè)檳榔次堿處理提高了腦內(nèi)EB水平，其中“口腔緩釋給藥+敏化組EB水平最高，其值為（11.18±0.98）μg/g-tissue，極顯著高于其他處理組及兩個(gè)對(duì)照（Plt;0.01）；其次為“灌胃+非敏化”組（Plt;0.01），其EB水平極顯著高于2組非敏化的小鼠及2個(gè)對(duì)照（Plt;0.01）；第三為“口腔緩釋給藥+非敏化”組，其EB水平顯著高于另一個(gè)非敏化處理的小鼠及2個(gè)對(duì)照（Plt;0.05）；“灌胃+非敏化”組效果最差，其EB水平盡管高于2個(gè)對(duì)照，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.可見，敏化處理和口腔緩釋給藥有利于提高小鼠腦內(nèi)EB水平，說明兩種因素可以增強(qiáng)檳榔次堿調(diào)控BBB通透性的作用.

2.6 抗疲勞機(jī)理分析

機(jī)體疲勞是一個(gè)復(fù)雜的過程，伴隨一系列生理生化反應(yīng)，它是動(dòng)物長(zhǎng)期進(jìn)化的一種自我保護(hù)機(jī)制.機(jī)體疲勞綜合表現(xiàn)為耐力下降甚至力竭，耐力作為評(píng)價(jià)機(jī)體疲勞的一個(gè)綜合指標(biāo)，通常采用力竭游泳時(shí)間量化.本研究表明，檳榔次堿可提高小鼠力竭游泳時(shí)間，檳榔次堿行為敏化處理和口腔緩釋給藥有利于延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間.機(jī)體疲勞受多種因素影響，一般認(rèn)為代謝產(chǎn)物堆積、Hb水平、能量物質(zhì)耗竭和中樞神經(jīng)遞質(zhì)失衡等是機(jī)體疲勞的主要原因^［9］.

代謝產(chǎn)物積累方面：第一，LA和MDA積累，劇烈運(yùn)動(dòng)引起的組織缺氧，使糖原發(fā)生無氧糖酵解產(chǎn)生大量LA^［31］，并產(chǎn)生大量自由基，過量自由基引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，致使MDA積累^［21］；第二、BUN積累，劇烈運(yùn)動(dòng)也導(dǎo)致氨基酸和蛋白質(zhì)的分解代謝，促進(jìn)BUN水平的升高和積累^［32］.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，檳榔次堿能降低血液中LA、MDA和BUN的積累以及肌肉和肝臟中MDA的積累.且行為敏化和口腔緩釋給藥能加強(qiáng)檳榔次堿的作用效果.

Hb水平降低方面：Hb作為氧運(yùn)輸?shù)闹匾d體也是衡量耐力的一個(gè)指標(biāo)，劇烈運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的組織缺氧可引起Hb水平的降低^［33］，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，檳榔次堿可顯著抑制游泳小鼠Hb水平的降低，抑制效果能被行為敏化和口腔緩釋給藥加強(qiáng).

能量物質(zhì)消耗方面：能量物質(zhì)是動(dòng)物運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力來源，能量物質(zhì)水平可反映機(jī)體疲勞的狀況.肌糖原和肝糖原作為機(jī)體直接的能量來源物質(zhì)，其水平能反映機(jī)體疲勞狀況.當(dāng)動(dòng)物劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，糖原分解加快，糖原水平過低導(dǎo)致機(jī)體疲勞^{［31，34］}.數(shù)據(jù)顯示，檳榔次堿通過口腔緩釋給藥能有效抑制劇烈運(yùn)動(dòng)小鼠肌糖原和肝糖原的降低，從而發(fā)揮抗疲勞作用，而且行為敏化能增強(qiáng)檳榔次堿的抑制作用.

中樞遞質(zhì)失衡方面：中樞神經(jīng)遞質(zhì)作為信息傳遞的重要化學(xué)物質(zhì)，在機(jī)體中扮演著重要角色，中樞遞質(zhì)失衡是導(dǎo)致機(jī)體疲勞的另一個(gè)重要的因素，運(yùn)動(dòng)引起的神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和DA等濃度的變化會(huì)導(dǎo)致疲勞的發(fā)生^［8］，而且5-HT/DA值與疲勞程度呈正相關(guān)^［26］.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，檳榔次堿可以緩解游泳小鼠5-HT水平的升高、DA水平的降低以及5-HT/DA值的變大，行為敏化和口腔緩釋給藥能增強(qiáng)檳榔次堿的作用效果.

BBB通透性方面：BBB作為維持腦微環(huán)境平衡的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，可避免大腦遭受有害的血源性、內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的侵害^［35］，BBB通透性可被人參皂苷^［36］、谷氨酸^［37］、冰片^［38］和一氧化氮^［39］等化合物調(diào)節(jié).本研究發(fā)現(xiàn)，檳榔次堿也可調(diào)增BBB的通透性，行為敏化和口腔緩釋給藥可提高檳榔次堿的作用效果.結(jié)合5-HT和DA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，游泳后的小鼠腦內(nèi)和血液中的5-HT水平具有負(fù)相關(guān)性，而且腦內(nèi)5-HT水平與BBB通透性呈負(fù)相關(guān)，所以檳榔次堿抗疲勞機(jī)理可能是其通過調(diào)控BBB通透性，腦內(nèi)5-HT通過BBB擴(kuò)散到血液中，從而減弱5-HT對(duì)小鼠興奮的抑制作用，促使小鼠興奮.但DA數(shù)據(jù)沒有相同的規(guī)律，其機(jī)制仍需進(jìn)一步探索.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述抗疲勞指標(biāo)均可被行為敏化和口腔緩釋給藥加強(qiáng).行為敏化處理提高檳榔次堿抗疲勞作用，說明檳榔次堿抗疲勞需要機(jī)體對(duì)其形成依賴性，其機(jī)理可能與其他成癮物質(zhì)相同.同時(shí)，檳榔次堿對(duì)具有檳榔次堿嗜好（或依賴）的機(jī)體才能表現(xiàn)出更突出的抗疲勞作用，可以詮釋檳榔對(duì)嗜好者具有抗疲勞作用，而對(duì)非嗜好者抗疲勞作用不明顯的原因.口腔緩釋給藥可提高檳榔次堿抗疲勞作用說明檳榔次堿可通過口腔黏膜吸收，避免了腸胃的首過效應(yīng)，詮釋了嚼食檳榔速效抗疲勞的原因.

基于檳榔次堿調(diào)控BBB通透性致使5-HT對(duì)大腦興奮的抑制作用降低，分析認(rèn)為上述檳榔次堿緩解機(jī)體代謝產(chǎn)物積累、能量物質(zhì)消耗和Hb水平降低的作用與神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的變化有密切關(guān)系，可能是腦內(nèi)5-HT的變化進(jìn)一步調(diào)控了上述各指標(biāo)，最終表現(xiàn)為檳榔次堿的抗疲勞作用，神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)其他抗疲勞指標(biāo)的影響機(jī)理需要進(jìn)一步研究和證明.

3 結(jié)論

檳榔次堿可通過抑制代謝產(chǎn)物的積累、緩解供氧不足、減弱能量物質(zhì)消耗、提高BBB通透性和平衡中樞遞質(zhì)發(fā)揮抗疲勞作用，行為敏化和口腔緩釋給藥均可提高檳榔次堿的抗疲勞作用.該研究可為檳榔產(chǎn)品精深加工提供技術(shù)支撐，為功能性檳榔產(chǎn)品研發(fā)提供新思路.

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