關(guān)鍵詞：姜荷花；SSR；雜交F1 代；雜交鑒定；遺傳多樣性

中圖分類號：S682.29 文獻標(biāo)志碼：A

姜荷花（Curcuma alismatifolia Gagnep.）為姜科姜黃屬，原產(chǎn)于泰國北部，是一種多年生草本植物，在中國南部有大量的引種栽培。姜荷花生長期喜歡溫暖、潮濕、陽光充足的氣候，是優(yōu)良的花卉植物，可應(yīng)用于切花、盆花、花壇和花田，在園林應(yīng)用方面具有非常明顯的優(yōu)勢[1-2]。

國內(nèi)對姜荷花引種適應(yīng)性、生長習(xí)性和栽培技術(shù)、苗木繁殖、組培、新品種選育、病蟲害防治、種球貯藏技術(shù)和切花保存等方面進行了較為系統(tǒng)的研究[3-6]。這些研究極大地促進了國內(nèi)姜荷花市場的發(fā)展，但在利用姜荷花資源進行育種方面的工作還很薄弱。雜交育種是園林觀賞植物育種的常規(guī)方法，利用雜交技術(shù)繁殖姜荷花后代，利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定真雜種，分析分離種群遺傳多樣性，將促進姜荷花新品種的選育。簡單序列重復(fù)（simple sequence repeat， SSR）[7-8]具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性高、共優(yōu)勢、結(jié)果可靠等優(yōu)點。SSR 標(biāo)記技術(shù)[9]廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和林業(yè)作物的種子純度檢測、雜交品種鑒定等育種研究中。楊榮志等[10]、楊亞桐等[11]、將SSR 標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于玉米的遺傳多樣性研究；董海燕等[12]采用ISSR（inter simple sequence repeat， ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)對紅花檵木41 個品種進行了遺傳多樣性的分析。SSR 分子標(biāo)記在姜科植物中也有相關(guān)的研究[13-15]。周熠瑋等[15]以白姜花×金姜花雜交組合獲得的114 株雜交后代為材料，觀察花色性狀，同時利用集團分離分析法開發(fā)花色相關(guān)分子標(biāo)記。而在姜荷花的研究中，YU 等[16]首次報道了姜荷花的種群結(jié)構(gòu)，收集了32 份姜荷花種質(zhì)，27 個SSR標(biāo)記共檢測到139 個等位基因。并將這32 份姜荷花種質(zhì)分為2 組，2 個群體的遺傳分化（Fst）為0.127；發(fā)育分析表明，研究中的2 個群體與花梗長度、花序長度和產(chǎn)量有關(guān)。上述研究為后續(xù)姜荷花品種的遺傳多樣性研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

本研究利用SSR 標(biāo)記對前期構(gòu)建的3 個姜荷花品種的雜交F1 進行鑒定[14]，分析分離居群的遺傳多樣性，促進姜荷花雜交育種進程。為姜荷花后期群體的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以姜荷花黃色夢幻（Siam TM Sitrone）為母本（圖1A），分別以紅衣少女（Siam TM Scarlet）、白銀公主（Siam@Silver）和荷蘭紅（Holland Red）（圖1B～圖1D）為父本，采集雜交子一代葉片，裝入自封袋中分別標(biāo)記，置于?20 ℃下冷凍保存?zhèn)溆?。采用CTAB[17]法分別提取親本及子代的DNA，濃度稀釋到50～100 ng/μL。

1.2 方法

從先前研究中報道的SSR 引物，從前期多態(tài)性篩選獲得的SSR 標(biāo)記分布中選擇11 個SSR標(biāo)記引物[18-20]。將11 對SSR 引物對親本進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物進行變性處理后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果，篩選出最適用于鑒定該3 個親本組合的F1代雜種的SSR 引物（表1），用于后續(xù)雜交子代的擴增與分析。PCR 反應(yīng)體系為（總體系10 μL）：上下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 3.4 μL，2Es Taq Master Mix 5 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s，共34 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析PCR 產(chǎn)物。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用MEGA 軟件中的鄰位連接法（Neighbor-joining）對3 個種群的姜荷花雜交F1 代進行親緣關(guān)系分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育聚類樹，完成各數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜荷花雜交子代表型

以黃色夢幻為母本，紅衣少女、白銀公主和荷蘭紅為父本授粉雜交獲得F1 雜交子代。通過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)₁雜交子代葉片表型差異較大，如顏色、苞片、株高等均發(fā)生了較大的變異（圖2）。本研究所用的親本表型性狀苞片顏色不同，同時，這些雜交子代在表型上與親本存在著較大的差異。因此，形態(tài)學(xué)鑒定的方法只能觀察到表觀形態(tài)變化，為了更深一步鑒定真雜種，采用SSR 分子標(biāo)記進行遺傳鑒定。

2.2 姜荷花SSR標(biāo)記遺傳分析

利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，將篩選到的引物對姜荷花雜交F1 代進行鑒定發(fā)現(xiàn)，姜荷花雜交F1 子代的帶型可分為雙親特征帶兼具型、只具有父本特征條帶型、只具有母本特征條帶型以及具有父母本都沒有的新特征條帶型4 種。其中黃色夢幻紅衣少女的雜交組合共鑒定出169 個真雜種，2 個單株未出現(xiàn)父本特征條帶。對76 株姜荷花黃色夢幻×白銀公主的雜交組合進行鑒定，擴增圖譜中鑒定出的69 株苗都具有雙親互補的雜合位點且均出現(xiàn)了雙親都沒有的新條帶，可鑒定為真雜交種，真雜種鑒定率達(dá)到90.8%。對80株黃色夢幻×荷蘭紅的雜交后代進行鑒定，有4個樣品出現(xiàn)雙親位點的缺失，其余材料均出現(xiàn)了父本特異條帶（表2）。這些在姜荷花雜交組合間存在明顯差異的SSR 引物可以作為姜荷花雜交后代雜種鑒定時的參考引物，有利于在姜荷花育種過程的早期選出雜種苗。

2.3 姜荷花親本和F₁子代聚類分析

為了進一步檢驗姜荷花F1 子代的群體結(jié)構(gòu)以及親緣關(guān)系，利用MEGA 軟件中的鄰位連接法（Neighbor-joining）對3 個種群的姜荷花雜交F1代進行親緣關(guān)系分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育聚類樹（圖3）。黃色夢幻紅衣少女的171 份子代分為3 個類群，類群Ⅰ中的子代與母本聚集在一起，共有139株樣品，占比最多，為80.34%。占比最大的類群Ⅰ與母本關(guān)系較近，表現(xiàn)出了偏母本遺傳；類群Ⅱ共有包括父本紅衣少女在內(nèi)的17 株樣品，占比為9.83%；而類群Ⅲ共有17 株，占比為9.83%（圖3A）。黃色夢幻白銀公主的76 份F1 樣本分為兩大類，第Ⅰ類群包括48 株，其中父本白銀公主在該類群，占63.16%；第Ⅱ類群28 株，占36.84%（圖3B）。黃色夢幻荷蘭紅的82 株材料可分為四大類：第Ⅰ類含親本黃色夢幻和荷蘭紅，有39株，占48.75%；第Ⅱ類有21 株，占26.25%；第Ⅲ類有12 株，占15%；第Ⅳ類有8 株，占10%（圖3C）?？傮w而言，組合黃色夢幻紅衣少女雜交F1 代偏母本遺傳，雜交組合黃色夢幻白銀公主和黃色夢幻荷蘭紅多數(shù)雜交F1 代為偏父本遺傳。組合黃色夢幻荷蘭紅中第Ⅳ類與親本的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，可能是發(fā)生了較大的重組變異，有利于下一步的育種工作。

3 討論

雜交育種是培育姜荷花優(yōu)良品系的一個常規(guī)方法，是培育姜荷花新品種的重要途徑?？铝峥〉萚14]研究發(fā)現(xiàn)，以黃色夢幻作為母本更容易獲得雜交種子，因此設(shè)計黃色夢幻×紅衣少女、黃色夢幻×白銀公主以及黃色夢幻×荷蘭紅雜交組合，能提高姜荷花的授粉成功率，獲得一定數(shù)量的雜交種子，有利于姜荷花新品種的培育。SSR標(biāo)記技術(shù)可區(qū)分純合和雜合，且具有重復(fù)性好、易操作，可靠性高和多等位基因檢測等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于雜種的真實性鑒定。位明明等[21]以37個橡膠樹栽培品種為材料，利用SSR 熒光標(biāo)記技術(shù)進行DNA 指紋圖譜的構(gòu)建和遺傳關(guān)系分析，構(gòu)建我國橡膠樹栽培品種的SSR 指紋圖譜；SSR標(biāo)記可用于甘蔗野生種割手密雜交F1代的鑒定和遺傳分析[22]，以及能用于鑒定石斛屬植物[23]和蘭科植物品種[24]遺傳多樣性分析。而且從種質(zhì)資源的角度看，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)對雜交種進行早期的鑒定，有利于保證材料的質(zhì)量和種質(zhì)資源的充分利用。

在真雜種的鑒定中，SSR 引物影響鑒定效率，不同的引物鑒定效率不同，本研究應(yīng)用11 對SSR引物對幼苗期姜荷花雜交子代群體鑒定偽雜，每個組合篩選出5 個引物對姜荷花雜交后代進行擴增，電泳圖譜中的條帶清晰且豐富。在雜交后代的擴增圖譜中表現(xiàn)出了新條帶，吳學(xué)尉等[25]推測新條帶的出現(xiàn)可能是因為在配子形成中出現(xiàn)了染色體的不等價交換而產(chǎn)生的新片段。AYLIFFE等[26]曾通過實驗證明了這些新條帶產(chǎn)生的原因是不同長度的等位核苷酸序列之間形成了異源雙鏈體。因此，擴增的條帶有一些親本條帶的缺失，有的是雙親特異條帶缺失，而有的是雙親共有條帶缺失。本研究利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對姜荷花雜交組合的327 株子代進行真假鑒定，本研究3個雜交組合的遺傳相似系數(shù)均大于0.5，說明3個雜交后代群體均具有較豐富的遺傳變異，特別是雜交組合黃色夢幻荷蘭紅中有小部分子代，既沒有父本的特異性條帶，也沒有母本的特異性條帶，且在聚類分析中獨自聚為一類。因此，這些種苗可能發(fā)生了巨大的遺傳變異，其中親本的條帶出現(xiàn)缺失有很大概率是由于配子形成過程中染色體的交換及DNA 分子堿基修飾引起的突變等原因所造成的位點丟失[27]。SSR 聚類分析揭示了雜交子代的遺傳多樣性，進而解釋了雜種子代表型上豐富的變異。因此，姜荷花雜交育種獲得的子代分離變異豐富，可進一步用于新品種培育。綜上所述，利用SSR 分子標(biāo)記對姜荷花的雜交子代進行鑒定具有較高的可行性，同時也為姜荷花的育種、選種工作提供基礎(chǔ)和依據(jù)。