摘要：杜仲作為我國(guó)特有、貴州廣泛分布的藥用植物，其葉際微生物對(duì)其生長(zhǎng)具有重要意義。為揭示人工栽培和野生杜仲葉際真菌群落組成、多樣性及其功能，本研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法，對(duì)杜仲葉附生及內(nèi)生真菌群落組成及多樣性進(jìn)行分析，基于FUNGuild數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行功能注釋?zhuān)?duì)其產(chǎn)IAA能力進(jìn)行評(píng)估。本試驗(yàn)共分離獲得真菌2門(mén)42屬226株。其中，從野生杜仲葉中分離獲得154株，主要包括青霉屬Penicillium（25.32%）等19個(gè)優(yōu)勢(shì)屬；從人工栽培杜仲葉中分離獲得72株，主要包括曲霉屬Aspergillus（16.67%）等19個(gè)優(yōu)勢(shì)屬。功能注釋結(jié)果顯示：除未定義功能類(lèi)群，真菌類(lèi)群主要涉及動(dòng)物病原菌群（12.79%）、植物病原菌群-木腐菌群（13.95%）和內(nèi)生菌群-附生菌群-植物病菌群（24.42%）。結(jié)果表明人工栽培種和野生種的真菌物種組成差別較大，且共有菌株比例較低。本研究還分離到多個(gè)產(chǎn)吲哚-3-乙酸（IAA）菌株。研究結(jié)果將為后續(xù)精準(zhǔn)調(diào)控杜仲葉微生物組以增強(qiáng)植物健康、促進(jìn)植物生長(zhǎng)以及功能菌株的開(kāi)發(fā)利用。

關(guān)鍵詞：植物微生物；葉際真菌；多樣性；生態(tài)功能；吲哚乙酸

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）又名膠木，屬于杜仲科杜仲屬的落葉喬木植物，主要分布于中國(guó)甘肅、陜西等省份，是中國(guó)特有的藥用和經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，富含綠原酸、黃酮、多糖等多種有效成分，通常使用其干燥的樹(shù)皮和葉子入藥，具有降壓、增強(qiáng)免疫力、降血糖等藥理作用［1］。有研究指出，杜仲的各組織中微生物物種多度高且數(shù)量龐大。這些微生物對(duì)杜仲的健康、藥用成分的合成和積累及產(chǎn)質(zhì)量具有重要影響。楊娟等研究指出，杜仲樹(shù)皮中的某些藥理活性成分與真菌類(lèi)群呈明顯的正相關(guān)［2］。DONG等則對(duì)杜仲樹(shù)皮中的細(xì)菌群落組成及功能進(jìn)行了進(jìn)一步探究，發(fā)現(xiàn)其中大部分核心細(xì)菌菌群與樹(shù)皮的藥理活性成分高度相關(guān)［3］。張青青等通過(guò)研究杜仲種子內(nèi)的微生物群落組成和多樣性，發(fā)現(xiàn)杜仲種子內(nèi)攜帶多種有益功能菌和潛在致病菌［4］。這些微生物對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和藥用價(jià)值具有重要影響。

葉片相關(guān)微生物，包括上下葉表面和葉組織內(nèi)部的微生物被統(tǒng)稱(chēng)為葉際微生物。由于葉片作為植物光合作用和物質(zhì)生產(chǎn)的主要器官，葉際微生物能通過(guò)直接影響葉片功能和壽命從而在植物生產(chǎn)力和適應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用。但大多數(shù)杜仲微生物研究集中在根、樹(shù)皮和種子等組織部位，缺乏對(duì)葉際微生物的關(guān)注，少量相關(guān)研究則偏重內(nèi)生菌中的細(xì)菌，而對(duì)附生菌和內(nèi)生真菌缺乏了解，這阻礙了對(duì)葉際微生物群落的認(rèn)識(shí)［5-7］。因此，本文以杜仲葉為研究對(duì)象，對(duì)其葉內(nèi)生及附生真菌多樣性進(jìn)行研究。

有研究指出，環(huán)境因素對(duì)葉際微生物群落結(jié)構(gòu)具有重要影響［8］。魏亞情發(fā)現(xiàn)葉際真菌群落表現(xiàn)出顯著的生物地理格局，且葉際真菌群落的主要驅(qū)動(dòng)因子包括年均溫、年均降水量等氣候因素［9］。另外，沉水植物葉際微生物的群落結(jié)構(gòu)與周?chē)h(huán)境如溫度、光照等也有一定關(guān)系［10-11］。在年均溫、年均降水量、溫度、光照及土壤pH等環(huán)境因素方面，野生和人工種植條件存在較大差異，可能導(dǎo)致葉際微生物多樣性及豐度不同。因此，本研究對(duì)野生和人工種植杜仲葉際真菌群落進(jìn)行了差異分析。

葉際微生物賦予宿主有益功能的重要方式為通過(guò)合成一種或多種植物激素影響植物激素水平。據(jù)報(bào)道，吲哚-3-乙酸（IAA）是影響杜仲葉際微生物群落的兩種關(guān)鍵植物激素之一，在調(diào)控其群落組成、多樣性和功能上發(fā)揮重要作用［12］。IAA是一種典型的植物生長(zhǎng)促進(jìn)激素，已被廣泛報(bào)道可由葉際微生物合成產(chǎn)生。如，潘明凱研究發(fā)現(xiàn)柑橘葉際微生物克雷伯氏菌Klebsiella表現(xiàn)出較強(qiáng)的IAA分泌能力［13］。梁淑雅等從苦草根、葉際附生細(xì)菌中篩選得到11株產(chǎn)IAA菌［14］。劉元等研究發(fā)現(xiàn)，懷山藥內(nèi)生真菌銳頂鐮刀菌具有較強(qiáng)的IAA分泌能力，可能對(duì)宿主植物具有一定的促生作用［15］。葉際微生物，尤其是葉際真菌與植物的健康和生長(zhǎng)密切相關(guān)，并且作為一種新興的微生物資源，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域的生產(chǎn)應(yīng)用方面具有巨大的發(fā)展空間［16］。

綜上所述，本研究通過(guò)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、形態(tài)鑒定以及分子鑒定等方法對(duì)杜仲葉附生及葉內(nèi)生真菌群落組成及差異、多樣性進(jìn)行探究，并對(duì)杜仲葉際真菌的生態(tài)功能進(jìn)行注釋。同時(shí)，篩選出能夠產(chǎn)IAA的具有促生長(zhǎng)活性的菌株，以期為今后杜仲的栽培管理提供重要信息，并積累具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的功能菌株資源。

1材料與方法

1.1樣品的采集與處理

從貴州大學(xué)西校區(qū)（26°25′N(xiāo)，106°40′E）選取4棵健康的野生杜仲樹(shù)和4棵健康的人工種植杜仲植株，剪取健康無(wú)病斑的新鮮葉片若干，編號(hào)后置于無(wú)菌保鮮袋中，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

稱(chēng)取采集的野生和人工種植的杜仲葉片各2 g分別置于燒杯中，依次用無(wú)菌蒸餾水對(duì)杜仲葉片進(jìn)行沖洗，除去葉片表面的塵土顆粒，備用。

本研究各試驗(yàn)樣本為野生杜仲葉附生菌株樣本（WP）、野生杜仲葉內(nèi)生菌株樣本（WE）、人工栽培杜仲葉附生菌株樣本（PP）、人工栽培杜仲葉內(nèi)生菌株樣本（PE）。

1.2葉附生和內(nèi)生真菌的分離、純化及保種

1.2.1葉附生真菌的分離

葉面附生微生物的分離采用平板稀釋法［17］。將處理好的2 g葉片，放入盛有50 mL滅菌水的三角瓶中，放入振蕩器上，恒溫25 ℃下，以130 r/min振蕩30 min，即制成菌懸液母液，然后用無(wú)菌水稀釋成10-1、10-2梯度的菌懸液，分別取10-1、10-2兩個(gè)梯度的菌懸液200 μL均勻涂布于兩種培養(yǎng)基平板，每個(gè)梯度重復(fù)三次，然后置于25～28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天。

1.2.2葉內(nèi)生真菌的分離

將葉片組織從上述三角瓶中取出，在無(wú)菌操作臺(tái)上，用70%酒精處理2～3 s，然后用3.5%的次氯酸鈉溶液處理3～4 min，再用無(wú)菌水漂洗4～5次，每次處理1 min以上，然后用滅菌濾紙吸干組織表面水分。將最后一次洗滌液按100 μL/皿涂布于各分離培養(yǎng)基平板，并置于恒溫培養(yǎng)箱中，數(shù)天后若未發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿中有菌落生長(zhǎng)，則證明葉面滅菌操作合格，滅菌徹底，若皿中有菌落出現(xiàn)，則重復(fù)滅菌操作［17］。

內(nèi)生微生物的分離采用勻漿平板稀釋分離法［18］。將表面消毒的葉片組織用無(wú)菌剪刀剪碎，避免用手接觸葉表，放入滅好菌的研缽中，加入無(wú)菌水定容至10 mL，研磨至漿狀，得到10-1稀釋倍數(shù)的樣品懸浮液，繼而將樣品懸浮液稀釋成10-2倍的稀釋液，由此得到100、10-1、10-2倍三個(gè)梯度的稀釋液，然后從每個(gè)梯度的稀釋液中各取200 μL涂布于備好的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）平皿上，各梯度均設(shè)置三個(gè)平行，置于25～28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天。

1.2.3菌株的純化及保種

待菌絲長(zhǎng)出后，用接種針挑取適量菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，獲得純培養(yǎng)菌株。待菌株完成逐步純化后將其接入裝有30%甘油的凍存管中，放于4 ℃冰箱臨時(shí)保藏，或-80 ℃超低溫冰箱中進(jìn)行長(zhǎng)期保藏［19］。

1.3菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將分離得到的真菌菌株接種在PDA平板上，在25 ℃恒溫箱培養(yǎng)7～14天后，觀察、記錄其菌落特征，如顏色、形態(tài)、質(zhì)地，并測(cè)量菌落直徑［20］。制片后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)，測(cè)量并記錄其孢子形狀、大小及分生孢子梗的形態(tài)和排列方式等。根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)，查閱真菌學(xué)專(zhuān)業(yè)文獻(xiàn)資料，對(duì)比菌種特征，將菌株鑒定到屬。

1.4菌株的分子鑒定

用滅菌刀片從PDA平板上取少量真菌菌株的菌絲和孢子于離心管中，并加適量研磨珠于細(xì)胞破碎儀進(jìn)行研磨。按照真菌基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）的操作說(shuō)明進(jìn)行真菌DNA的提取，備用。PCR擴(kuò)增所需引物均來(lái)自上海生工生物術(shù)有限公司，分別為ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。

PCR反應(yīng)體系為25 μL：Master Mix 12.5 μL，引物ITS1和引物ITS4分別為1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min；50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：以DNA Marker DL2000為大小參照，分別將擴(kuò)增產(chǎn)物與對(duì)照放入Parafilm薄膜和上樣緩沖液中進(jìn)行混合，在加入GenRed的0.8%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行點(diǎn)樣，然后電泳40 min。在紫外光下，若熒光染料標(biāo)記的DNA條帶清晰，且與預(yù)期大小一致，則說(shuō)明擴(kuò)增成功。

DNA測(cè)序：將擴(kuò)增產(chǎn)物送至昆明碩擎生物科技有限公司，并對(duì)待鑒定菌株的ITS序列進(jìn)行序列測(cè)定，經(jīng)BioEdit人工校對(duì)去除引物及雙峰序列。登陸NCBI進(jìn)行BLAST，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，BLAST結(jié)果相似度為99%以上的，確定為同一種，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行種屬鑒定［21-22］。

1.5產(chǎn)IAA菌株的篩選

將待測(cè)菌株接種到150 mL PDB液體培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，加蒸餾水至1 L，自然 pH，121 ℃ 滅菌 20 min）上進(jìn)行培養(yǎng)（250 mL 錐形瓶，28 ℃，150 r/min）7 d，用移液槍吸取200 μL發(fā)酵液置白色坩堝內(nèi)。1∶1加入標(biāo)準(zhǔn)比色液，每株菌試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行；同時(shí)設(shè)置一組空白對(duì)照（未接種的PDB培養(yǎng)液）和一組陽(yáng)性對(duì)照（按1∶1將200 μL吲哚-3-乙酸標(biāo)準(zhǔn)液（0.9 mg /L）與標(biāo)準(zhǔn)比色液混合），在暗處?kù)o置30 min后，觀察其顏色變化。顏色不變?yōu)殛幮裕砭瓴划a(chǎn)IAA；顏色變成粉紅或紅色則為陽(yáng)性，代表菌株產(chǎn)IAA。

1.6數(shù)據(jù)處理及分析

1.6.1葉際真菌的分離頻率

本研究以分離頻率（IF）界定可培養(yǎng)真菌群落的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，將分離頻率在10%以上的屬定義為優(yōu)勢(shì)屬。分離頻率的計(jì)算公式為［23］

分離頻率IF（%）=P/N×100%

式中：P為某一真菌分離株的總數(shù)；N為所有真菌分離株的總數(shù)。

1.6.2葉際真菌的群落組成與差異分析及生態(tài)功能注釋統(tǒng)計(jì)分離得到的真菌在屬水平上的分離頻率，對(duì)其進(jìn)行群落組成及差異分析。通過(guò)FUNGuilds數(shù)據(jù)庫(kù)獲得已鑒定的真菌類(lèi)群的營(yíng)養(yǎng)型及生態(tài)功能信息。通過(guò)Omicstudio、BioLadder-生物信息在線(xiàn)分析和派森諾基因云繪圖平臺(tái)分別繪制杜仲葉際真菌群落生態(tài)功能和組成的百分比柱狀圖、主成分分析圖、比例韋恩圖。

1.6.3葉際真菌的α多樣性分析

本研究結(jié)合 Shannon-wiener與 Margalef 指數(shù)對(duì)各樣本進(jìn)行多樣性分析，涉及的指數(shù)計(jì)算方法如下：

Shannon-wiener 多樣性指數(shù)H=-Σ（Pi×ln（Pi））

Margalef 豐富度指數(shù)R=（S-1）/ln N

式中：Pi為第i種真菌菌株數(shù)與所有真菌分離株總數(shù)的比值；S為分離得到的真菌種類(lèi)數(shù)；N為所有真菌分離株的總數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1野生和人工栽培杜仲葉際真菌群落組成及差異分析本研究以野生和人工栽培杜仲葉為樣本，分離得到可培養(yǎng)真菌2門(mén)42屬75種226株。不同來(lái)源的杜仲葉真菌群落的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群差異顯著且各不相同。

野生杜仲葉樣本共分離獲得附生真菌（WP）2門(mén)4綱11目18科25屬35種119株。其中，子囊菌門(mén)Ascomycota是主要的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。綱水平上，座囊菌綱Dothideomycetes、散囊菌綱Eurotiomycetes是優(yōu)勢(shì)綱，分離頻率分別為50.42%和37.82%。其次是傘菌綱Agaricomycetes（8.40%）和糞殼菌綱Sordariomycetes（3.36%）。屬水平上，青霉屬Penicillium（31.93%）是優(yōu)勢(shì)屬。其次是近暗球腔菌屬Paraphaeosphaeria（17.65%）、長(zhǎng)隔孢屬Ramularia（6.72%）、亞隔孢殼屬Didymella（5.88%）、枝孢菌屬Cladosporium（5.04%）、耙齒菌屬I(mǎi)rpex（5.04%）、棘殼孢屬Setophoma（3.36%）、Acrocalymma（2.52%）、球腔菌屬Phaeosphaeria（2.52%）、曲霉屬Aspergillus（2.52%）和籃狀菌屬Talaromyces（2.52%）等。其余屬的分離頻率都在1%左右（圖1）。

野生杜仲葉樣本共分離獲得內(nèi)生真菌（WE）2門(mén)3綱8目9科10屬15種35株其中，子囊菌門(mén)為真菌優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。綱水平上，糞殼菌綱（68.57%）和傘菌綱（20.00%）為優(yōu)勢(shì)綱。其次是散囊菌綱（11.43%）。屬水平上，其優(yōu)勢(shì)屬是間座殼屬Diaporthe（45.71%），其次是裂褶菌屬Schizophyllum（8.57%）、炭疽菌屬Colletotrichum（8.57%）、白僵菌屬Beauveria（8.57%）、曲霉屬（8.57%）、隔孢伏革屬Peniophora（5.71%）、擬盤(pán)多毛孢屬Pestalotiopsis（5.71%）、下皮黑孔菌屬Cerrena（2.86%）、栓菌屬Trametes（2.86%）和青霉屬（2.86%）（圖1）。

人工栽培杜仲葉樣本共分離獲得附生真菌（PP）2門(mén)4綱7目9科11屬15種56株。其中，子囊菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌群。綱水平上，糞殼菌綱（60.71%）和散囊菌綱（21.43%）是優(yōu)勢(shì)綱。其次是座囊菌綱（14.29%）和傘菌綱（3.57%）。屬水平上，其優(yōu)勢(shì)屬是曲霉屬，分離頻率為21.43%，其次是螺旋聚孢霉屬Clonostachys（14.29%）、假蕉孢殼屬Diatrypella（12.50%）、枝孢菌屬（12.50%）、擬盤(pán)多毛孢屬（10.71%）、炭疽菌屬（10.71%）、鐮刀菌屬Fusarium（7.14%）、絮干朽菌屬Byssomerulius（3.57%）、彎孢聚殼屬Eutypella（3.57%）、新擬盤(pán)多毛孢屬Neopestalotiopsis（1.79%）和附球霉屬Epicoccum（1.79%）（圖1）。

人工栽培杜仲葉樣本共分離獲得內(nèi)生真菌（PE）2門(mén)2綱7目8科8屬10種16株。其中，子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota為優(yōu)勢(shì)菌群。綱水平上，傘菌綱和座囊菌綱，分離頻率均為50.00%，是優(yōu)勢(shì)綱。屬水平上，假尾孢菌屬Pseudocercospora（31.25%）為優(yōu)勢(shì)屬。其次是隔孢伏革菌屬（18.75%）、皮司霉菌屬Pithomyces（18.75%）、角擔(dān)菌屬Ceratobasidium（6.25%）、裂褶菌屬（6.25%）、栓菌屬（6.25%）和耙齒菌屬（6.25%）等（圖1）。

野生杜仲葉（W）共分離出真菌154株，隸屬于2門(mén)4綱14目24科31屬。在屬水平，如圖2（a）所示，主要包括青霉屬、近暗球腔菌屬、間座殼屬、長(zhǎng)隔孢屬和亞隔孢殼屬等19個(gè)優(yōu)勢(shì)屬，其中，青霉屬（25.32%）、近暗球腔菌屬（13.64%）和間座殼屬（10.39%）占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，為主要優(yōu)勢(shì)屬。

人工栽培杜仲葉（P）共分離出真菌72株，隸屬于2門(mén)4綱12目16科19屬。在屬水平，如圖2（a）所示，主要包括曲霉屬（16.67%）和螺旋聚孢霉屬（11.11%）等19個(gè)優(yōu)勢(shì)屬。

野生和人工栽培杜仲葉共分離到葉附生真菌（P）175株，隸屬于2門(mén)4綱13目22科33屬。在屬水平，如圖2（b）所示，主要包括青霉屬（21.71%）、近暗球腔菌屬（12.00%）和曲霉屬（8.57%）等21個(gè)優(yōu)勢(shì)屬。

野生和人工栽培杜仲葉共分離到內(nèi)生真菌（E）51株，隸屬于2門(mén)4綱12目14科15屬。在屬水平，如圖2（b）所示，主要包括間座殼屬（31.37%）、隔孢伏革菌屬（9.80%）和假尾孢菌屬（9.80%）等15個(gè)優(yōu)勢(shì)屬，其中，間座殼屬（26.07%）為主要優(yōu)勢(shì)屬。

由主成分分析圖3（a）可知，第一主成分（PCA1）的方差貢獻(xiàn)率為30.11%，是主要特征，第二主成分（PCA2）的方差貢獻(xiàn)率為28.04%，是次要特征，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為58.15%。WP、WE、PP和PE這4個(gè)樣本在兩個(gè)主成分軸上呈現(xiàn)為4組，說(shuō)明4樣本之間真菌群落具有顯著差異。

Venn圖顯示如圖3（b），野生和人工栽培杜仲葉際及內(nèi)生可培養(yǎng)真菌群落不具有共有屬，互相之間差異明顯。不同生境不同區(qū)位杜仲葉樣本都存在一定數(shù)量的獨(dú)有真菌類(lèi)群。例如，野生杜仲葉樣本中，內(nèi)生（WE）真菌群落有3個(gè)獨(dú)有類(lèi)群，依次為白僵菌屬、下皮黑孔菌屬和間座殼屬。人工栽培杜仲葉內(nèi)生（PE）真菌群落具4個(gè)獨(dú)有類(lèi)群，依次為角擔(dān)菌屬、Dendrophora、皮司霉菌屬和假尾孢菌屬。人工栽培杜仲葉附生（PP）真菌群落具7個(gè)獨(dú)有類(lèi)群，依次為絮干朽菌屬、螺旋聚孢霉屬、假蕉孢殼屬、附球霉屬、彎孢聚殼屬、鐮刀菌屬和新擬盤(pán)多毛孢屬。野生杜仲葉附生（WP）真菌群落獨(dú)有類(lèi)群最為豐富，多達(dá)19個(gè)屬，分別為：Acrocalymma、黑管菌屬Bjerkandera、亞隔孢殼屬、雙毛殼孢屬Discosia、小穴殼菌屬Dothiorella、新葫蘆科菌屬Neocucurbitaria、擬盾殼霉屬Paraconiothyrium、近暗球腔菌屬、球腔菌屬、莖點(diǎn)霉屬Phoma、擬莖點(diǎn)霉屬Phomopsis、Pleosporales、長(zhǎng)隔孢屬、Septoria、棘殼孢屬、殼多孢菌屬Stagonosporopsis、橫斷孢屬Strelitziana、籃狀菌屬和Thyridium。

2.2野生和人工栽培杜仲葉真菌群落多樣性

微生物群落的多樣性指數(shù)是用來(lái)量化和比較不同樣本中微生物種類(lèi)數(shù)量和豐度的統(tǒng)計(jì)量。Shannon-wiener 指數(shù)（香農(nóng)-維納指數(shù)）是群落多樣性指數(shù)，它綜合考量群落中物種的豐富度（物種數(shù)量）和均勻度（每個(gè)物種的相對(duì)豐度）。它的數(shù)值越大，表示群落生物多樣性越高［24］。Magalef豐富度指數(shù)不考慮相對(duì)豐度，僅關(guān)注群落的豐富度，因此指數(shù)值越高，表示觀察到的物種越多，群落的物種豐富度也就越高［25］。

如表1所示，Shannon-wiener和 Margalef 指數(shù)的順序均為由高到低，表現(xiàn)為野生附生（WP）gt;人工附生（PP）≥野生內(nèi)生（WE）gt;人工內(nèi)生（PE）。這一結(jié)果表明，野生杜仲葉附生（WP）真菌群落最為豐富，其次是人工栽培杜仲葉附生（PP）和野生杜仲葉內(nèi)生（WE）真菌群落，多樣性最低的是人工栽培杜仲葉內(nèi)生（PE）真菌群落。結(jié)果還表明，野生（W）較人工栽培（P）杜仲葉真菌群落更為豐富；杜仲葉附生（P）較內(nèi)生（E）真菌群落更為豐富。

2.3杜仲葉際真菌群落功能分析

使用FUNGuilds平臺(tái)對(duì)杜仲葉際真菌類(lèi)群的營(yíng)養(yǎng)型和生態(tài)功能類(lèi)群進(jìn)行分析（圖4）。其中，20個(gè)物種被成功注釋?zhuān)瑺I(yíng)養(yǎng)型包括病原型（Pathotroph）（24.42%）、病原-腐生型（Pathotroph-Saprotroph）（24.42%）、共生型（Symbiotroph）（12.79%）、病原-共生型（Pathotroph-Symbiotroph）（38.37%）4大類(lèi)。除未定義功能類(lèi)群（Undefined functional group），所有真菌類(lèi)群涉及植物病原菌群（Plant Pathogen）（11.63%）、動(dòng)物病原菌群（Animal Pathogen）（12.79%）、內(nèi)生菌群（Endophyte）（12.79%）以及多種混合功能類(lèi)群如動(dòng)物病原菌群-未定義腐生菌群（Animal Pathogen-Undefined Saprotroph）（3.49%）、內(nèi)生菌群-附生菌群-植物病菌群（Endophyte-Epiphyte-Plant Pathogen）（24.42%）、動(dòng)物病原菌群-內(nèi)生菌群-木腐菌群（Animal Pathogen-Endophyte-Wood Saprotroph）（3.49%）、動(dòng)物病原菌群-植物病原菌群-木腐菌群（Animal Pathogen-Plant Pathogen-Wood Saprotroph）（3.49%）、內(nèi)生菌群-地衣寄生菌群-植物病原菌群（Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen）（1.16%）、植物病原菌群-木腐菌群（Plant Pathogen-Wood Saprotroph）（13.95%）、內(nèi)生菌群-植物病原菌群（Endophyte-Plant Pathogen）（12.79%）10類(lèi)。55個(gè)物種在FUNGuilds數(shù)據(jù)庫(kù)中未能注釋到對(duì)應(yīng)功能。整體來(lái)看，野生杜仲葉際真菌功能群主要集中于內(nèi)生菌群-附生菌群-植物病原菌群、內(nèi)生菌群-植物病原菌群、動(dòng)物病原菌群，人工栽培杜仲葉際真菌功能群則主要為植物病原菌群-木腐菌群和動(dòng)物病原菌群，且在野生杜仲葉上的內(nèi)生真菌數(shù)量顯著高于人工栽培杜仲。

2.4產(chǎn)IAA菌株篩選及能力評(píng)估

從野生及人工栽培杜仲葉中共分離75種真菌，如表2所示，只有擬莖點(diǎn)霉屬一未定種Phomopsis sp.，黃曲霉Aspergillus flavus，鐮刀菌屬一未定種Fusarium sp.，亞洲鐮刀菌Fusarium asiaticum和深海真菌耐鹽枝孢Cladosporium halotolerans能夠產(chǎn)IAA，其中，有3種屬于人工栽培杜仲葉附生真菌，1種屬于野生杜仲葉附生真菌，1種屬于野生杜仲葉內(nèi)生真菌。由表可知，擬莖點(diǎn)霉屬一未定種Phomopsis sp.具有顯著陽(yáng)性顏色反應(yīng)，產(chǎn)IAA能力最強(qiáng)，高于其他4個(gè)菌株。

3討論

本研究從群落組成、多樣性及生態(tài)功能等方面對(duì)比分析了野生和人工栽培杜仲葉際真菌群落。采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法、勻漿平板稀釋分離法對(duì)野生和人工栽培條件下的杜仲葉際真菌群落進(jìn)行培養(yǎng)、分離和純化。

結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，對(duì)分離獲得的真菌菌株進(jìn)行鑒定，確定其在各分類(lèi)單元上的分類(lèi)地位。結(jié)果表明，從野生和人工栽培杜仲葉共分離真菌226株，分屬于42屬75種。在野生杜仲葉附生真菌（WP）優(yōu)勢(shì)屬為青霉屬（32.48%）。符合以往研究結(jié)果即：青霉屬真菌是自然界中最大的真菌種屬，也是自然界中最常見(jiàn)的真菌。青霉屬真菌中報(bào)道了許多具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒等活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是藥物先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。其中，青霉素作為抗菌藥物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有十分廣泛的應(yīng)用。此外，環(huán)孢菌素作為一種免疫抑制劑，常用于器官移植后的抗排異反應(yīng)治療；他汀類(lèi)藥物則可用于降低降膽固醇藥水平［26-27］。

在野生杜仲葉附生真菌（WP）中發(fā)現(xiàn)特有屬：擬莖點(diǎn)霉屬。其有性態(tài)為子囊菌門(mén)的間座殼屬，這類(lèi)真菌不僅會(huì)導(dǎo)致多種植物的葉斑病，還會(huì)引起茄子果實(shí)的褐紋病，是引起植株產(chǎn)量降低和植株落敗的關(guān)鍵因素。林宇等人觀察到一些非洲楝的葉片出現(xiàn)較嚴(yán)重的葉斑病，通過(guò)顯微鏡觀察，他們將葉斑病的發(fā)生歸因于擬莖點(diǎn)霉屬真菌的感染，并將這種葉斑病命名為非洲楝擬莖點(diǎn)霉葉斑病［28］。中國(guó)真菌志：擬莖點(diǎn)霉屬中有楝擬莖點(diǎn)霉Phomopsis abdita引起的楝樹(shù)枝枯病的記載［29］。SUN等證明了間座殼屬和擬莖點(diǎn)霉屬病原菌復(fù)合體對(duì)大豆具有致病性［30］。野生杜仲葉內(nèi)生真菌（WE）優(yōu)勢(shì)屬為間座殼屬，分離頻率為45.71%，屬于植物病原菌。

人工栽培杜仲葉附生真菌（PP）優(yōu)勢(shì)屬為曲霉屬，分離頻率為21.43%。曲霉屬真菌在自然界中廣泛存在，并可應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。曲霉屬真菌的某些類(lèi)群能產(chǎn)生對(duì)昆蟲(chóng)有毒的化合物。據(jù)COLE等報(bào)道，一株雜色曲霉Aspergillus versicolor可產(chǎn)生雜色酰亞胺，這種化合物對(duì)某些昆蟲(chóng)的成蟲(chóng)有毒殺和熏蒸作用［31］。因此，這類(lèi)真菌可在農(nóng)林害蟲(chóng)的生物防治策略中成為潛在的工具。另外，在人工栽培杜仲葉附生真菌（PP）中的一特有屬鐮刀菌屬，能分泌多種毒素，可導(dǎo)致作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降，同時(shí)也可能對(duì)人和動(dòng)物的健康構(gòu)成威脅［32］。人工栽培杜仲葉內(nèi)生真菌（PE）優(yōu)勢(shì)屬為假尾孢菌屬，分離頻率為31.25%。尾孢類(lèi)真菌是植物病原菌，也是其他植物病原菌知名的重寄生菌，一些種已用于有害雜草的生物防治，是一類(lèi)具有重要經(jīng)濟(jì)意義的真菌［33］。假尾孢屬是尾孢類(lèi)真菌中世界性植物病原真菌的大屬，在熱帶和亞熱帶環(huán)境中造成谷類(lèi)、果蔬、林木、藥材等植物的葉斑、疫病、果斑和果腐，致使葉片枯死，過(guò)早脫落或造成落花、落果［34］。

結(jié)合Shannon-wiener和Margalef這2個(gè)微生物群落多樣性指標(biāo)的分析結(jié)果來(lái)看，在屬水平上，野生杜仲葉附生（WP）真菌群落多樣性最高，這可能是因?yàn)橐巴馍鷳B(tài)環(huán)境復(fù)雜多變，植物微生物與周?chē)h(huán)境中的微生物存在交換，從而導(dǎo)致其真菌群落更為豐富；其次是人工栽培杜仲葉附生（PP）真菌群落。這一結(jié)果的出現(xiàn)，可能是由于野生杜仲葉面積遠(yuǎn)大于人工栽培杜仲，葉面積越大，允許棲息的微生物種類(lèi)和數(shù)量越多。張曼研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇等8種藥用植物的葉面積與部分附生真菌的物種多度顯著正相關(guān)［35］。目前很多研究是針對(duì)植物內(nèi)生真菌，未來(lái)或可對(duì)植物附生真菌群落投入更多關(guān)注。葉附生真菌較內(nèi)生真菌多樣性更高，這與AGLER等的研究結(jié)果“與內(nèi)生微生物群相比，葉附生微生物群似乎更加多樣和豐富”一致［36］。此外，野生和人工栽培杜仲葉真菌群落共有屬比例低，具有顯著的空間異質(zhì)性，這可能是由于真菌對(duì)不同環(huán)境的選擇偏好形成了不同的群落模式［37］。

在群落功能預(yù)測(cè)中，在杜仲葉上存在一定種類(lèi)和數(shù)量的腐生型真菌，這些真菌被認(rèn)為具有降解木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的能力，其可能參與凋落物的分解，釋放大量礦物質(zhì)養(yǎng)分歸還到土壤，供綠色植物吸收利用［38］。另外，部分真菌還被注釋為內(nèi)生真菌，這些類(lèi)群有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，可促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)、土壤養(yǎng)分吸收與利用、改善土壤環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)。然而，也注釋到多種動(dòng)植物病原菌，如枝孢樣枝孢霉Cladosporium cladosporioides會(huì)導(dǎo)致柑橘果實(shí)腐?。?9］。因此，揭示杜仲葉際真菌群落組成和功能是了解植株健康以及后續(xù)人為調(diào)整微生物菌群增強(qiáng)植物健康、提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量的先決條件。

本實(shí)驗(yàn)篩選得到擬莖點(diǎn)霉屬一未定種Phomopsis sp.、黃曲霉Aspergillus flavus等5個(gè)具有產(chǎn)IAA活性的菌株，其中Phomopsis sp.的能力最為顯著。SHAO［12］等報(bào)道吲哚-3-乙酸和異戊烯基腺嘌呤這兩種激素是影響杜仲葉際微生物群落的關(guān)鍵植物激素，在調(diào)控其群落組成、多樣性和功能上發(fā)揮重要作用。因此，在杜仲的種植過(guò)程中，適當(dāng)加含產(chǎn)吲哚-3-乙酸微生物的菌肥，通過(guò)植物-微生物相互作用實(shí)現(xiàn)植物生長(zhǎng)正向調(diào)控，可能更有利于杜仲產(chǎn)量及品質(zhì)的提升。

綜上所述，在野生和人工栽培條件下的杜仲葉際真菌群落差異顯著，這對(duì)優(yōu)化農(nóng)業(yè)實(shí)踐和提升藥材杜仲的質(zhì)量有重要意義。掌握其中的變化趨勢(shì)以及主要影響因素，能夠幫助人們通過(guò)調(diào)控微生物群落來(lái)提高杜仲的藥用價(jià)值，也能為其野生資源保護(hù)和人工培育提供理論依據(jù)。除此之外，利用篩選到的產(chǎn)生長(zhǎng)素菌株制成復(fù)合型菌肥，在杜仲生長(zhǎng)過(guò)程中進(jìn)行人工干預(yù)，或可促進(jìn)杜仲更好更快生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)杜仲相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。藥用植物杜仲葉際真菌多樣性豐富，有大量尚待開(kāi)發(fā)利用的微生物資源，有望成為解決杜仲資源與市場(chǎng)需求矛盾的關(guān)鍵替代物。參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯：于慧梅）

Community Composition of Culturable Fungi in Eucommia Ulmoides

Phyllosphere and Screening of IAA-Producing Strains

QI Yinghua， ZHAO Yufeng， SONG Keyun， WANG Yanling， RAN Qingsong，

SHAO Qiuyu， DONG Chunbo， HAN Yanfeng*

（Institute of Fungus Resources， Guizhou University， Guiyang 550025， China）Abstract： As a unique medicinal plant in China， Eucommia ulmoides is widely distributed in Guizhou province. The phyllosphere microorganisms are of great significance for its growth. In order to reveal the community composition， diversity， and function of phyllosphere fungi in artificially cultivated and wild Eucommia ulmoides， and to screen strains with IAA-production activity， based on the traditional cultivation methods， the composition and diversity of endophytic fungal communities in Eucommia ulmoides phyllosphere was analyzed， and their function groups were annotated based on the FUNGuild database. As a result， a total of 226 fungal strains were isolated from E. ulmoides phyllosphere belonged to 2 phyla and 42 genera. Among them， 154 strains were from wild leaves， mainly including 19 dominant genera such as Penicillium （25.32%）， and 72 strains were from artificially cultivated leaves， mainly including 19 dominant genera such as Aspergillus （16.67%）. The functional annotation results showed that， except for undefined functional groups， fungal groups mainly involve Animal Pathogen （12.79%）， Plant Pathogen Wood Saprotroph （13.95%） and Endophyte Epiphyte Plant Pathogen （24.42%）. The fungal species composition of cultivated and wild Eucommia ulmoides was quite different. At the same time， this study also screened several bacterial strains producing IAA. This research will provide valuable microbial resources for the subsequent artificial regulation of E.ulmoides phyllosphere microbiota to enhance plant health， promote plant growth， and develop functional strains.

Key words： plant microbiota; phyllosphere fungi; diversity; ecological functions; indole-3-acetic acid